REPUBLIQUE DU SENEGAL MINISTERE DE...
REPUBLIQUE DU SENEGAL
MINISTERE DE L’ENSEIGNEMENT SUPERWEUR
ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE
SECRETARIAT D’ETAT A LA RECHERCHE
SCIENTIFIQUE ET TECHNIQUE
INSTITUT SENEGALAIS
DE RECHERCHES AGRICOLES
CENTRE NATIONAL DE R:ECHERCHES
I.S.R,A.
AGRONOMIQUES
C.N.R.A.
BAMBEY
Bambey
,
Le développement des cultures de légumineuses d'introduction re-
conte (cas du soja au Sénégal) ou 1'amcZlioration du systeme fixateur d'azote
des légumineuses traditionnelles, necessite souvent l'utilisation d’inocu-
lum bactérien contenant du rhizobium.
Il existe sur les marchés internationaux, divers produits de
qualités variAes, et dont certains donnent satisfaction.
Cependant, en raison des difficultes d$approvisi.annement,
ainsi
que du caractke p6riseabl.e de l'inoculum, i l s ’ e s t r a p i d e m e n t aw6ré préfB-
rable de produire l'inoculum dans le pays utilisateur.
Les f ermenteurs classiquement utilises dans les laboratoires, sont
fort coûteux, et souvent inadaptés aux conditions techniques prgcaires des
pays en voie de développement.
D a n s c e t t e optiqub, le laboratoire de rhizobiolagie de Bambey
(Institut Senégalais de Recherches Agricoles, SQnégal) a dtudié et mis au
point un syst&me eimplifi.6 de fermenteurs, qui, utilisés en série, peuvent
constituer un petit atelier de production 21 l'échelle semi-industrielle.
!
II
il l - CONCEpTION DU FERMENTEUR K
11 - Rappel des principales exigences spécifiques pour la culture
du rhizobium
+ Milieu de culture :
--.---__w----a--_-
Il se caracterise
par sa richesse en gléments nutri-
- ---____ -------__-
tifs ;On préconise, en particulier pour le rhizobium ti croissance lente
le milieu YEM (J.M. VINCENT, 1970, BURTON, 1967) qui se compose de 'K2 HP04
0>5 9>
Mg SO4 - 7H20 0.2 g, NaCl 0,2 g, CaC03 0,1 g. Mannitol 10 g, extrait
de levure (difco) 1 g ou eau de levure 200 ml, eau distillée qsp 1000 ml,
dont le pH est ajustti à 6,8. La source de carbone (Mannitol) peut êtra
remplacé par l'arabinose pour les souches japonicum et lupini (GRAHAM, 1963).
P o u r u n e p r o d u c t i o n ii g r a n d e echelle, il est mBne
preferable d'utiliser
le sucrose(DATE ond 01, 1975).
+ Oxygénation du milieu :
----_-----_---___--_-
Le rhizobium.est une bactérie aérobie, qui néces-
----1-----_-_-_---m-. .-.-
Site une aération COritinue. Une agitation rotative peut convenir dans le
cas d'une quantité réduite de milieu de culture (inferieure 2 1) et si sa
surface de contact du milieu de culture avec l’air ambiant est grands. Par
contre,
pour des volumes plus importants, i l e s t necessaire d'oxygdner l e
milieu par un flux d'air stérilisé. SKINNER (1969), prGconis&
jusqu'8 120
litres d”air Par litre de milieu et Par heure. ROUGHLEY (1970) pense que 5
litras par ïitre Qc milieu et par heure seraient suffisants.
+ Température de culture : La température d'incubation du rhizobium n'est
---_----_-------------
---_----_-_-----------
pas un facteur limitant déterminant. Maintenir cependant la culture à une
température optimale permet de réduire notablement le temps de culture, donc
1;~ risques de contamination . On considére que 25 à 30°C est une tempera-
turc convenant
4 presque toutes les souches de rhizobium. BURTON (1967)
propose des températures de l’ordre de 30 à 32’ particulièrement pour les
souches "Tropicales",
& c r o i s s a n c e l e n t e .
+ Inoculation du milieu et durée de la culture : Une inoculation massive du
---___-----_--c-I_ -_---------------_--------
---___-_-_-_--_--_-__I__________________----
milieu de culture permet d’atteindre rapidement la phase expoaenticlle
de
la multiplication bacterienne
et la concentration maximum de cellules via-
bles. DATE (1975) propose d'utiliser un pied de cuve de O,? à 1 'i: du velums
du milieu de culture à inoculer.
