REPUBLIQUE DU SENEGAL -1"11-~~~~-" ...
REPUBLIQUE DU SENEGAL
-1"11-~~~~-"
I\\IINIST?ZRE DU DEVELOPPEt%NT RURAL
INSTITUT SENGALAX DE RECHERCHYS
AGRICOLES (I.S.R.,I.)
-wm--...m-LIPI
DEPARTEMENT DE RECHERCHES SUR LZS
PRODUCTIONS ET LA SANTE !iISIMf&ES
~"m.~d~~~1~--...
LOBORATOIRE !<JATIONAL DE LPELEVAGE
ET DE RECHERCHES VETEXINKIRES
B.P. - 2G57
DAKAR - HANN
COURS SUR LES DIAGNOSTICS DES HEMOPARASSTOSES
ANIKLES hVYC INSISTANCE SUF LI+S
TRYP?,NOSOt?IRSES OiXiWlSE PAR
L'ILRAD DU ?w AU 26 MAL 1989
PFF
\\.i. .
No 53,'PARASITO.
SEPTEMBRE 1989,
P L A N
INTRODUCTION
I- ASPECTS GENERAUX SUR L D IMHUNOLOC;IE
1" 1 " L t immunite ¨¤ media tion cellulaire
1- 2 - L f immun ? t¨¦ humcr&>
I-3 - Les antig¨¨nes
I-4 - Les anticorps
I-5 - Lc co@erner t
II- 1 - SEPAHHTION des trypanosomes du sang
II- 2 - Technique de maintenance des trypanosomes au laboratoire
II- 3 - Cl ?naga et stabilisntion des trypanosomes
II- 3-1 - c16nage
II- 3-2 - Stabilisation et conservation des trypanosomes
dans 1 D azote liquide
II- 4 - pr¨¦paration d t antiserum
I I - 3- Immunodiffusion
I I - 0 - Immuno¨¦lectrophor¨¦se
II- 7 - Isolement et purification des immunoglobulines
II- 7 - 1 - Isolement des globulines
II- 7-2
- Puri ?ication des im~~unoglobulines
I I - 7-2-l - Filtration sur gel
I I - 7-2-2 - Chromatographi,-5 sur ¨¦changeur d¡¯ions
II- 7-2-3 - Chromatcgraphie dPa.ffinit¨¦
I I - a - Fr¨¦pzr$.tion d 7 antig¨¨nes
II- 8-1 -
Antig¨¨nes pour immunsfluorescence
II- 8-2 -
Antig ¨¨nes pour 1¡¯FLISA
II- g - Pr¨¦paration de conjugu¨¦ pour l*ELISh
I I - Y-1 -
Pr¨¦paration des iwdnoglobulines
II- g-2 -
Pr¨¦paration de 1 p er.zyme I Oxydation)
*a. / . . .
II-g-3- Pr¨¦paratiw crie conjugu¨¦
II - 10 - Techniques <e c!iagr?ostic s&ol@qae
II - 10-l - Irimunofluorescence
-s
II - 10-2 - ELISA
II _ 10-2-1- D¨¦tection dPanticorps
II - yi-J..,24- Detection des antig¨¨nes ¨¤ prtir dvacticorps monoclonaus
II - IO-2-2- Techniq.le de de~ecticn c?3aiiti$mes circulants
CONCLUSION
-III-
REPIJZRCIEHWTS
--.m.-.---
INTRODUCTION
Le d¨¦veloppement ¨´e l¡¯industrie animale africaine a ¨¦t¨¦ de tout temps entra-
,
vc par les ~robl¨¨mkX do pathologie et surtout les methodes irrationnelles de $?Stion
des troupe2ux qui ne sont ~33 toujours orient¨¦e s vers un objectif de production maxi-
mum. De nos jours, beaucoup de maladies virales ou ba ?teriennes economiquement impor-
tantes peuvent. ¨ºtre facilement contr21¨¦es
par la m¨¦thode de vaccination. Cepend ?nt,
1s situation est tout ¨¤ fait differente pour ce qui concerne 11~~ h¨¦moparasitoses ani-
males parce qu¡¯il nlcxwL
iste aucune vaccination approuv¨¦e et efficace pour ce groupe de
maladies S
LgILRAD s9est donc vu assign¨¦ comme premier objectif de d¨¦velopper de mani¨¨re
plus certaine desmesures de contr ?le officacee LI et ¨¦conomiquement possibles des deux
plus importantes malndies du rhoptel que sont : la trypanosomiase animale africaine
et la l¡¯heileriose ¨¤ theiloria parv.: ou la fi¨¨vre de 12 vallk du Rift.
