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DOSAGE
FLUORIM ?TRIQ!JE
E S S A I D E REVUE D E S
. .
MOL)ALITES ¡® T E C H N I Q U E S .
Jean PAGES
I N T R O D U C T I O N
La biomasse du phytoplancton est souvent d&ermin¨¦e par le biais de
ses pigments chlorophylliens. La mesure de la concentration de ces pigments
est d¨¦,j$ un proc¨¦d6 fort ancien, mais une rapide revue de la litt¨¦rature
fait cependant appara'itre que, malgrk divers essais de normalisation (SCOR-
-TJ~~SQ) 1966 ), les madalit& techniques sont loin d%tre uniformes.
.&us avons tent¨¦ de rasscsnbler ici un certain ncmbre de d¨¦tails tech-
niques cit¨¦s par divers auteurs, afin dPobtenir une vue g&-&rale. Ceci ne
saurait ^etre une revue exhaustive, et encore moins critique, venant &pr¨¨;s
les travEtux publi¨¦s dans les "Ergebnisse der Limnologie" (Beiheft 14,, 1980).
Il s'agit plut& d'un essai de mise au point, 3 usage interne, ax¨¦ sur les
dkails mat¨¦riels et prenant en compte quelques techniques r¨¦centes.
En outre, l'accent a ¨¦t¨¦ mis, volontairement, sur le dosage par fluo-
rim ?trie, plus adapt¨¦ aux conditions de la haute mer et plus rapide ; la
spectrophotan%rie a ¨¦t¨¦ assez n&$&e.
1 .
F 1 LT R AT 10 N "
'
1.7. CEOIX DES FILTRES
Les membranes filtrantes permettent,, du moins en th¨¦orie. de s¨¦parer
des tailles diff¨¦rentes dgorganimes (Faust et Correl, 1976 : Venrick et 81,:
19?7?. En fait, le choix de la marque est assez capital ; les membrane7
Nuclepore semblent peulwfournir des perforations r¨¦ellanent calibr6es
(Sheldon, 1972), La plupart'des membranes, ~epend&t~~'coimat ?nt ass¨¦k'vite
et peuvent, par leur dissolution ult&ieure,apporter des substances parasites.
Les filtres en fibre de verre ont des caract¨¦ristiques de filtration
.@us satisfaisantes (Lenz et Fritsche, 1980). Leurs fibres sm¨¦liorent la
2
destruction des cellules dans le cas o¨´& filtre est broy¨¦ dans le SO~&?+I~.
Leur gorosit est assez bien contr%l¨¦e (Holm Hansen et Riemann, 1978 ; MSX?.CT
et Ed.,, 1980). Il semble cependant que lcsk'ilhesGelmah type A soient inf¨¦-
rieurs aux filtres Whatman GF/C (Herbland, comm. pers.),,
"..,
1.2. MODALTTF DE 'L&FILTRATION "
La d¨¦pression, lors de la filtration, ne doit, pas d¨¦passer l/lOc d'at-
,mosph&e (As&nson, 1978 ; Ekmxp;.~978).
L9addition d'une suspension de %$!~
R. i-t¨¦ recommand& (Strickland et
Parsons, 1968) 1 LPutilit¨¦, ou m;bme les bienfaits, d'une tzlle proc¨¦dure, SO?:*
assez discut& pourtant (Holm Hansen et Riemann, 13'78 r, Marker et al,, 1980 b),
1.3. I~~OTJSEXVATIOI\\J DES FILTRES
Certains auteurs signalent une 'baisse sensible de la teneur en chlora-
phylle, tant dans les extraits que swhs filtres (Blasco, 19731, m¨ºme si
ceux-ci sont lyophilis& (Lenz et Fritsche, l@O),, Inversement, d'autres
essais n'ont pu mettre en 6vidence de perte.9 sur des filtres congel¨¦s enco-
re humides et conserv& 3 -20% (Hol¨¤ Hanscin ct Riemann, 1980). Des filtres
ont St6 conserv¨¦s de fa ?on satisfaisante (moins de 20 ? de pertes) ¨¤ -15*C,
sur gel de silice, pendant 10 mois (Dufour, 1972).
2'.
EXTRACTIOI'J
,<
,'.
Plusieurs 3aivae3 ont ¨¦t¨¦ employks pour extraire les pigments. L7 a&-
tone est le plus¡®fr&quemment utili&e, mais d7autres solvants ont &¨¦ reca-
mand¨¦s.
.
.
2.1,. ACETONF
Le ti¨¦lange le plus fr6quen-t est lvacCtone SS 10 $ dPeau ("ac¨¦tone'90 "").
Certains auteurs emploient des m¨¦langes & 85 ou 80 %, Baudouin et Seoppa
(1971) utilisent lrac6tone 85 $ satur6e de MG?O~.
Afin d'am¨¦liorer lgefficacit¨¦ de l"extraction, Stauffer et RI. (1'379)
pr&onisent un m¨¦lange ac¨¦tone-DMSO (a:a) (1). Le broyage desx&es a 6%:
recommande (Strickland et Parsons, l968) mais somh:Le d'une efficacitg dis-
cutable (Holm Hansen et Riemann, 1978) et pc& m$me augmenter la variabili-
t¨¦ @ufow, 1972).
Un des principaux d&avs,nts.ges de l'ac&one est sa faible efficacits
d'extractipn sur de nombreuses formes Planctonique:%.
('1) f;e DM50 fltiorcsce fortement avec &?x, = 405, ,\\hi z 525 m
.
3
2.2. METHAWL
Plusieurs auteurs recommandent, comme plus efficace, le m~thanol, soit
bouillant p&dant 30 s (?&aney, 1978 ; Stauffer et al., 1979 : Biemann,
1980), soit plus simplement b froid (Berland et -1970 : Hol¨¤ Hansen et'
iGaa.nn, 1978 ; Masker et al,, 1980 a et b), %?%oyage du filtre est alors
inutile.
Le comportement des pipents dans le m¨¦thanol acidifi¨¦ peut prhmter
quelques'probl¨¨saes (Marker et al., 1980 a ; Uusch, 1980). Les vapeurs de
m-thanol sont assez taxiquo*soh, 1980).
L'¨¦thanol bouillant est aploy6 par quelques auteurs (Moed et Hallgracff.
1978 a' '&rker et af., 1980 a ; Musch, 7980). Le bon ccmportemsnt lors de
1'ncidificati.o~ int¨¦ressant, Le prix S%uit est un arment suppl&ncn-
taire.
3.
ACIDIFICATIOI~'
Pour transformer les chlorophylles en phEopi@xents, divers Ments peu-
vent ijtre employ¨¦s. La chaleur ( 100¡ãC) a ¨¦t¨¦ mployee (Vhitc et rd. ,, ? 972).
Plus fr¨¦quent 3 car plus simple, est l¡¯emploi de lzacidificatiGsr UE
acide min¨¦ral fort ou un acide organique,
3.1. MODALITES
3.1.1. HC1
La proc¨¦dure la plus fr¨¦quente consiste ~3 !additionner un volume faible
de HC1 dilu¨¦ ? ? l*¨¦chantillon. Les conditions op6%atoires sont souvent d&ri-
tes avec une surprenante impr¨¦cision, tant sur le volume ("quelques gouttes")
que sur la concentration("dilu¨¦<', 'de 0,5 ¨¤ '1 #'), Hol¨¤ Ransen et Rianann
(1978) reecmmandent une concentration finale de 3,10'3M BCI, ,s..gissar.tt 3min.
Le pR intervient fortement 9 ¨¤ la fois sur les spectres-des diff&ents pig-
aents et sur la vitesse de transformation'des chlorophylles :, la ch1 b se
transforme en ph6o b 5 a 9 fois plus lentement que la ch1 a en ph¨¦o R-
f Holm Hansen et Flie ?Gann, 1978). Moed et Hallegraeff (1978)~indiquent-un
pH souhaitable de 2 $6 ¨¤ 2,s. Pour un &ne volume d ¡®HCl, le pouvoir tampon
des difffrents solvants d&r&t dans le sens ¨¦thanol-n¨¦thanol-ac&one ;
80 %-ac¨¦tone 90 fi.