Les souches de rhizobium à croissance rapide atteignent leur
concentration maximum de cellulesviablesen 36-72 heures (temps de généra-
tion 4 heures), et celles ? croissance lente en 108-192 heures (temps de
génération 6-12 heures). Il convient donc d'interrompre la fermentation d?s
que ce niveau maximum est atteint, soit une concentration de l’ordre de 2 à
9
72 - Descriptif d'un module de production d'inoculum (schéma no i et 2)
121 - La cuve dc production est un cylindre étanche, en acier
-----_---------------
inoxydable (paroi : 1,5 mm 6paisseur) dont le fond est constitué d'un pla-
teau du mâme matériau, mais d’épaisseur sup8rieurc (4 21 6 mm), de façon 5
obtenir un fond le pius plat possible. Le couvercle (6 & 6,5 mm épaisseur)
est également plat et rendu solidaire de la cuve par un syst8me de colle -
rette et de vis, l'étanchéité étant assurée par un joint torique.
Les dimensions approximatives de la cuva Dont donn8oe dane le
tableau qui suit :
!
!
!
-1
, Volume utile
,Diam&tre
de la ,Profondeur de 1-1
Volume global !
(1)
; cuve (mm)
; cuue (mm)
!
!
(1)
!
!
!
!
!
-!
!
20
!
280
!
400
!
24,6
!
!
!
!
!
!
!
35
!
340
!
4 5 0
!
40,9
!
!
!
!
!
!
!
5 0
!
360
!
600
!
61,'l
!
!
!
!
!
!
Les dimensicns des cuves sont éteblies an tenant compte des di-
mensions classiques des autoclaves utilisés dans les laboratoires.
Des cuves de volume plus important (jusqu'à 100 1) se sont mon-
trés de manutention très difficile; Si moins d'utiliser des moyens mécani-
ques conséquents.
122 - L'oxygénation du milieu nutritif est r8alisée généralement
------1----1-----------
9s.r agitation pour les volumes de milieu réduit, ou par barbotage d’air pour
des volumes plus importants.
Après plusieurs essais de bullage avec et sans agitation simul-
tanée du milieu, on a remarqué que :
- l'agitation trop forte et une aération excessive, conduisent
3 la formation de mousses abondantes, et augmentent les risques de conta-
mination
m a l g r é l a présenta d e s f i l t r e s d ’ a i r .
- une oxygénation insuffisante et sans agitation du milieu ra-
lentit notablement
la multiplication des rhizobium.
Nous avons donc retenu une oxygénation modéree (1 A 1,5 l/mn/
f ermcntour > dont on augmente l'efficacité par un microbullage obtenu à
‘L’aide d’un verre Ritté II@ pores : 150 à 200
> d o n t l a pa,rtie p o r e u s e
est orientée vers le haut, et placé excentriquement par rapport à l’axe
Los bulles d'air ainsi formées sont entrainees par l'agitation
circulaire moderée ((IOO-150 tours/mn) induite par un barreau magnétique
(Longueur 100 m, # 28 mm). L'air est stérilisg par passage B travers un
filtr;! Whatman (# pores : j?f pores O,>U) que l'on peut QwcntuelLowent dé-
doubler par mesura ds précaution ,tour assurer une parfaite sfërilisation d-l
l'air .
L’a.ir nécassairo e s t f o u r n i p a r u n c o m p r e s s e u r à sec p r é f é r a b l e
au compresseur x'à l~huilt?'~
dont l'air propulstS est facilement pi~ll1.16.
Hais css compresseurs ne sont jamais à l'abri d'une panne Svsn-
tuelle
qui immobilise totalement L’atelier, puisqu'i.l est commun à l'an-
semble des modules de production. Nous awtins dGnc cherché B individialiser
le fonctionnement de chaque fsrmenteur en adjoignant un petit compresseur
à chaque module.
Différents modèles ont été testés, Notr, choix s'ust porté sur
les compresseursà mcmbrano de type "pompe
d'aquarium",
qui d'une part ré-
pondent aux qualités reqUiSùS puur la production d’inocul,Jm, et dlautrL: part
présentent une scuplosse d'utilisatiun incontestable et
un faible prix dv
rovicrlt.
123 - La régulation thermique n'est pas indispensable sila tempé-
-----------------1_-_I_
roture ambiante du fE!rwntcur reste constante et wuisine de 25 à 28OC pwr
i.tis souches dites " tcmpéréas”, et de 30°C pour les souches “tropi.cales”.
A temp6ratura supkrieure, une climatisation cl0 la piàcc: s'impssv.
Par contre, si la température ambiantc est inférieure ÈI 25"C, môme
Lccasiünnellement,il est alors indispansablc de prévoir 12 régulation thar-
miqua du milieu.
Plusieurs syst8mes c!e r0gulation ont Bté testes :
- plonger la cuve dans un bain-marie est un système cwranrmont
utilisé, mais présente comme inconvénients majeurs du rendre difficile
l'agitation magnetique, et de ne pas ctre tr8s commode d'utilisation en
particulisr pour les fermenteurs de gros volume.
- 1 ‘agitateur chauffant muni d'une thermosonde permet Egalement
de réguler 10 milieu de culture, mais la précision n’est ni constsnte ni
fiable ; car ce principe de regulation est très sensible à toute IJariation
de tensicn du r6seau électrique.