Ces doux m2ladies sont responsables de la mort d9,apprcxim~tivement 3 millions d¡¯ani-
maux p3r an en Afrique et 12 fi¨¦vre de la vall¨¦e du Rift ¨¤ elle seule est accus& de
la mortalit6 de 500.000 animaux par an en Afrique de l¡¯Est. Pour rztteindre donc cet
ohjcctif, 1~ILRAD dont le finysctement est support¨¦ par le Grou ?e Consultatif pour 12
Recherche agricole intc;rnr~tionale/¨¦quip~ t, de r;mt6riel de haute. performance et d¡¯un
personnel scicntifiquc et tcchniquc tr¨¨,= qualifi.6 en faisant ainsi un la50ratoire de ::;
r¨¦f¨¦rence. En vue de rspsndre 5. son second objectif qui est la forniztion, un progranlme
de cours bas¨¦ esscntiellemcnt sur iw r¨¦sultats acqui.s par les chercheurs et techni-
ciens et les innovati.cJns dans les m¨¦thodes de travail utili& d¡¯une part, et 19exp¨¦-
riencc personnelle des urs o: &zs autres d¡¯autre part est organis6 chaque annge par
lgunit& de formation du centre et, le cours que j¡¯ai suivi sur proposition du Directeur
des &chepches
sur la Sant¨¦ et les Productions finimales, s Cinscrit dans ce cadre.
Ce cours a ¨¦t¨¦ surtout ax6 autour de quelques g¨¦n¨¦ralit¨¦s sur lvimmunologie et les
techniques de d¨¦tection des diffkentes h¨¦moparasitoses animales par les methodes
directes d ooxamen de sangs: frais, de frotd;is de sang, de ganglions lymphatiques, de :Y: 4:
cortex etc.. . ld¡¯nbord, cnsuite les mbthodcs d e ciiagnostic s&oSsgiqw : immu2odiffusion
immuno¨¦lectro-phorese,
ii?XnuY~Gfluorcsocnce
directe et ELISA.
. . . / .*.
Tiuti~s ces techniqucsi ne pouvmt pas ¨ºtre traitees ckns ce rapport dont
l'objet est de rendre compte du d&oulement .!e ces cwrs seules celles ¨¦tant les plus
habituellement
collicit¨¦es dans la conduite des recherches sur ces malndies seront
expo&s. 3ans une premi¨¨re partie seront rsppelies quelques nations en immunologie,
re ?ues sous forme d ~expos&s et de conf¨¦rences tandis que 232s la deuxi¨¨me partie seront
abord& les m6thodes dz prapsration des diffirents rhactifs et les techniques de
ltiur utilisation dans lrs diagnostics scrologiques.
Dans una troisi¨¨me et derni¨¨re
partie seront tirdes le,- conclusions sur le cours.
1. - CSPECTS G%NEWUX SUR L'IMMUNOLOGIE
LVimmuno1ogi.e peut ¨ºtre d4finie comme ¨¦tant l?¨¦tude de lvimrnunit¨¦ vis-¨¤-vis
des bact¨¦ries, mais cette d6finition peut ¨ºtre ¨¦largie par analogie aux rCactions
sp&ifiques ou non ¨´
-19 u-.
n antigeen tendant ¨¤ ¨¦liminer des substances ¨¦trang¨¨res.
Les antig¨¨nes sont des substances qui r¨¦agissent sp¨¦cifiquement avec des
anticorps ou des r% ?epteurs cellulaires et sont capables dz stimuler une production
d'anticorps ou une rdaction cellulaire et la spkificit¨¦ des antig¨¨nes 2. provcquer
une r¨¦action im ? ?unitaire dZficit ltimnunog6n~kit¨¦,
Dans le syst¨¨me immunitaire, on
distingue deux types d'immunit¨¦
: 1¡ãimmunit6 ¨¤ mediation cellulaire et ltimmunit¨¦
humoralo,
I.l- LtImmunit¨¦
.