P~I.w des dosages ult¨¦rieurs en spectrm&rie, l¡¯extrait sera neutreSi-
s¨¦ ~HO$JI Haisen et Riunann, 1978 ; Mctrker et al., 198o.b).
:-
3.j.2, Acide oxafique
Afin de limiter les risques dgacidification excessive,certains auteurs
pr¨¦conisent L¡¯emploi de l¡¯ac¨¦tone satur¨¦e d$acide oxalique, 3 raison de 2
2 5 % de'l'&hantillon (Baudouin et Scoppa,l97l).La r6actionest beaucoup plus
lente (HO&~ Hansen .et al. 5 1965) ; il est possible que ce soit une raison
du peu de succ¨¨s demthode,
4
3.2. FACTEUR ACIDE ("'ACID FACTOR"', ACID RATIO"')
Dam le cas a< la spectrophotcm%tric, la majori& des auteurs conside-
rent que le facteur .acide5 rapports des absorptions avant et apr¨¨s acidifie.
cation, a une valeur constante de 137 pour 1% c!i~, a ~OIXXZV& a 6.65 rrm.
_I
Le rapport des fluorescences avant et aprC:o Gcidification (F,/Fa) varie
en fonction de nombreux facteurs :
- Modalit¨¦ de l'acidification (voir plus hmt) 4, 'le temps joue un, @-
le pr6pondbrant dcms le cas des acides faibles ;
- Pourcent~c,3 dscau dans lsacbtone (Neveu.x,, 1376) ; cet, effet est pro-
bablement Ii6 au pH (Moed et Hallegraeff, i%?7). 5~ facteur acide diminue
quand le pourcentage d'eau augmente :
- Longueur d"onde de lgexcitation, ii largeur de bande constant (Saijo
et Nishizawa, 1969) ;
- Largeur de bende de la lumi¨¨re dlekzitation (Baudouin et Scoppa;l971):
- Rature des filtres secondaires et du pf-loto~multiplicateur (Neveux,
1976).
L'interaction de ces diff&ents facteurs explique les chiffres extr¨ºme-
ment variables apparaissant dans les publications D puisque les conditions
expkimentales sont pour le moins variables, ct pqrfo:is non contr ?lables.
Le facteur acide diff¨¨re, de plus, suivant le pigment consid& ?j. Les valcurr~
varient ainsi entre G,g et plus de 11, suivant les conditions (tabl. 1).
I
4...
M E S U R E S
P A R
P L U D R I: Y E T R f E
4.1, CARACTERISTL~ES OPTIQJJES DES PIGMENTS
Les logeurs d*onde d'absorption (excitntion) et d'¨¦mission maximum
sont variables selon les pigments consid&&, Airk, Baurio?~in et Stoppa
(1971) rcl&ent un spectre de diffkence entre chl 2 et ph6o 2 avec wi
maximum 3 433 nm :, le '?ratio spectru$ de ces deux pieents n un maximum
5 environ 438 m.
Pour les divers pi@ents principaux, les longueurs d¡®onde d'excitation
et d'6mission sont assez diff ?rentes suivant les euteurs (tabl. X.1).
Les fluorescences ont des intensit6s rel?kives varia,bles. En outre, le
signal donn¨¦ par 1 ~$lM.l-~ dPun pi(pnent don& LX;.~ ?on&ion. de la longueur
d'onde d'excitation (White et al,;, 1372).
4.2:MATFRIEL
': Les probl$mes purement techniques de m~?3&ieX sont souvent totalement
n¨¦glig¨¦s? ou du moins fort peu mentionn6s. La rigueur :semble faire souvent
defaut quant aux conditions exp6rimentales (temps, vol,umes: p?l, etc), nous
l'avons dfj8 vu. Peu d*efforts sont faits, fgalemcnt, en vue d'am¨¦liorer
les techniques et le mat&iel et des publicatians relevant des d&ails im-
portzknts ont 6% n&$igi'es au profit, de routines bien &ablies mais per-
sonnelles.
- Le'fluorim¨¨tre le plus employ¨¦ est 'JC Turner 111: t'quipc de divers,ac-
cesSOi+es. L@cmploi de spectrofluarim$tres est' exceptionnel en routine de
terrain.
5
4.2.1. Lampes
- F4T4 BL (Strickland et Parsons, 19681, lmpe UV ¨¤ vapeur de rq~;, donc
spectre dc lignes ;
- F&TSB, qui a une hission continue (dOap&s le $onstructeur) et non
un pie (neveux, 1976) ;
- Ranovia xenon:iYI W(Baudouin et Stoppa, 1971). On peut.remarquer que
la puissance totale du Turner 111 est de 720 W (Operatingman¨´a=l) ;
- Kulandaivelu et Daniel1 (7980) indiquent un optimum de 10 W,m'-2 pour
l'excitation.
4.2.2. Photcrmultiplicateur
- RCA 931 A sur les anciens Turner 111 :
R 136 Hmamatsu, 15 fois plus senible que le pr&¨¦dent dans le rouge
mevei.x, 1976) ; i
- R 446 Hswmatsu, plus sensible encore (Baudouin et Stoppa, 19'Tl).
TnstallG en usine sur les mod¨¨les actuels Turner Ill-003 et 111-004 ;
- R 456 Hemamatsu (Baudouin et Stoppa, 1971) ;
- R 375 Hauamatsu (Kulandaivelu et Daniell, 1980).
4.2.3. Filtres optiques
Il semble que les publications montrant l'importance du choix des lon-
gueurs d'onde, et de leur pr¨¦cision, n'aient gu¨¨re eu d' ?cho. Les filtres
interf&entiels semblent rarement employ&, bien que nettement pr&&ables
quant a la dEfinition et & l'Z%roitesse de leur bande passante. Ils sant
plus chers que les filtres d'absorption (600 FF ou 120 US$ contre ZOO'FF),
4.2.3.1. Filtres'$rimaires
-_------------------------
- CS 5-60 Corning (Turner 110~992), le plus employc ; maximum a 420 nm
:Blas~a, 1973) ou 425 nn (Heaney, 1978) ;
- CS 5-62 (Corning ?), maximum 8 402 nm (White et al., 1972) ;
- cs 5-74
i l
, maximum ¨¤ 44.2 nm (White n., 1972) ;
- cs 5-75
f9
s mairmun ¨¤ 465 nm (mite ¨¨t., 1972) ;
- Corning 5113, maximum ¨¤ 400-460 m (filandaiv~ Daaiell) 1:
- Corning 5543
3
.,,
(Slovacek et Hannan, 1977) ;
- wkatten 47 3, Equivalent au CS 5-60 (Strickland et Par~ons).
4.2.3.2. Filtres secondaires
--------------------------"
- CS 2-64 (Turner 110~9211, filtre d'arr¨ºt :
. a.rrGt ¨¤ 640, maximum ¨¤ 675 m (~lasco, 1973),
645,
l
a r r ¨º t ¨¤
maximum ¨¤ 687 mn (Heaney, 1978),
ar&t ¨¤ 650 environ (Holm Hansen et a~.., 19651,
: cs 2-60 :
arr& 3 630 (Holm Hansen et al., 1965) ou 599 mn White et al.,l972) m
L Wratten 25 :
arr& ¨¤ 600 nm environ (Holm Hansen et al., 1965), moins 6troi.t que
CS 2-64 (Tunzi et al
1974).
- (CS 2-6o-T%$,¡®(1) 680) maximum ¨¤ 680 m (White et a~
1972) ;
- (CS 2-60 + D&L (650) maximum ¨¤ 653 nm (White et ri$72) ;
.
-¡°.
(1: B&L : Bauscb, b ksnb.
---
6
- (Cs 2264 '4 Mratten 70)
.*
arr% 3 660 nm (Loftus et Carpenter, 1~1)
- (CS 2-59 + Corion 6509 (1))
maximum 2 650 nm(~oftus et Carpenter, 19¡¯71)
.:.
*--~(CS.¡®2%2, ,+ COpimi 6217. ( 1))
mtii&nG 620 rnn(Loftus et Carpenter/ 1971)
.; _ ~&&
¡°$,41 8
!.
.-
.-
0
(Slovacek et'Hanr,an, 19'7'0
- Schott 7 ?
maximum & 690 rm (Kulandaivelu et Dani.ell, 198@
.,
. ..4.2.4.. Cuvettes
i¡¯
La forme des cuvettes employ¨¦es nFest g6n~ralement pas mentlonG%', ."