Le systeme le plus avantageux semble être la r8sistanco
plongeante
ccmmandée par une thermumùtre à contact. Cas élements sont introduits dans
dtjs gainos p r é v u e s à c e t effet d a n s 10 c o u v e r c l e , ot égal.ement excentréss
par rappcrt à ~%XC du 1cGuw-7rnlc)-
i 2 - ?lISE EN FONCTIONNEMENT D'UN MODULE DE PRODUCTION 0
I
B
2î - Préparation du fermenteur et st6rilisation(Schéma 3)
Apr&s introduction du milieu nutritif dans la cuve (jusqu'a ICI cm
du bord supérieur maximum, on fixe le couvercle A l’aide des ecrous de ver-
?? ?????????
? ?
Le tubo d'entrée d’air est obturé
e n t r e l e c o u v e r c l e e t 10 f i l -
tra, cc: dernier restant ouvert sur L’extérieur ;
La sortie d’air est équipiic d'une fiole, connectée à un filtre.
La sortie d’air est maintenue ouverte de faLon C% permettre l'équilibre de
pression entre le milieu ambiant et l’intérieur de la cuve ;
La sonde (de prél+voment est obturée,
ainsi que le tube d'inocu-
lation.
L'ensemble est introduit eans l'autoclave, et stérilisé h la
chaleur humide a 12U"C.
Il est conseillé de proct>der systématiquement 4
dwx autoclavagos e s p a c e s d ' u n e @riode d e r e f r o i d i s s e m e n t do 6 à 0 hsuros.
La durée de chaque autoclavage est fonction du volume du milieu
nutritif.
2 x 1 heure pour des volumes de 20 litres
2 x 1 heure 30 pour des volumes de 20 à 40 litres
2 x 2 heures pour des volumes de 50 litres.
Après stérilisation on laisse refroidir le fsrmenteur.
22 - Inoculation du milieu de culture (Schéma 4)
Lo fermenteur est place devant la hotte ii flux laminaire, de
façon à pouvoir introduire l'extrémité de la sondo d'inoculation dans l'en-
ceinte stérile.
Le pied de cuve est également placé dans cette enceinte stérile.
Il est recommandé toutefois, pour faciliter les manipulations de prévoir
un tube d'inoculation et une sortie latérale souple du pied de cuve suffi-
samment long, de façori à permettre leur jonction devant un bec BUNSEN sans
avoir à manipuler le pied de cuve, n i à i n t e r v e n i r directumant s u r le fer-
menteur . Une personne seule, peut dans ce cas effectuer l'inoculation du
milieu de culture.
Opération 1 :
-.w--------..
Stériliser à la flamme les extrêmités du tubs d'inoculation du
fermenteur et de la sortis latérale du pied de cuve. DÉgager les orifices
(4) e t (6) e t tzffecturrL'inoculation du milieu de culture.
Opération 2 :
-m.------I--
Supprimer les pinces d'obturation
(2) et (7).
Opération 3 :
---m.-------
Transvaser Id pidd da cuvu Ln PlaGant 12 contenant 50 cm au-dr;ssus
du fcrmenteur.
i'inoculurn s'ecoul~rs progrussiwsmant
clans 1~ fcrmzntcur.
Operation 5 :
- - - - - - - - - - -
L e t r a n s f e r t tormin6, o n replace la pince (2) et on deconnccto 10
pied de cuva. L’embout place en a v a l de l a p i n c e ( 2 ) est r i n c e h l”alCoo1.
Opération 5 :
---.“---v.-e.-
Introduira stérilement Le liquide aseptisant (chlorure mcrcuriqut:
1 .?+,o ou eau de hd). E n l e v e r l e f i l t r e d ’ a i r .
2 3 - L - i p r o d u c t i o n d'inoculum
231 - Misu on routti
------------^
Lk: frJrmbntcxtr ainsi préparé, e s t p o s e s u r l’agitateur magnétiquu
qui t:st aussitet mis i3fl action ;lë c@Flprusseijr #t cocflocté Sur l'entrés d’air
rt 7i.s en marche. Ouvrir J.e circuit d’aeratinn cr! debridant la pince (1).
En cas de nBcessit4 do tharmo-regulation, o n inserre l a résistants
et le thosmomètsa
à contact dans les gainos plongeantes prevue5
sur le couvercle du fermenteur, puis on ajuste la tempesatura souhaitée.
La tmise sn température du milisu doit i>tri+ progressive.
232 - Prélhvument d'un Bchsntillon de milieu de culture
--------------------_-I-------------^-------------------.-
11 suffit ds desserrer la pince (3), e t obtur,:r quclquC,s s o c o n d o s
la sortit< d’air. Lo milieu do cultur2 s'écouls dans l'ampoule dt; recupers-
tion ;
fermer
,?nsuitc l a pince ( 3 ) u,t o u v r i r (5), l e m i l i e u s ' é c o u l e . Il
>st
:_, preférablz, aprts ct:ttc operation, da rincar l'ampoule avec du l'alcool
ii 900,
en l'injectant par li! tube d1f2coulement & l'aide d'uns pissette.