¨¤ kdiation cellulaire
Elle est nssurdc par la lign¨¦e zle lymphocytes I d6veloppes et muris par le
thymus et sp¨¦cifiqucmcnt sensibilist% venant au contact de l*antig¨¨ne et y agissant
par cytotoxiciY6 directt ou Lib&ation de m¨¦dizteurs non sp¨¦cifiques de lvantig6nc.
cette forme dtimnunit6 est transmiss ible nis(tment par des transferts de cellules
mais ne l'est pas par le s¨¦rum.
s. 2 - Lv Imrwnit¨¦ Humcrale :
Quant ¨¤ ltimmunit4 humorale, elle est medi& pw des mol¨¦cules sp¨¦cifiques
de l'antig¨¨nti, les anz;icorps produits ¨¤ distance de leur s_i.to dvaction et la produc-
tion de ces mol¨¦cules est assur¨¦e par les lymphocytes l3 q,ui sont dapendants de la
Zourse de Fabricius chez les oiseaux, mais chez les nami;if¨¨res, 15k2quivalcnt de la
Bourse de Fabricius demeure toujours inconnu.
. . . / l . .
¡°3¡±
1, - 3 - Les Antig¨¨nes
Ils pcuwnt Etre dCfinis comiic des mol¨¦cules qui, introduites dans un organisme,
induiscnt une &ponse immunitaire par le d¨¦clcnchument *Apun processus biologiqus impli-
quant en pwtioulier 1s prolif&ration ~31: cellules lympho! ?des et aboutissant ¨¤ la syn-
th¨¨se par ces dernieros de molkules de reconnaissance (anticorps ou &cepteurs), Cas
-nol&~lcs ont la. capacit& do se combiner spkifiquem¨ºnt in vive comme in vitro avec
1 I antigenis inducteur e t ¨¦limincr ainsi xx7 effet.
1. - 4 - LE~ Anticorps
Lorsqu¡¯un animal recoit un antig¨¨ne dans cwtaines conditions, ii peut produire
un antis¨¦rum spkifique ne rcagissant qu¡¯avec cet 2.3 tig¨¨na et contenant des prot¨¦ines
responsables de cotte reconnaissance. Gfl dit alors que ces protsines sont dou¨¦es d¡¯une
¡°fonction anticorps¡± et sfest cecrit¨¨re fonctionnel qui sert ¨¤ dkignw ces prot6ines
sous le terme ci9 znticcrps DJ encore dgune nani¨¦ro plus g¨¦n?rale ttimmunoglobulinestl qui
peuvent ¨ºtre isol5cs des autres constitua,nts de sang par t.!es techr?iquss qui seront d¨¦-
crites plus loin.
Ces immunoglobulines sont classks d ¡®aprk leurs caractkes physico-chimiques et
leurs crit¨¨res anti&nl.que s et sur la base dc critk-es &nkaczx, tous les individus d¡¯une
m¨ºme esp¨¨ce don& ont en commun diverses cat6gories d * iamunoglobulines
appel¨¦es isoty-
PCS. Chez l¡¯homme par exemple, on a defini 1G isotypcs r¨¦parties en 5 classes :
- Les IgG sont 12s immunoglobulines majoritaires du S&UI~ s ¡®attaquant <aux micro-
organismes et aux toxines et sont capables de traverser le placenta ;
. les IgM apparai,,,;
qnnt trks t ?t au d&but de In r<ponse immunitaire et constituent
donc la premi¨¨re barri&e contre les agressions mais disparaissent progressivement au
profit des IgG. Ils n¡¯onV pas unti capacit¨¦ transplacentairo mai s peuvent fixer le compl¨¦-
ment ;
- Les IgA sont trou& dans le s¨¦rum et dans les secrb b.L,,ns
:c; ,-
f colostrum surtout,
mucus intestinal oubronchique, lnrmcs etc...), ils participent 3.u revetement exerne du
corps ;
/
. . . .*.