Turn¨¦r fournit des cuvettes cylindriques, Une cuV&te rectarqulai?e e s t em-
ploy& paJ: Kulandaivelu et D&niell.(l@ ?).
'
.:.
~,2,5, mploi du fluori&tre ,' .
Bien que de ncanhreux fluorim¨¨tre.1; soient rem,arquabl<ment stables dans
le temps (Dufour, canm. pers.), plusieurs auteurs reccmmandcnt 'des reCali-
brations p¨¦riodiques par le sulfate de quinine en solution dans H@?.+ 0,1 g
3 des concentratiuns variables (Loftus et Csrpenter; 1971 : Slovacek et
HanMi; '1977). St¨¨Mrt et Wetzel (1980) indiqucrit un'e lecture, de 40, en
¨¦ch&fie 1O'X; po& .15.clff.l-' ,de quinine.
:, :
Une r¨¨calibration est aussi. possible par de la chlorophylle 2 pure '
(ref. C57?3 chez Signa Chemical Canpany, POP 14508, St-LOUIS, 63172, USA).
4.3. MESITiES¡®mT F&ORIMETRIE
4.3.1. Mek~i~sur les extraits
Dans la Plupart des cas, une seule longueur d'onde est utilisGc cii
l'excitation, une autre B. la lecture. Des interf+ences peuvent aj@ra?tre,
surtout &r la ch1 b (Rolm Hansen et Ri,gann, 19' ?'fi ; R1%i, 1980). Il est ~OR--
sible de travailler-2 plusieurs 'longueurs dlonde pour kviter ces interf&f:nczs.
!40nOchraaatiauu-,
--IL).".l"-l---l
Si T est le facteur acide, d&termi& p&ci.labl&ent dans les tGmes con-
ditions exp¨¦rimentales, on a :
ch1 2 = CX.(T /(T~l)).(Fo-Fa)
phco 5 = %.(T /(W)).(T.F,-F,)
I.
avec un facteur constant c1 regroupant'toutcs les caract&istiqu¨ºs de l"aD-
pareilla&z. Le Pactcur a devra aussi ¨ºtre d?%ermin¨¦ cxp&imentaleW?nt
(Holm Hansen et al,, 1965 ; LStrickland et Pazsons 3 1g68 : Loftus et C!arpentcrn
1971).
'!
Les ¨¦qu+tions ci-dessus $&supposent lVabsc?nce de ch1 2, dont la Prg-
(1) Il est R remarquer que ces deux r?!fErences n'existent pas dans lc
catalogue Corion 1979.
7
sente entra ?nera une sur-esttiation de la ph$o a (Marker et al., 1980 b).
Les diff&ences de vitesse: de transf@xg@xion d ?k ch1 R emholm Hansen
et Rismann, 1980) n¡¯ont pas ¨¦t¨¦ utili&es, 3 notre¡¯¨¨orGaiss&ce, pour dis-
tinguer entre les deux :chlorophyiles. ¡¯
*.
Polycbrrcanatique :
m.w---- .a.---.. .
-.
Les longueurs d¡¯onde diff¨¦rentes dsexcitation et d¡¯kaiasion maximum des
divers pie;ments peuvent permettre de les distinguer. Quelques hypoth¨¨ses
doivent ¨ºtre faites, entre autres que les divers composants du m¨¦lange fluo-
rescent ind6pendamment et que la ccanbinaison de leur r6action est lin6aire.
- A l¡¯excitation (White.et al., 1972) :
. en 1 ¡®absence de phbop~gments :
chl a = 0,733.F4,5
- 0,029.F460
ch1 b =
0,292,~-~
-
0,131.F403
.~
1...
. en prdsence de ph&opiigrnents, avec II la variation de F apr& acidifi-a
cation, et Fa la fluorescence apr¨¨s acidifidation :
ch1 2 = l,46.A44*
+ O,O~3.A46,
ch1 0 = 0,43.A460
- 0,33.A 440
ph6o ¡®it = 0,70.F,405 - w3*F844f-J
p h ¨¦ o T) = ,81 .Fa440 - 0,04 .Fa405
- A l¡¯&nission (Loftus et Carpenter, f971) :
ch1 2 = 0, 1 ~~~A660-o,1~~.A~~o~~,~ 10.0t;20
ch1 b = o,052.1i6&,- 0,2R6.A650+0,310.~620
ch1 2 = -o,o12.A~60+0)036.A650f0,264.A620
4.3.2. MesWes in vivo
Ie concentration de chlorophylle (mesurde par spectrophotaw%rie, ou
par fluorim&rie sur les extraits) ne P&ente pas un¨¦ relation lin¨¦aire
avec la fluorescence in vive (¡°IVT ),
un prunier facteur est instrwnental. 1Jeveu.x (1976) rel¨¨ve une saturation
de L¡¯appareillage, Une telle saturation, due & l¡¯instrumentation autant qu D %
19auto-ahsorption par le pigment m%ne, appara%t aussi sur des extraits au-
del¨¤ de 100 pg.1 -l (Dufour, cam, pers. 1. Strickland (1968) observe une loi
exponentielle entre IVF et chl, et reccmmande de ne pas utiliser l¡¯¨¦chclfc
1X. Thanas (1970! obtient une r¨¦ponse lin¨¦aire mais ne pr¨¦cise pas la masque.
tilandaivclu et Daniel1 (1980) indiquent un maximum mesurable de 500 &#.l¡¯l.
Dans la plupart des cas in situ, la relation est cependant lin¨¦aire dans
une m¨ºme masse d9eau entre IV* et chlkophylle (Blasco, 1973 ; Neveux, 1976:
Herbland et Voituriez; 1977) et on peut ¨¦crire : :
chl
- K.(IvJ?)
Ce coefficient de proportionalit¨¦, K, varie de 1,l (He&ey, 1-978) ?i
7,6 (Tunzi e t a., 1974) en fonction de nanbreux facteurs, -E diminue quand
la profond= la thermocline -ente (Rerbland et Voituriez, 19?7) ;
l¡¯esp¨¨ce daninante joue un r ?le (Striskland, 1968 ; Slovaeck et.Hannan,1977i.
L¡¯¨¦tat physiologique semble jouer un r ?le primordial, par exem-@e d¨¦ficience
en N ou P (K ?efer , 1 B73 a et b ; Slovaeek et Hannan, 1977) ou taux de crois-
sance in situ ~(f ?e'ariey, 1978) ,ou in vitro (Dufouz, colllll. pers,,). Le "fluores--
pence numbc& (Kiefer, 1973.a) varie tr& fort:%ent avec la bd¨¨rr !%aJIeY,
1978); La photoinhibition se manifeste nett@ent (Kiefer, 197 1: ; Heaney,
1978) 3 des intensites lumineuses faibles. 3071 m6canisme est double (Kiefer,
1973 a ; Barris et Piccinin, 1977).
La mesure.de,la IVF ne r¨¦soud donc pas lc probl&e dc la d&er&nation
de la'%?i.&asse pl.anotonique. En outre3 de nombreux travaux effectues sur ,l:t,
IVF' ne tiennent pas ocmpte de la fluorescence dissoute, dont l'importanee~
n"est pas &gligeable pcw*fois (Herbl%td et Voituriez, 1'37'7 :, Heaney, 197'R"
Cullen et Renger, 7979). Suivant le type de filtre employ¨¦; des dgbris ce&-
lulaires ou des cellules de petite taille pruvent passer dans le filtrat
(Herbland, cm. pers.) et cntrazner une sur-&, ?ustion s¨¦rieuse de ln fluo.-,
rescence dissoute.
4.3.3. Emploi de la DE
Les Vari@ions vues ci-dessus du'tfluorescentit: number" K correspondent
rendement de luorescence ("Fluorescence yicld")vari&le.
Ce rendement est fonction inverse du taux de trsnspart d ?$lectrons
la photosynth¨¨se (Kiefer., 1973 a) :, le r'~ndement de fluorescence_est
,. . \\
-
en ccmp¨¦tition avec le rendement chimique (Dutlor, 1966). JJne mesure I~ ?a~ble
de la chlorophylle par IVY implique un d6coupl~e, par blocs.& chimique
in vivo
(Duysens et Sweers', 1963) ?i qui 6q7liv;Crr~t .au dilcouplage rWis6, au-
treznent, par lFextraction a&t.onique. La DCXU ('l) r&lise ce blocegc au nivelu
de la r&ction de JXi.11 (Fleischhacker et Zcngerz, 1978).