233 - Vidange du f ermenteur
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
Tout dn laissant le systèmt, L!n fonctionnement (aération, agita-
tion),
cn procède à La, vidange du contenu de la cuve par la sonde de pré-
Lèwcmcnt,
en opQrant de la même façon qut, pour la prisa d'échantillon ; il
cnnuiant r;opandant di: coupcr préslablcmcnt le systèms do régulation thermi-
que.
Si l'on sotihaite
aussit6t utiliser la culture liquide (préparaticn
d'inoculum tourbe par axomple), il suffit de connecter une épsoutistte jaugec
stésilw sur le tuyau d'évacuation, et d'effectuer le transfart du ferrwn-
t!Jur dans l’éprouvette comme indiqué precédemment, et de cette ddrnibre
* ,
24 - Ca acite de production d'un module
Si l'on considére que 1~ modulz
est
mis en fonctionnemunt
F;ond-nt 5 rois
~ons&cutifs (viabilité de lfinoculum SUI support tourbu dc-
6 mois :i 1 û n > , zt % raison de trois productions p.~r mois, on puut 6valu~r
1.3 production dt! culture iiquid..: à :
- 300 litres pour un volui& dc milieu par fermentetir dz 20 litrds
- 525 litres
II
If
II
35 litr,s
750 litras
11
-
II
1,
50 litres.
8 PMTERTEL NECESSAIRE AU MONTAGE D~IJN MODULE CE PRODUCTION D" INOCULUM
3--I
r?
31 - Cuve de production
Les aimensions appraximativos de la cuve selon le volume retenu,
sont mentionnées dans le paragraphe (221). La schbma R" 2
, prGcise h titre
d'exemple,
les carac>teri.stiques
détaillées d'une cuve de 50 litres.
32 - Aqitation
Elle est obtenua par un agitateur magnétique classique j la
puissance niniwm requiss du moteur est de l’ordre do 100 31 pour agiter un
volume de 20 à 30 l i t r e s d e milieu, et de 150 UI pour un voiume de 50 litres.
Ce type d'appareil se trouve facilement dans 1,: commarce (ex. magn8tique
? x 9 ou tharmolyne, chez Rioblock)
; on peut t-Sgal.emont adapter soi-m$mti
un aimant sur un moteur d'aqitation classique (cx : agitation-moteur à
rSgulation mécanique de l
a
vitosso)f c e systhme a l ’ a v a n t a g e d ’ ê t r e m o i n s
onereux.
il est consceill.8 d'utiliser des barreaux aimantés de grande taille
(2 : barreau geant 108 x 26 mm) qui provoquent une agitation érvergfqug à
vit;:sse ds r o t a t i o n reduite.
33 - Thermo-réqulation
Il n'ast pas nécessaire d’utiliser des résistancus chauffantes
cie fort:3 pUiSsanci2 ; dr!s r é s i s t a n c e s d e 3 0 0 111 p o u r 1~s fermentours d e 20 1,
,_t 500 !LI pour 1~s 35 ot 50 l i t r e s s o n t s u f f i s a n t e s (ex : Tharmo-plonqcur
calorifuqé dn silice pur).
C e t t e r é s i s t a n c t:! est relitje à un thcrmomQtrV! CI contact (à doubio
échelle 0' h 6O'C) et commandée par un relai éloctroniqui.
34 - Circuit d’asration
ot de prelevement
Outrcl 13s f i l t r e s de steril.isation d ’ a i r (urhatman $ p o r e s 0,3 )
et 1.3 compresseur à S>C (typa pompe d'aquarium) il. est nQcassairu de prguoi1;
Jn c;nsombl&z da petit matoridl destine aux differents circuits :
- orlonmeyor B s o r t i e l a t é r a l e dr 500 m l (barbotags du sortit!
d ’ a i r ) ;
- pinces à lames parallèles ;
- 2 tés en inox de 4 mm de $ ;
- 3 embouts do tuyau inox de 4 mm de $ ut de 100 mm d,:? long ;
- 1 assortiment de bouchon caoutchouc autoclavablz ;
- tuyau silicone Fhodosil de 6 mm, 6 mm et de F3 mm de I?I ;
- 2 tubes de barootagc: on verre fritte, de porosite 15O à 2OO;U..
RIBLIOGHAPHIE
..=-= -=-=-z'-=-
i3URTON, J . C . - 19670
In microbial tschnoloyy
H. J . P2ppler,
Ed. Rcînhord, N~UI York pp. l- 33
UATE (S.A.) ct I!OLlLHLEV (i?.J.) - 1975.