- a
Les concentrations finales r&alis6es sont veziables : ICI'M(Fheischhacker
et Se er, 1970 : Semuelson et al., ii78 :, Ku ~~dsivclu et Dani ?l19 1980),
3.10- G (Culien et Renger,
t
1979), 3 ¨¤ lO.~l!Y'11 (Slovscek et Hannan, 1977).
Les G%ais de &action, et d'observation, vari<& de 30 E (Cullen et Renger,
1979 ; Kulandaivelu et Daniell, 1980) ,I 10 min (Samuc%sor~ et al, 2 1978). 1.~
production dgOz est totalement stoppse aprss ?,5 min m&e -es formes
cuirass¨¦es (Slcvczcek et IIsnnan, 1!)77). Des dtlais de 1+ ls 1Jr s sont probable-.
.
ment insuffisants., et expliqueraient certains r.ds
~~ultats'dkcevants in situ
-1
(Roy et Legendre, t980).' ¡¯
.
La fluorescence est mesur¨¦e sans DCMU (Y,!;) itt avec DCMU (PD). On Calcu"
le,,, ,sqit le r&pport FD/$?R (Roy et Legendre 3 l@O), soit un Y7fluorescencc
re'sponse index", FR1 : ,:
.¡®
FR1 = .(FD - Fti)/PD
. . .
Une val&r nulle de FRI, correspondant '.X une absence? d'effet de la
DGMII, indique une. capaGit. photosynth&ique nulle.
-:
:.
(1) DCMU : 3-(3,4-dichlorophenyl)-l,l-dim6thyl-ur6e
fabriqu6e par K: f. K '
¡¯
vendue par 0,S.I. (154 FF/100 d
ou Touzart et Matignon
9
R¨¦sultats :
<' .
FD augmente de fac;on asymptotique avec le temps de seaction (Ssmuelson
a l
et . , 1978'). La fluorescence double (FR1 = 0,5) apr& 30 i? 60 s tant sur
des cultures que sur des populations n&turelles. In, situ, le maximum de FRI
(1?,6) est obser&. 2 la profondeur du maximum de chlorophylle (Cullen et,
Renger, 1979). ?RI aug&en%e avec la profondeur (Roy et Legendre, 1980).
Plusieurs Gtats physiologiques extr2mes ont ¨¦t¨¦ r6alis¨¦s sur des cultu-
res z forte carence en N, P, (102, empoisonnaaent par B$jC%.~ etc... Quelles
que soient les esp¨¨ces et les conditions, il existe une relation entre 'bjD
et la concentration de ch1 a mesurge sur les extraits (Slovacek et Hannan, .
1977).
On observe d9autre part une elation ¨¦troite entre FR1 et la photosyn-
th¨¨se, mesur¨¦e par exwple par
IEC (Ssmuclson et al., 1978). D'autres ex!za-
?les d'utilisation de la DC!& aboutissent 2 des~lusions analogues quant.
2 lPint&¨ºt de cette m¨¦thode (Halmann et Elgavish, 1979 ; Kulandaivelu et :
Daniell, 1980).
5 .
M E S U R E S
P A R
S F E C T R O P H O T O M E T R I E
La spectrophotc&trie est g¨¦n&alanent consid&& canme la m¨¦thode de
rkf¨¦rence pour des mesures par fluorim&rie. ?Qus avons vu que 19anploi de
la DWU pemet des d¨¦terminations absolues y, drautre part, la calibration
du fluorim8tre peut se fsire sur de la. chlorophylle pure, Pour ces raisons?
la spectrophotan¨¦trie perd une partie de son importance, et ne sera t.rait&e
ici que rapidement,paur m&oire.
Les corrections de turbidit¨¦ des extraits sont ba&es g¨¦n¨¦ralEment sur
une lecture & 750 nm (Mass, 1967 ; Samuelson et al., 19781, encore que d'au--
tres longueurs d'onde aient ¨¦t¨¦ esnployees : 7G (Jensen, 1978) ou 720 rm,
5.1. MESURES MOIW!HR~ATIQ'JES
Pour la chlorophylle a, 'les coefficients dYabsorption sp¨¦cifique sont
assez bien connus (Marker et al., Tg80 b). A 665 mn, on a selon le solvant
employ6 :
- ac¨¦tone 90 $
89
- ?thanol 90 $
87
- m¨¦thanol
77
- di¨¦thyl ¨¦ther
100
Pour l'ac¨¦tone 90 3, on aura ainsi l'¨¦quation (Jen ?en, 1978) :
ch1 a = 71,23.(D665 - D730)
D'autres auteurs utilisent des¡®vnleurs quelque peu differentes
: Il,9
chez Talling et Driver (1963) par exonple.
La d¨¦termination des ph¨¦opigments se fait par lecture ¨¤ 665 nm avant
(1+)) et apr¨¨s (D,) acidification. Diverses 6quations sont don&es, analogues
ElR3.S
non idcntiques,par divers auteurs. En n6gligeant les facteurs de volu-
mes d'extrait et dg¨¦chantillon, on trouve ainsi :
ch1 a = 26,I (Do i Dal
) Strickland et¡°
phE0 -
= 26,¡®7 (1,7.D, - Do) )- Parsons, 1968
5.2. MESURES A DEUX LONGUlS DICNDE
Differents pigments peuvent ¨ºtre d¨¦termin& en utilisant les diffErents
aaximums dlabstirption :
et
5.3. ME&RES A 'TROIS LONGUXURS D"OTVDE
.:
',Des. ?ectures 5 trois longueurs d'onde permettent de d¨¦terminer les con-
centrations respectives' de ch1 a, 2 et c. Les 6quations no prennent cepen-
dant pss cn c&pte les ph6opigments correspondants et, de ce fait, qur-
¨¦valuent 'les chlorophylles (Markrr et al., 1980 b).
Les coefficients, et, les 1o~ ?iZYd'ondc.
varient suivant les aut,zurs 1
Jensen (1978) donne les cquations :
ch1 a = 11 ,85.11G64 - 1 ,54,D61rpf ~- 0,0:5.D63C
ch113 z
5,43.DG64 +21,03.D647 - :?$.D,;3,
ch1 c =
1 ,67.n61;4 ¡°- 7$.!fIh47 .,i!+:52.Dtj30
Strickland et Parsons (1968) donnent, troic s&es d'¨¦quations., de saur-
ces diff¨¦rentes, sans d6terminer la 'valeur rol::tivz de ces iiquations, dont
les, coefficients sont assez fortement diff&cztn.
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14
TAIEEAU T .*L- Valeur du facteur acide
*
c h l a
Rif.
*.
-7
I.
-
-
2,3
valeur moyenne
(1)
¡¯ 1,7
acide oxnliqu¨¦, 3 min
(2)
6,f-l
excitation .G 445 nli
12,s
excitation 3 438 nm
extrapol. ¨¤
largeur de bande nulle
0,4-3.,Q
suivant acide em?loyG et temps
1,4?
avec Fh-tomllltipF.iCateur ?! 1! 3fi
3,07,
(0)
2,,n-11,5
exci.tation entre 430 et 4W m, lar:~eur
(7)
:
4e bande l? nm
..-
-
-
-
-
-
--4
ch1 JJ
! 0,42
(5)
i
0,s
(
6
)
chl c
-
-u-m
CI.
1,73
fi.1 tre
(5)
2,4
fi3 tre. CC 2-6h
(4)
538
filtre CC 7-45~
14 ; 1
(6)
-
.
TARLRAlJ II.-- Caract&istiques optiques
1 5
!
* j
excitation
, r$f * 7:
' .
&ission
t, ref.
;
; pheo a :
.- <
i pheo 2 i
437
610
wREFEREI?CES POUR LES TAF$LF,AUX
(11 z Strickland et Parsons, 1968
(2) : Yentsch et Menzel, 1963
(3) : Bfmdouin et Smppa, 1971
(4) : HCGZI Hansen et al., 1965
-.
W : tieveux, 1976
(6) : Loftus et Cerpenter, 1971
(7) : Sa ?jo et Nishiznwa, 1969
(8) : Vhite et al., 1 9 7 1
(9) : Tunzi et,, 1974
<<
:
.
:
. <.
DOSAGE
FLUORIM ?TRIQ!JE
E S S A I D E REVUE D E S
. .
MOL)ALITES ¡® T E C H N I Q U E S .
Jean PAGES
I N T R O D U C T I O N
La biomasse du phytoplancton est souvent d&ermin¨¦e par le biais de
ses pigments chlorophylliens. La mesure de la concentration de ces pigments
est d¨¦,j$ un proc¨¦d6 fort ancien, mais une rapide revue de la litt¨¦rature
fait cependant appara'itre que, malgrk divers essais de normalisation (SCOR-
-TJ~~SQ) 1966 ), les madalit& techniques sont loin d%tre uniformes.
.&us avons tent¨¦ de rasscsnbler ici un certain ncmbre de d¨¦tails tech-
niques cit¨¦s par divers auteurs, afin dPobtenir une vue g&-&rale. Ceci ne
saurait ^etre une revue exhaustive, et encore moins critique, venant &pr¨¨;s
les travEtux publi¨¦s dans les "Ergebnisse der Limnologie" (Beiheft 14,, 1980).
Il s'agit plut& d'un essai de mise au point, 3 usage interne, ax¨¦ sur les
dkails mat¨¦riels et prenant en compte quelques techniques r¨¦centes.
En outre, l'accent a ¨¦t¨¦ mis, volontairement, sur le dosage par fluo-
rim ?trie, plus adapt¨¦ aux conditions de la haute mer et plus rapide ; la
spectrophotan%rie a ¨¦t¨¦ assez n&$&e.
1 .
F 1 LT R AT 10 N "
'
1.7. CEOIX DES FILTRES
Les membranes filtrantes permettent,, du moins en th¨¦orie. de s¨¦parer
des tailles diff¨¦rentes dgorganimes (Faust et Correl, 1976 : Venrick et 81,:
19?7?. En fait, le choix de la marque est assez capital ; les membrane7
Nuclepore semblent peulwfournir des perforations r¨¦ellanent calibr6es
(Sheldon, 1972), La plupart'des membranes, ~epend&t~~'coimat ?nt ass¨¦k'vite
et peuvent, par leur dissolution ult&ieure,apporter des substances parasites.
Les filtres en fibre de verre ont des caract¨¦ristiques de filtration
.@us satisfaisantes (Lenz et Fritsche, 1980). Leurs fibres sm¨¦liorent la
2
destruction des cellules dans le cas o¨´& filtre est broy¨¦ dans le SO~&?+I~.
Leur gorosit est assez bien contr%l¨¦e (Holm Hansen et Riemann, 1978 ; MSX?.CT
et Ed.,, 1980). Il semble cependant que lcsk'ilhesGelmah type A soient inf¨¦-
rieurs aux filtres Whatman GF/C (Herbland, comm. pers.),,
"..,
1.2. MODALTTF DE 'L&FILTRATION "
La d¨¦pression, lors de la filtration, ne doit, pas d¨¦passer l/lOc d'at-
,mosph&e (As&nson, 1978 ; Ekmxp;.~978).
L9addition d'une suspension de %$!~
R. i-t¨¦ recommand& (Strickland et
Parsons, 1968) 1 LPutilit¨¦, ou m;bme les bienfaits, d'une tzlle proc¨¦dure, SO?:*
assez discut& pourtant (Holm Hansen et Riemann, 13'78 r, Marker et al,, 1980 b),
1.3. I~~OTJSEXVATIOI\\J DES FILTRES
Certains auteurs signalent une 'baisse sensible de la teneur en chlora-
phylle, tant dans les extraits que swhs filtres (Blasco, 19731, m¨ºme si
ceux-ci sont lyophilis& (Lenz et Fritsche, l@O),, Inversement, d'autres
essais n'ont pu mettre en 6vidence de perte.9 sur des filtres congel¨¦s enco-
re humides et conserv& 3 -20% (Hol¨¤ Hanscin ct Riemann, 1980). Des filtres
ont St6 conserv¨¦s de fa ?on satisfaisante (moins de 20 ? de pertes) ¨¤ -15*C,
sur gel de silice, pendant 10 mois (Dufour, 1972).
2'.
EXTRACTIOI'J
,<
,'.
Plusieurs 3aivae3 ont ¨¦t¨¦ employks pour extraire les pigments. L7 a&-
tone est le plus¡®fr&quemment utili&e, mais d7autres solvants ont &¨¦ reca-
mand¨¦s.
.
.
2.1,. ACETONF
Le ti¨¦lange le plus fr6quen-t est lvacCtone SS 10 $ dPeau ("ac¨¦tone'90 "").
Certains auteurs emploient des m¨¦langes & 85 ou 80 %, Baudouin et Seoppa
(1971) utilisent lrac6tone 85 $ satur6e de MG?O~.
Afin d'am¨¦liorer lgefficacit¨¦ de l"extraction, Stauffer et RI. (1'379)
pr&onisent un m¨¦lange ac¨¦tone-DMSO (a:a) (1). Le broyage desx&es a 6%:
recommande (Strickland et Parsons, l968) mais somh:Le d'une efficacitg dis-
cutable (Holm Hansen et Riemann, 1978) et pc& m$me augmenter la variabili-
t¨¦ @ufow, 1972).
Un des principaux d&avs,nts.ges de l'ac&one est sa faible efficacits
d'extractipn sur de nombreuses formes Planctonique:%.
('1) f;e DM50 fltiorcsce fortement avec &?x, = 405, ,\\hi z 525 m
.
3
2.2. METHAWL
Plusieurs auteurs recommandent, comme plus efficace, le m~thanol, soit
bouillant p&dant 30 s (?&aney, 1978 ; Stauffer et al., 1979 : Biemann,
1980), soit plus simplement b froid (Berland et -1970 : Hol¨¤ Hansen et'
iGaa.nn, 1978 ; Masker et al,, 1980 a et b), %?%oyage du filtre est alors
inutile.
Le comportement des pipents dans le m¨¦thanol acidifi¨¦ peut prhmter
quelques'probl¨¨saes (Marker et al., 1980 a ; Uusch, 1980). Les vapeurs de
m-thanol sont assez taxiquo*soh, 1980).
L'¨¦thanol bouillant est aploy6 par quelques auteurs (Moed et Hallgracff.
1978 a' '&rker et af., 1980 a ; Musch, 7980). Le bon ccmportemsnt lors de
1'ncidificati.o~ int¨¦ressant, Le prix S%uit est un arment suppl&ncn-
taire.
3.
ACIDIFICATIOI~'
Pour transformer les chlorophylles en phEopi@xents, divers Ments peu-
vent ijtre employ¨¦s. La chaleur ( 100¡ãC) a ¨¦t¨¦ mployee (Vhitc et rd. ,, ? 972).
Plus fr¨¦quent 3 car plus simple, est l¡¯emploi de lzacidificatiGsr UE
acide min¨¦ral fort ou un acide organique,
3.1. MODALITES
3.1.1. HC1
La proc¨¦dure la plus fr¨¦quente consiste ~3 !additionner un volume faible
de HC1 dilu¨¦ ? ? l*¨¦chantillon. Les conditions op6%atoires sont souvent d&ri-
tes avec une surprenante impr¨¦cision, tant sur le volume ("quelques gouttes")
que sur la concentration("dilu¨¦<', 'de 0,5 ¨¤ '1 #'), Hol¨¤ Ransen et Rianann
(1978) reecmmandent une concentration finale de 3,10'3M BCI, ,s..gissar.tt 3min.
Le pR intervient fortement 9 ¨¤ la fois sur les spectres-des diff&ents pig-
aents et sur la vitesse de transformation'des chlorophylles :, la ch1 b se
transforme en ph6o b 5 a 9 fois plus lentement que la ch1 a en ph¨¦o R-
f Holm Hansen et Flie ?Gann, 1978). Moed et Hallegraeff (1978)~indiquent-un
pH souhaitable de 2 $6 ¨¤ 2,s. Pour un &ne volume d ¡®HCl, le pouvoir tampon
des difffrents solvants d&r&t dans le sens ¨¦thanol-n¨¦thanol-ac&one ;
80 %-ac¨¦tone 90 fi.