Prcparstion of inoculum seod inoculants
4 Traûtist on ?initio.g;IrI yixation solsction
1 Il
Agronomy Ecology, eds RWF Hardy and Gibson.
GRAHAM (P.H.)
and PARKE:R (C.A.) - 1964.
Plant and suil, 20, p. 383.
VTfUCENT (J.N.) - 1370.
Manual for thr! practical study of root rwdulu bacteria - HandbLck
n" 15, Blsckuftzll Sci . publication London.
.---.“l.--r
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MINISTERE DE L’ENSEIGNEMENT SUPERWEUR
ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE
SECRETARIAT D’ETAT A LA RECHERCHE
SCIENTIFIQUE ET TECHNIQUE
INSTITUT SENEGALAIS
DE RECHERCHES AGRICOLES
CENTRE NATIONAL DE R:ECHERCHES
I.S.R,A.
AGRONOMIQUES
C.N.R.A.
BAMBEY
Bambey
,
Le développement des cultures de légumineuses d'introduction re-
conte (cas du soja au Sénégal) ou 1'amcZlioration du systeme fixateur d'azote
des légumineuses traditionnelles, necessite souvent l'utilisation d’inocu-
lum bactérien contenant du rhizobium.
Il existe sur les marchés internationaux, divers produits de
qualités variAes, et dont certains donnent satisfaction.
Cependant, en raison des difficultes d$approvisi.annement,
ainsi
que du caractke p6riseabl.e de l'inoculum, i l s ’ e s t r a p i d e m e n t aw6ré préfB-
rable de produire l'inoculum dans le pays utilisateur.
Les f ermenteurs classiquement utilises dans les laboratoires, sont
fort coûteux, et souvent inadaptés aux conditions techniques prgcaires des
pays en voie de développement.
D a n s c e t t e optiqub, le laboratoire de rhizobiolagie de Bambey
(Institut Senégalais de Recherches Agricoles, SQnégal) a dtudié et mis au
point un syst&me eimplifi.6 de fermenteurs, qui, utilisés en série, peuvent
constituer un petit atelier de production 21 l'échelle semi-industrielle.
!
II
il l - CONCEpTION DU FERMENTEUR K
11 - Rappel des principales exigences spécifiques pour la culture
du rhizobium
+ Milieu de culture :
--.---__w----a--_-
Il se caracterise
par sa richesse en gléments nutri-
- ---____ -------__-
tifs ;On préconise, en particulier pour le rhizobium ti croissance lente
le milieu YEM (J.M. VINCENT, 1970, BURTON, 1967) qui se compose de 'K2 HP04
0>5 9>
Mg SO4 - 7H20 0.2 g, NaCl 0,2 g, CaC03 0,1 g. Mannitol 10 g, extrait
de levure (difco) 1 g ou eau de levure 200 ml, eau distillée qsp 1000 ml,
dont le pH est ajustti à 6,8. La source de carbone (Mannitol) peut êtra
remplacé par l'arabinose pour les souches japonicum et lupini (GRAHAM, 1963).
P o u r u n e p r o d u c t i o n ii g r a n d e echelle, il est mBne
preferable d'utiliser
le sucrose(DATE ond 01, 1975).
+ Oxygénation du milieu :
----_-----_---___--_-
Le rhizobium.est une bactérie aérobie, qui néces-
----1-----_-_-_---m-. .-.-
Site une aération COritinue. Une agitation rotative peut convenir dans le
cas d'une quantité réduite de milieu de culture (inferieure 2 1) et si sa
surface de contact du milieu de culture avec l’air ambiant est grands. Par
contre,
pour des volumes plus importants, i l e s t necessaire d'oxygdner l e
milieu par un flux d'air stérilisé. SKINNER (1969), prGconis&
jusqu'8 120
litres d”air Par litre de milieu et Par heure. ROUGHLEY (1970) pense que 5
litras par ïitre Qc milieu et par heure seraient suffisants.
+ Température de culture : La température d'incubation du rhizobium n'est
---_----_-------------
---_----_-_-----------
pas un facteur limitant déterminant. Maintenir cependant la culture à une
température optimale permet de réduire notablement le temps de culture, donc
1;~ risques de contamination . On considére que 25 à 30°C est une tempera-
turc convenant
4 presque toutes les souches de rhizobium. BURTON (1967)
propose des températures de l’ordre de 30 à 32’ particulièrement pour les
souches "Tropicales",
& c r o i s s a n c e l e n t e .
+ Inoculation du milieu et durée de la culture : Une inoculation massive du
---___-----_--c-I_ -_---------------_--------
---___-_-_-_--_--_-__I__________________----
milieu de culture permet d’atteindre rapidement la phase expoaenticlle
de
la multiplication bacterienne
et la concentration maximum de cellules via-
bles. DATE (1975) propose d'utiliser un pied de cuve de O,? à 1 'i: du velums
du milieu de culture à inoculer.