P~I.w des dosages ult¨¦rieurs en spectrm&rie, l¡¯extrait sera neutreSi-
s¨¦ ~HO$JI Haisen et Riunann, 1978 ; Mctrker et al., 198o.b).
:-
3.j.2, Acide oxafique
Afin de limiter les risques dgacidification excessive,certains auteurs
pr¨¦conisent L¡¯emploi de l¡¯ac¨¦tone satur¨¦e d$acide oxalique, 3 raison de 2
2 5 % de'l'&hantillon (Baudouin et Scoppa,l97l).La r6actionest beaucoup plus
lente (HO&~ Hansen .et al. 5 1965) ; il est possible que ce soit une raison
du peu de succ¨¨s demthode,
4
3.2. FACTEUR ACIDE ("'ACID FACTOR"', ACID RATIO"')
Dam le cas a< la spectrophotcm%tric, la majori& des auteurs conside-
rent que le facteur .acide5 rapports des absorptions avant et apr¨¨s acidifie.
cation, a une valeur constante de 137 pour 1% c!i~, a ~OIXXZV& a 6.65 rrm.
_I
Le rapport des fluorescences avant et aprC:o Gcidification (F,/Fa) varie
en fonction de nombreux facteurs :
- Modalit¨¦ de l'acidification (voir plus hmt) 4, 'le temps joue un, @-
le pr6pondbrant dcms le cas des acides faibles ;
- Pourcent~c,3 dscau dans lsacbtone (Neveu.x,, 1376) ; cet, effet est pro-
bablement Ii6 au pH (Moed et Hallegraeff, i%?7). 5~ facteur acide diminue
quand le pourcentage d'eau augmente :
- Longueur d"onde de lgexcitation, ii largeur de bande constant (Saijo
et Nishizawa, 1969) ;
- Largeur de bende de la lumi¨¨re dlekzitation (Baudouin et Scoppa;l971):
- Rature des filtres secondaires et du pf-loto~multiplicateur (Neveux,
1976).
L'interaction de ces diff&ents facteurs explique les chiffres extr¨ºme-
ment variables apparaissant dans les publications D puisque les conditions
expkimentales sont pour le moins variables, ct pqrfo:is non contr ?lables.
Le facteur acide diff¨¨re, de plus, suivant le pigment consid& ?j. Les valcurr~
varient ainsi entre G,g et plus de 11, suivant les conditions (tabl. 1).
I
4...
M E S U R E S
P A R
P L U D R I: Y E T R f E
4.1, CARACTERISTL~ES OPTIQJJES DES PIGMENTS
Les logeurs d*onde d'absorption (excitntion) et d'¨¦mission maximum
sont variables selon les pigments consid&&, Airk, Baurio?~in et Stoppa
(1971) rcl&ent un spectre de diffkence entre chl 2 et ph6o 2 avec wi
maximum 3 433 nm :, le '?ratio spectru$ de ces deux pieents n un maximum
5 environ 438 m.
Pour les divers pi@ents principaux, les longueurs d¡®onde d'excitation
et d'6mission sont assez diff ?rentes suivant les euteurs (tabl. X.1).
Les fluorescences ont des intensit6s rel?kives varia,bles. En outre, le
signal donn¨¦ par 1 ~$lM.l-~ dPun pi(pnent don& LX;.~ ?on&ion. de la longueur
d'onde d'excitation (White et al,;, 1372).
4.2:MATFRIEL
': Les probl$mes purement techniques de m~?3&ieX sont souvent totalement
n¨¦glig¨¦s? ou du moins fort peu mentionn6s. La rigueur :semble faire souvent
defaut quant aux conditions exp6rimentales (temps, vol,umes: p?l, etc), nous
l'avons dfj8 vu. Peu d*efforts sont faits, fgalemcnt, en vue d'am¨¦liorer
les techniques et le mat&iel et des publicatians relevant des d&ails im-
portzknts ont 6% n&$igi'es au profit, de routines bien &ablies mais per-
sonnelles.
- Le'fluorim¨¨tre le plus employ¨¦ est 'JC Turner 111: t'quipc de divers,ac-
cesSOi+es. L@cmploi de spectrofluarim$tres est' exceptionnel en routine de
terrain.
5
4.2.1. Lampes
- F4T4 BL (Strickland et Parsons, 19681, lmpe UV ¨¤ vapeur de rq~;, donc
spectre dc lignes ;
- F&TSB, qui a une hission continue (dOap&s le $onstructeur) et non
un pie (neveux, 1976) ;
- Ranovia xenon:iYI W(Baudouin et Stoppa, 1971). On peut.remarquer que
la puissance totale du Turner 111 est de 720 W (Operatingman¨´a=l) ;
- Kulandaivelu et Daniel1 (7980) indiquent un optimum de 10 W,m'-2 pour
l'excitation.
4.2.2. Photcrmultiplicateur
- RCA 931 A sur les anciens Turner 111 :
R 136 Hmamatsu, 15 fois plus senible que le pr&¨¦dent dans le rouge
mevei.x, 1976) ; i
- R 446 Hswmatsu, plus sensible encore (Baudouin et Stoppa, 19'Tl).
TnstallG en usine sur les mod¨¨les actuels Turner Ill-003 et 111-004 ;
- R 456 Hemamatsu (Baudouin et Stoppa, 1971) ;
- R 375 Hauamatsu (Kulandaivelu et Daniell, 1980).
4.2.3. Filtres optiques
Il semble que les publications montrant l'importance du choix des lon-
gueurs d'onde, et de leur pr¨¦cision, n'aient gu¨¨re eu d' ?cho. Les filtres
interf&entiels semblent rarement employ&, bien que nettement pr&&ables
quant a la dEfinition et & l'Z%roitesse de leur bande passante. Ils sant
plus chers que les filtres d'absorption (600 FF ou 120 US$ contre ZOO'FF),
4.2.3.1. Filtres'$rimaires
-_------------------------
- CS 5-60 Corning (Turner 110~992), le plus employc ; maximum a 420 nm
:Blas~a, 1973) ou 425 nn (Heaney, 1978) ;
- CS 5-62 (Corning ?), maximum 8 402 nm (White et al., 1972) ;
- cs 5-74
i l
, maximum ¨¤ 44.2 nm (White n., 1972) ;
- cs 5-75
f9
s mairmun ¨¤ 465 nm (mite ¨¨t., 1972) ;
- Corning 5113, maximum ¨¤ 400-460 m (filandaiv~ Daaiell) 1:
- Corning 5543
3
.,,
(Slovacek et Hannan, 1977) ;
- wkatten 47 3, Equivalent au CS 5-60 (Strickland et Par~ons).
4.2.3.2. Filtres secondaires
--------------------------"
- CS 2-64 (Turner 110~9211, filtre d'arr¨ºt :
. a.rrGt ¨¤ 640, maximum ¨¤ 675 m (~lasco, 1973),
645,
l
a r r ¨º t ¨¤
maximum ¨¤ 687 mn (Heaney, 1978),
ar&t ¨¤ 650 environ (Holm Hansen et a~.., 19651,
: cs 2-60 :
arr& 3 630 (Holm Hansen et al., 1965) ou 599 mn White et al.,l972) m
L Wratten 25 :
arr& ¨¤ 600 nm environ (Holm Hansen et al., 1965), moins 6troi.t que
CS 2-64 (Tunzi et al
1974).
- (CS 2-6o-T%$,¡®(1) 680) maximum ¨¤ 680 m (White et a~
1972) ;
- (CS 2-60 + D&L (650) maximum ¨¤ 653 nm (White et ri$72) ;
.
-¡°.
(1: B&L : Bauscb, b ksnb.
---
6
- (Cs 2264 '4 Mratten 70)
.*
arr% 3 660 nm (Loftus et Carpenter, 1~1)
- (CS 2-59 + Corion 6509 (1))
maximum 2 650 nm(~oftus et Carpenter, 19¡¯71)
.:.
*--~(CS.¡®2%2, ,+ COpimi 6217. ( 1))
mtii&nG 620 rnn(Loftus et Carpenter/ 1971)
.; _ ~&&
¡°$,41 8
!.
.-
.-
0
(Slovacek et'Hanr,an, 19'7'0
- Schott 7 ?
maximum & 690 rm (Kulandaivelu et Dani.ell, 198@
.,
. ..4.2.4.. Cuvettes
i¡¯
La forme des cuvettes employ¨¦es nFest g6n~ralement pas mentlonG%', ."
Turn¨¦r fournit des cuvettes cylindriques, Une cuV&te rectarqulai?e e s t em-
ploy& paJ: Kulandaivelu et D&niell.(l@ ?).
'
.:.
~,2,5, mploi du fluori&tre ,' .
Bien que de ncanhreux fluorim¨¨tre.1; soient rem,arquabl<ment stables dans
le temps (Dufour, canm. pers.), plusieurs auteurs reccmmandcnt 'des reCali-
brations p¨¦riodiques par le sulfate de quinine en solution dans H@?.+ 0,1 g
3 des concentratiuns variables (Loftus et Csrpenter; 1971 : Slovacek et
HanMi; '1977). St¨¨Mrt et Wetzel (1980) indiqucrit un'e lecture, de 40, en
¨¦ch&fie 1O'X; po& .15.clff.l-' ,de quinine.
:, :
Une r¨¨calibration est aussi. possible par de la chlorophylle 2 pure '
(ref. C57?3 chez Signa Chemical Canpany, POP 14508, St-LOUIS, 63172, USA).
4.3. MESITiES¡®mT F&ORIMETRIE
4.3.1. Mek~i~sur les extraits
Dans la Plupart des cas, une seule longueur d'onde est utilisGc cii
l'excitation, une autre B. la lecture. Des interf+ences peuvent aj@ra?tre,
surtout &r la ch1 b (Rolm Hansen et Ri,gann, 19' ?'fi ; R1%i, 1980). Il est ~OR--
sible de travailler-2 plusieurs 'longueurs dlonde pour kviter ces interf&f:nczs.
!40nOchraaatiauu-,
--IL).".l"-l---l
Si T est le facteur acide, d&termi& p&ci.labl&ent dans les tGmes con-
ditions exp¨¦rimentales, on a :
ch1 2 = CX.(T /(T~l)).(Fo-Fa)
phco 5 = %.(T /(W)).(T.F,-F,)
I.
avec un facteur constant c1 regroupant'toutcs les caract&istiqu¨ºs de l"aD-
pareilla&z. Le Pactcur a devra aussi ¨ºtre d?%ermin¨¦ cxp&imentaleW?nt
(Holm Hansen et al,, 1965 ; LStrickland et Pazsons 3 1g68 : Loftus et C!arpentcrn
1971).
'!
Les ¨¦qu+tions ci-dessus $&supposent lVabsc?nce de ch1 2, dont la Prg-
(1) Il est R remarquer que ces deux r?!fErences n'existent pas dans lc
catalogue Corion 1979.
7
sente entra ?nera une sur-esttiation de la ph$o a (Marker et al., 1980 b).
Les diff&ences de vitesse: de transf@xg@xion d ?k ch1 R emholm Hansen
et Rismann, 1980) n¡¯ont pas ¨¦t¨¦ utili&es, 3 notre¡¯¨¨orGaiss&ce, pour dis-
tinguer entre les deux :chlorophyiles. ¡¯
*.
Polycbrrcanatique :
m.w---- .a.---.. .
-.
Les longueurs d¡¯onde diff¨¦rentes dsexcitation et d¡¯kaiasion maximum des
divers pie;ments peuvent permettre de les distinguer. Quelques hypoth¨¨ses
doivent ¨ºtre faites, entre autres que les divers composants du m¨¦lange fluo-
rescent ind6pendamment et que la ccanbinaison de leur r6action est lin6aire.
- A l¡¯excitation (White.et al., 1972) :
. en 1 ¡®absence de phbop~gments :
chl a = 0,733.F4,5
- 0,029.F460
ch1 b =
0,292,~-~
-
0,131.F403
.~
1...
. en prdsence de ph&opiigrnents, avec II la variation de F apr& acidifi-a
cation, et Fa la fluorescence apr¨¨s acidifidation :
ch1 2 = l,46.A44*
+ O,O~3.A46,
ch1 0 = 0,43.A460
- 0,33.A 440
ph6o ¡®it = 0,70.F,405 - w3*F844f-J
p h ¨¦ o T) = ,81 .Fa440 - 0,04 .Fa405
- A l¡¯&nission (Loftus et Carpenter, f971) :
ch1 2 = 0, 1 ~~~A660-o,1~~.A~~o~~,~ 10.0t;20
ch1 b = o,052.1i6&,- 0,2R6.A650+0,310.~620
ch1 2 = -o,o12.A~60+0)036.A650f0,264.A620
4.3.2. MesWes in vivo
Ie concentration de chlorophylle (mesurde par spectrophotaw%rie, ou
par fluorim&rie sur les extraits) ne P&ente pas un¨¦ relation lin¨¦aire
avec la fluorescence in vive (¡°IVT ),
un prunier facteur est instrwnental. 1Jeveu.x (1976) rel¨¨ve une saturation
de L¡¯appareillage, Une telle saturation, due & l¡¯instrumentation autant qu D %
19auto-ahsorption par le pigment m%ne, appara%t aussi sur des extraits au-
del¨¤ de 100 pg.1 -l (Dufour, cam, pers. 1. Strickland (1968) observe une loi
exponentielle entre IVF et chl, et reccmmande de ne pas utiliser l¡¯¨¦chclfc
1X. Thanas (1970! obtient une r¨¦ponse lin¨¦aire mais ne pr¨¦cise pas la masque.
tilandaivclu et Daniel1 (1980) indiquent un maximum mesurable de 500 &#.l¡¯l.
Dans la plupart des cas in situ, la relation est cependant lin¨¦aire dans
une m¨ºme masse d9eau entre IV* et chlkophylle (Blasco, 1973 ; Neveux, 1976:
Herbland et Voituriez; 1977) et on peut ¨¦crire : :
chl
- K.(IvJ?)
Ce coefficient de proportionalit¨¦, K, varie de 1,l (He&ey, 1-978) ?i
7,6 (Tunzi e t a., 1974) en fonction de nanbreux facteurs, -E diminue quand
la profond= la thermocline -ente (Rerbland et Voituriez, 19?7) ;
l¡¯esp¨¨ce daninante joue un r ?le (Striskland, 1968 ; Slovaeck et.Hannan,1977i.
L¡¯¨¦tat physiologique semble jouer un r ?le primordial, par exem-@e d¨¦ficience
en N ou P (K ?efer , 1 B73 a et b ; Slovaeek et Hannan, 1977) ou taux de crois-
sance in situ ~(f ?e'ariey, 1978) ,ou in vitro (Dufouz, colllll. pers,,). Le "fluores--
pence numbc& (Kiefer, 1973.a) varie tr& fort:%ent avec la bd¨¨rr !%aJIeY,
1978); La photoinhibition se manifeste nett@ent (Kiefer, 197 1: ; Heaney,
1978) 3 des intensites lumineuses faibles. 3071 m6canisme est double (Kiefer,
1973 a ; Barris et Piccinin, 1977).
La mesure.de,la IVF ne r¨¦soud donc pas lc probl&e dc la d&er&nation
de la'%?i.&asse pl.anotonique. En outre3 de nombreux travaux effectues sur ,l:t,
IVF' ne tiennent pas ocmpte de la fluorescence dissoute, dont l'importanee~
n"est pas &gligeable pcw*fois (Herbl%td et Voituriez, 1'37'7 :, Heaney, 197'R"
Cullen et Renger, 7979). Suivant le type de filtre employ¨¦; des dgbris ce&-
lulaires ou des cellules de petite taille pruvent passer dans le filtrat
(Herbland, cm. pers.) et cntrazner une sur-&, ?ustion s¨¦rieuse de ln fluo.-,
rescence dissoute.
4.3.3. Emploi de la DE
Les Vari@ions vues ci-dessus du'tfluorescentit: number" K correspondent
rendement de luorescence ("Fluorescence yicld")vari&le.