Les souches de rhizobium à croissance rapide atteignent leur
concentration maximum de cellulesviablesen 36-72 heures (temps de généra-
tion 4 heures), et celles ? croissance lente en 108-192 heures (temps de
génération 6-12 heures). Il convient donc d'interrompre la fermentation d?s
que ce niveau maximum est atteint, soit une concentration de l’ordre de 2 à
9
72 - Descriptif d'un module de production d'inoculum (schéma no i et 2)
121 - La cuve dc production est un cylindre étanche, en acier
-----_---------------
inoxydable (paroi : 1,5 mm 6paisseur) dont le fond est constitué d'un pla-
teau du mâme matériau, mais d’épaisseur sup8rieurc (4 21 6 mm), de façon 5
obtenir un fond le pius plat possible. Le couvercle (6 & 6,5 mm épaisseur)
est également plat et rendu solidaire de la cuve par un syst8me de colle -
rette et de vis, l'étanchéité étant assurée par un joint torique.
Les dimensions approximatives de la cuva Dont donn8oe dane le
tableau qui suit :
!
!
!
-1
, Volume utile
,Diam&tre
de la ,Profondeur de 1-1
Volume global !
(1)
; cuve (mm)
; cuue (mm)
!
!
(1)
!
!
!
!
!
-!
!
20
!
280
!
400
!
24,6
!
!
!
!
!
!
!
35
!
340
!
4 5 0
!
40,9
!
!
!
!
!
!
!
5 0
!
360
!
600
!
61,'l
!
!
!
!
!
!
Les dimensicns des cuves sont éteblies an tenant compte des di-
mensions classiques des autoclaves utilisés dans les laboratoires.
Des cuves de volume plus important (jusqu'à 100 1) se sont mon-
trés de manutention très difficile; Si moins d'utiliser des moyens mécani-
ques conséquents.
122 - L'oxygénation du milieu nutritif est r8alisée généralement
------1----1-----------
9s.r agitation pour les volumes de milieu réduit, ou par barbotage d’air pour
des volumes plus importants.
Après plusieurs essais de bullage avec et sans agitation simul-
tanée du milieu, on a remarqué que :
- l'agitation trop forte et une aération excessive, conduisent
3 la formation de mousses abondantes, et augmentent les risques de conta-
mination
m a l g r é l a présenta d e s f i l t r e s d ’ a i r .
- une oxygénation insuffisante et sans agitation du milieu ra-
lentit notablement
la multiplication des rhizobium.
Nous avons donc retenu une oxygénation modéree (1 A 1,5 l/mn/
f ermcntour > dont on augmente l'efficacité par un microbullage obtenu à
‘L’aide d’un verre Ritté II@ pores : 150 à 200
> d o n t l a pa,rtie p o r e u s e
est orientée vers le haut, et placé excentriquement par rapport à l’axe
Los bulles d'air ainsi formées sont entrainees par l'agitation
circulaire moderée ((IOO-150 tours/mn) induite par un barreau magnétique
(Longueur 100 m, # 28 mm). L'air est stérilisg par passage B travers un
filtr;! Whatman (# pores : j?f pores O,>U) que l'on peut QwcntuelLowent dé-
doubler par mesura ds précaution ,tour assurer une parfaite sfërilisation d-l
l'air .
L’a.ir nécassairo e s t f o u r n i p a r u n c o m p r e s s e u r à sec p r é f é r a b l e
au compresseur x'à l~huilt?'~
dont l'air propulstS est facilement pi~ll1.16.
Hais css compresseurs ne sont jamais à l'abri d'une panne Svsn-
tuelle
qui immobilise totalement L’atelier, puisqu'i.l est commun à l'an-
semble des modules de production. Nous awtins dGnc cherché B individialiser
le fonctionnement de chaque fsrmenteur en adjoignant un petit compresseur
à chaque module.
Différents modèles ont été testés, Notr, choix s'ust porté sur
les compresseursà mcmbrano de type "pompe
d'aquarium",
qui d'une part ré-
pondent aux qualités reqUiSùS puur la production d’inocul,Jm, et dlautrL: part
présentent une scuplosse d'utilisatiun incontestable et
un faible prix dv
rovicrlt.
123 - La régulation thermique n'est pas indispensable sila tempé-
-----------------1_-_I_
roture ambiante du fE!rwntcur reste constante et wuisine de 25 à 28OC pwr
i.tis souches dites " tcmpéréas”, et de 30°C pour les souches “tropi.cales”.
A temp6ratura supkrieure, une climatisation cl0 la piàcc: s'impssv.
Par contre, si la température ambiantc est inférieure ÈI 25"C, môme
Lccasiünnellement,il est alors indispansablc de prévoir 12 régulation thar-
miqua du milieu.
Plusieurs syst8mes c!e r0gulation ont Bté testes :
- plonger la cuve dans un bain-marie est un système cwranrmont
utilisé, mais présente comme inconvénients majeurs du rendre difficile
l'agitation magnetique, et de ne pas ctre tr8s commode d'utilisation en
particulisr pour les fermenteurs de gros volume.