Ce rendement est fonction inverse du taux de trsnspart d ?$lectrons
la photosynth¨¨se (Kiefer., 1973 a) :, le r'~ndement de fluorescence_est
,. . \\
-
en ccmp¨¦tition avec le rendement chimique (Dutlor, 1966). JJne mesure I~ ?a~ble
de la chlorophylle par IVY implique un d6coupl~e, par blocs.& chimique
in vivo
(Duysens et Sweers', 1963) ?i qui 6q7liv;Crr~t .au dilcouplage rWis6, au-
treznent, par lFextraction a&t.onique. La DCXU ('l) r&lise ce blocegc au nivelu
de la r&ction de JXi.11 (Fleischhacker et Zcngerz, 1978).
- a
Les concentrations finales r&alis6es sont veziables : ICI'M(Fheischhacker
et Se er, 1970 : Semuelson et al., ii78 :, Ku ~~dsivclu et Dani ?l19 1980),
3.10- G (Culien et Renger,
t
1979), 3 ¨¤ lO.~l!Y'11 (Slovscek et Hannan, 1977).
Les G%ais de &action, et d'observation, vari<& de 30 E (Cullen et Renger,
1979 ; Kulandaivelu et Daniell, 1980) ,I 10 min (Samuc%sor~ et al, 2 1978). 1.~
production dgOz est totalement stoppse aprss ?,5 min m&e -es formes
cuirass¨¦es (Slcvczcek et IIsnnan, 1!)77). Des dtlais de 1+ ls 1Jr s sont probable-.
.
ment insuffisants., et expliqueraient certains r.ds
~~ultats'dkcevants in situ
-1
(Roy et Legendre, t980).' ¡¯
.
La fluorescence est mesur¨¦e sans DCMU (Y,!;) itt avec DCMU (PD). On Calcu"
le,,, ,sqit le r&pport FD/$?R (Roy et Legendre 3 l@O), soit un Y7fluorescencc
re'sponse index", FR1 : ,:
.¡®
FR1 = .(FD - Fti)/PD
. . .
Une val&r nulle de FRI, correspondant '.X une absence? d'effet de la
DGMII, indique une. capaGit. photosynth&ique nulle.
-:
:.
(1) DCMU : 3-(3,4-dichlorophenyl)-l,l-dim6thyl-ur6e
fabriqu6e par K: f. K '
¡¯
vendue par 0,S.I. (154 FF/100 d
ou Touzart et Matignon
9
R¨¦sultats :
<' .
FD augmente de fac;on asymptotique avec le temps de seaction (Ssmuelson
a l
et . , 1978'). La fluorescence double (FR1 = 0,5) apr& 30 i? 60 s tant sur
des cultures que sur des populations n&turelles. In, situ, le maximum de FRI
(1?,6) est obser&. 2 la profondeur du maximum de chlorophylle (Cullen et,
Renger, 1979). ?RI aug&en%e avec la profondeur (Roy et Legendre, 1980).
Plusieurs Gtats physiologiques extr2mes ont ¨¦t¨¦ r6alis¨¦s sur des cultu-
res z forte carence en N, P, (102, empoisonnaaent par B$jC%.~ etc... Quelles
que soient les esp¨¨ces et les conditions, il existe une relation entre 'bjD
et la concentration de ch1 a mesurge sur les extraits (Slovacek et Hannan, .
1977).
On observe d9autre part une elation ¨¦troite entre FR1 et la photosyn-
th¨¨se, mesur¨¦e par exwple par
IEC (Ssmuclson et al., 1978). D'autres ex!za-
?les d'utilisation de la DC!& aboutissent 2 des~lusions analogues quant.
2 lPint&¨ºt de cette m¨¦thode (Halmann et Elgavish, 1979 ; Kulandaivelu et :
Daniell, 1980).
5 .
M E S U R E S
P A R
S F E C T R O P H O T O M E T R I E
La spectrophotc&trie est g¨¦n&alanent consid&& canme la m¨¦thode de
rkf¨¦rence pour des mesures par fluorim&rie. ?Qus avons vu que 19anploi de
la DWU pemet des d¨¦terminations absolues y, drautre part, la calibration
du fluorim8tre peut se fsire sur de la. chlorophylle pure, Pour ces raisons?
la spectrophotan¨¦trie perd une partie de son importance, et ne sera t.rait&e
ici que rapidement,paur m&oire.
Les corrections de turbidit¨¦ des extraits sont ba&es g¨¦n¨¦ralEment sur
une lecture & 750 nm (Mass, 1967 ; Samuelson et al., 19781, encore que d'au--
tres longueurs d'onde aient ¨¦t¨¦ esnployees : 7G (Jensen, 1978) ou 720 rm,
5.1. MESURES MOIW!HR~ATIQ'JES
Pour la chlorophylle a, 'les coefficients dYabsorption sp¨¦cifique sont
assez bien connus (Marker et al., Tg80 b). A 665 mn, on a selon le solvant
employ6 :
- ac¨¦tone 90 $
89
- ?thanol 90 $
87
- m¨¦thanol
77
- di¨¦thyl ¨¦ther
100
Pour l'ac¨¦tone 90 3, on aura ainsi l'¨¦quation (Jen ?en, 1978) :
ch1 a = 71,23.(D665 - D730)
D'autres auteurs utilisent des¡®vnleurs quelque peu differentes
: Il,9
chez Talling et Driver (1963) par exonple.
La d¨¦termination des ph¨¦opigments se fait par lecture ¨¤ 665 nm avant
(1+)) et apr¨¨s (D,) acidification. Diverses 6quations sont don&es, analogues
ElR3.S
non idcntiques,par divers auteurs. En n6gligeant les facteurs de volu-
mes d'extrait et dg¨¦chantillon, on trouve ainsi :
ch1 a = 26,I (Do i Dal
) Strickland et¡°
phE0 -
= 26,¡®7 (1,7.D, - Do) )- Parsons, 1968
5.2. MESURES A DEUX LONGUlS DICNDE
Differents pigments peuvent ¨ºtre d¨¦termin& en utilisant les diffErents
aaximums dlabstirption :
et
5.3. ME&RES A 'TROIS LONGUXURS D"OTVDE
.:
',Des. ?ectures 5 trois longueurs d'onde permettent de d¨¦terminer les con-
centrations respectives' de ch1 a, 2 et c. Les 6quations no prennent cepen-
dant pss cn c&pte les ph6opigments correspondants et, de ce fait, qur-
¨¦valuent 'les chlorophylles (Markrr et al., 1980 b).
Les coefficients, et, les 1o~ ?iZYd'ondc.
varient suivant les aut,zurs 1
Jensen (1978) donne les cquations :
ch1 a = 11 ,85.11G64 - 1 ,54,D61rpf ~- 0,0:5.D63C
ch113 z
5,43.DG64 +21,03.D647 - :?$.D,;3,
ch1 c =
1 ,67.n61;4 ¡°- 7$.!fIh47 .,i!+:52.Dtj30
Strickland et Parsons (1968) donnent, troic s&es d'¨¦quations., de saur-
ces diff¨¦rentes, sans d6terminer la 'valeur rol::tivz de ces iiquations, dont
les, coefficients sont assez fortement diff&cztn.
BIRLIOGRAP ?:: IF
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14
TAIEEAU T .*L- Valeur du facteur acide
*
c h l a
Rif.
*.
-7
I.
-
-
2,3
valeur moyenne
(1)
¡¯ 1,7
acide oxnliqu¨¦, 3 min
(2)
6,f-l
excitation .G 445 nli
12,s
excitation 3 438 nm
extrapol. ¨¤
largeur de bande nulle
0,4-3.,Q
suivant acide em?loyG et temps
1,4?
avec Fh-tomllltipF.iCateur ?! 1! 3fi
3,07,
(0)
2,,n-11,5
exci.tation entre 430 et 4W m, lar:~eur
(7)
:
4e bande l? nm
..-
-
-
-
-
-
--4
ch1 JJ
! 0,42
(5)
i
0,s
(
6
)
chl c
-
-u-m
CI.
1,73
fi.1 tre
(5)
2,4
fi3 tre. CC 2-6h
(4)
538
filtre CC 7-45~
14 ; 1
(6)
-
.
TARLRAlJ II.-- Caract&istiques optiques
1 5
!
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excitation
, r$f * 7:
' .
&ission
t, ref.
;
; pheo a :
.- <
i pheo 2 i
437
610
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