- 1 ‘agitateur chauffant muni d'une thermosonde permet Egalement
de réguler 10 milieu de culture, mais la précision n’est ni constsnte ni
fiable ; car ce principe de regulation est très sensible à toute IJariation
de tensicn du r6seau électrique.
Le systeme le plus avantageux semble être la r8sistanco
plongeante
ccmmandée par une thermumùtre à contact. Cas élements sont introduits dans
dtjs gainos p r é v u e s à c e t effet d a n s 10 c o u v e r c l e , ot égal.ement excentréss
par rappcrt à ~%XC du 1cGuw-7rnlc)-
i 2 - ?lISE EN FONCTIONNEMENT D'UN MODULE DE PRODUCTION 0
I
B
2î - Préparation du fermenteur et st6rilisation(Schéma 3)
Apr&s introduction du milieu nutritif dans la cuve (jusqu'a ICI cm
du bord supérieur maximum, on fixe le couvercle A l’aide des ecrous de ver-
?? ?????????
? ?
Le tubo d'entrée d’air est obturé
e n t r e l e c o u v e r c l e e t 10 f i l -
tra, cc: dernier restant ouvert sur L’extérieur ;
La sortie d’air est équipiic d'une fiole, connectée à un filtre.
La sortie d’air est maintenue ouverte de faLon C% permettre l'équilibre de
pression entre le milieu ambiant et l’intérieur de la cuve ;
La sonde (de prél+voment est obturée,
ainsi que le tube d'inocu-
lation.
L'ensemble est introduit eans l'autoclave, et stérilisé h la
chaleur humide a 12U"C.
Il est conseillé de proct>der systématiquement 4
dwx autoclavagos e s p a c e s d ' u n e @riode d e r e f r o i d i s s e m e n t do 6 à 0 hsuros.
La durée de chaque autoclavage est fonction du volume du milieu
nutritif.
2 x 1 heure pour des volumes de 20 litres
2 x 1 heure 30 pour des volumes de 20 à 40 litres
2 x 2 heures pour des volumes de 50 litres.
Après stérilisation on laisse refroidir le fsrmenteur.
22 - Inoculation du milieu de culture (Schéma 4)
Lo fermenteur est place devant la hotte ii flux laminaire, de
façon à pouvoir introduire l'extrémité de la sondo d'inoculation dans l'en-
ceinte stérile.
Le pied de cuve est également placé dans cette enceinte stérile.
Il est recommandé toutefois, pour faciliter les manipulations de prévoir
un tube d'inoculation et une sortie latérale souple du pied de cuve suffi-
samment long, de façori à permettre leur jonction devant un bec BUNSEN sans
avoir à manipuler le pied de cuve, n i à i n t e r v e n i r directumant s u r le fer-
menteur . Une personne seule, peut dans ce cas effectuer l'inoculation du
milieu de culture.
Opération 1 :
-.w--------..
Stériliser à la flamme les extrêmités du tubs d'inoculation du
fermenteur et de la sortis latérale du pied de cuve. DÉgager les orifices
(4) e t (6) e t tzffecturrL'inoculation du milieu de culture.
Opération 2 :
-m.------I--
Supprimer les pinces d'obturation
(2) et (7).
Opération 3 :
---m.-------
Transvaser Id pidd da cuvu Ln PlaGant 12 contenant 50 cm au-dr;ssus
du fcrmenteur.
i'inoculurn s'ecoul~rs progrussiwsmant
clans 1~ fcrmzntcur.
Operation 5 :
- - - - - - - - - - -
L e t r a n s f e r t tormin6, o n replace la pince (2) et on deconnccto 10
pied de cuva. L’embout place en a v a l de l a p i n c e ( 2 ) est r i n c e h l”alCoo1.
Opération 5 :
---.“---v.-e.-
Introduira stérilement Le liquide aseptisant (chlorure mcrcuriqut:
1 .?+,o ou eau de hd). E n l e v e r l e f i l t r e d ’ a i r .
2 3 - L - i p r o d u c t i o n d'inoculum
231 - Misu on routti
------------^
Lk: frJrmbntcxtr ainsi préparé, e s t p o s e s u r l’agitateur magnétiquu
qui t:st aussitet mis i3fl action ;lë c@Flprusseijr #t cocflocté Sur l'entrés d’air
rt 7i.s en marche. Ouvrir J.e circuit d’aeratinn cr! debridant la pince (1).
En cas de nBcessit4 do tharmo-regulation, o n inserre l a résistants
et le thosmomètsa
à contact dans les gainos plongeantes prevue5
sur le couvercle du fermenteur, puis on ajuste la tempesatura souhaitée.
La tmise sn température du milisu doit i>tri+ progressive.
232 - Prélhvument d'un Bchsntillon de milieu de culture
--------------------_-I-------------^-------------------.-
11 suffit ds desserrer la pince (3), e t obtur,:r quclquC,s s o c o n d o s
la sortit< d’air. Lo milieu do cultur2 s'écouls dans l'ampoule dt; recupers-
tion ;
fermer
,?nsuitc l a pince ( 3 ) u,t o u v r i r (5), l e m i l i e u s ' é c o u l e . Il
>st
:_, preférablz, aprts ct:ttc operation, da rincar l'ampoule avec du l'alcool
ii 900,
en l'injectant par li! tube d1f2coulement & l'aide d'uns pissette.
233 - Vidange du f ermenteur
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
Tout dn laissant le systèmt, L!n fonctionnement (aération, agita-
tion),
cn procède à La, vidange du contenu de la cuve par la sonde de pré-
Lèwcmcnt,
en opQrant de la même façon qut, pour la prisa d'échantillon ; il
cnnuiant r;opandant di: coupcr préslablcmcnt le systèms do régulation thermi-
que.
Si l'on sotihaite
aussit6t utiliser la culture liquide (préparaticn
d'inoculum tourbe par axomple), il suffit de connecter une épsoutistte jaugec
stésilw sur le tuyau d'évacuation, et d'effectuer le transfart du ferrwn-
t!Jur dans l’éprouvette comme indiqué precédemment, et de cette ddrnibre
* ,
24 - Ca acite de production d'un module
Si l'on considére que 1~ modulz
est
mis en fonctionnemunt
F;ond-nt 5 rois
~ons&cutifs (viabilité de lfinoculum SUI support tourbu dc-
6 mois :i 1 û n > , zt % raison de trois productions p.~r mois, on puut 6valu~r
1.3 production dt! culture iiquid..: à :
- 300 litres pour un volui& dc milieu par fermentetir dz 20 litrds
- 525 litres
II
If
II
35 litr,s
750 litras
11
-
II
1,
50 litres.
8 PMTERTEL NECESSAIRE AU MONTAGE D~IJN MODULE CE PRODUCTION D" INOCULUM
3--I
r?
31 - Cuve de production
Les aimensions appraximativos de la cuve selon le volume retenu,
sont mentionnées dans le paragraphe (221). La schbma R" 2
, prGcise h titre
d'exemple,
les carac>teri.stiques
détaillées d'une cuve de 50 litres.
32 - Aqitation
Elle est obtenua par un agitateur magnétique classique j la
puissance niniwm requiss du moteur est de l’ordre do 100 31 pour agiter un
volume de 20 à 30 l i t r e s d e milieu, et de 150 UI pour un voiume de 50 litres.
Ce type d'appareil se trouve facilement dans 1,: commarce (ex. magn8tique
? x 9 ou tharmolyne, chez Rioblock)
; on peut t-Sgal.emont adapter soi-m$mti
un aimant sur un moteur d'aqitation classique (cx : agitation-moteur à
rSgulation mécanique de l
a
vitosso)f c e systhme a l ’ a v a n t a g e d ’ ê t r e m o i n s
onereux.
il est consceill.8 d'utiliser des barreaux aimantés de grande taille
(2 : barreau geant 108 x 26 mm) qui provoquent une agitation érvergfqug à
vit;:sse ds r o t a t i o n reduite.
33 - Thermo-réqulation
Il n'ast pas nécessaire d’utiliser des résistancus chauffantes
cie fort:3 pUiSsanci2 ; dr!s r é s i s t a n c e s d e 3 0 0 111 p o u r 1~s fermentours d e 20 1,
,_t 500 !LI pour 1~s 35 ot 50 l i t r e s s o n t s u f f i s a n t e s (ex : Tharmo-plonqcur
calorifuqé dn silice pur).
C e t t e r é s i s t a n c t:! est relitje à un thcrmomQtrV! CI contact (à doubio
échelle 0' h 6O'C) et commandée par un relai éloctroniqui.
34 - Circuit d’asration
ot de prelevement
Outrcl 13s f i l t r e s de steril.isation d ’ a i r (urhatman $ p o r e s 0,3 )
et 1.3 compresseur à S>C (typa pompe d'aquarium) il. est nQcassairu de prguoi1;
Jn c;nsombl&z da petit matoridl destine aux differents circuits :
- orlonmeyor B s o r t i e l a t é r a l e dr 500 m l (barbotags du sortit!
d ’ a i r ) ;
- pinces à lames parallèles ;
- 2 tés en inox de 4 mm de $ ;
- 3 embouts do tuyau inox de 4 mm de $ ut de 100 mm d,:? long ;
- 1 assortiment de bouchon caoutchouc autoclavablz ;
- tuyau silicone Fhodosil de 6 mm, 6 mm et de F3 mm de I?I ;
- 2 tubes de barootagc: on verre fritte, de porosite 15O à 2OO;U..
RIBLIOGHAPHIE
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