-Les IgD : pr¨¦sente:; en faible quantite dans le S&Um et pouvant jouer un rjle de r¨¦..
cepteurs sur les membrerles dcslymphccytes ;
Les IgE sont les moins repr¨¦sentkzs des immunoglobulinos s¨¦riyues et
jouent
un r ?le tr¨¨s important en immunopathologie car elles sont Lt support des manifestations
d'hypcrsensibilit$ immkZate comme lc choc anaphylactique, l'asthme, lti rhume des foins.
1. - 5 - Le compl¨¦ment
C'est un systeme biologique qui intervient dans les procossus immunologiques en
se fixant sur le complexe specifique antig¨¨ne-nnticorps form¨¦, Il est compos¨¦ de 9 S¨¦-
Quencesde C1 & Cg agissant s6parement les unes les autres, et dont ltt C3 le plus abondant
produit le C3a qui augmente la permkbilit¨¦ vasculaire ¨¤ lthistaminc ot qui est en m¨ºme
temps chimiotactique pour les leucocytes polynucl¨¦aires. Le C b activ¨¦ lib¨¨re lc C
3
5 dont
le ($2 a les m¨ºmes propriet¨¦s que le C3a
tandi:;que le C5b active le Ce et le Cy qui par-
ticipe ¨¤ lri destruction .?o la membrane ?es cellules cnvahisseuses cntrainant ainsi leur
lyse.
1. - 5 - La r¨¦action Antigene-Anticorps
La mise zn urkence
*
clPun antigene et de son anticorps correspondant produit un
complexe antigCne-anticcrps qtii se traduit par 17union de ces d eu:: &l<ments dpo¨´ la no-
tion de sp¨¦cificit< de cette r¨¦action car un sdrum arki.-hCm;:ities de bovin par exemple
nz r¨¦agira qu'en pr¨¦sonce dVh¨¦maties de bovin uniquement et jamais en pr¨¦sence d'h¨¦maties
de mouton ou de chien. Il ne r&@rr non plus dtvent n'importe quel autre antigine mGme
si cet antigenc
est de provenance d'un bovin.
-% Elle subit l'influence de l'cnvircnncment at surtout des conditions thermiques
en ce sens qu'une temp&nturc ¨¤ 40¡ã peut modifier la confornation des antig¨¨nes et des
anticorps et enduire ¨¤ de fausses kactions,
- La teneur ~~lcvc;So en sel ou snlinite du milieu dans kquel se produit la r&c-
tion amoindrit sensiblement son sff'ct alors
"y1:: faible teneur es sel le favorise
- Elle J¨¦pend dans une tr¨¨s large mesure des conscntrations de l'antig¨¨ne et de
l¡¯anticorps et SC prokit tr¨¨s rapi:.iemcnt d¡¯o¨´ Ik neccssi% et ltimportance d'¨¦viter des
contaminations pouvant mener ¨¤ des r¨¦sultats tr¨¨s difficilement intcrprEtables.
- Son intensitb pe:.it ¨ºtre reduite en fonction de la variation du pH du milieu
dans lequel elle a lieu.
. . /. ..*
I I . - PARTIE PRATIQUE
Toutes les technique relat¨¦6¡®s sous cc chapitre ont et& d¡¯abord. pr¨¦sent¨¦es au
cours SGUS fcrne d¡¯expose avant dt ?tre miscscn application pretiqu ? au laboratoire.
II. - 1 m S¨¦paration des trypanosomes du sang
Elle 3 pour objectif 4 gextr3ire les trypanosomes du sang et B&+ pouvoir aussi les
ccnsentrcr en vue des pr¨¦parations d?ai:tig¨¨nes destin¨¦s aux test s¨¦rologiques et 3. ce
titre deux techniques sont utilis¨¦es,
a) la m&tnode de Lanham : clla consiste ?3 faire passer le ~a:12 infostc de trypanosomes ¨¤
travers une colonne DYGZ cellulose.
Les h¨¦milties ayant une f¡¯orto charTe n¨¦gative soni;
v
retenues par la colonne ct les trypanosomes charg¨¦s moins nCga tivement sont ¨¦lues et
collect¨¦s dans un b¨ºcher ;
Technique
m....-
- Fixer un entonnoir oi? porcelaine sur t!n support ou a d¨¦faut dc l¡¯entonnoir utiliser
corps d¡¯uno seringw ;
- ijett;rc du DEAC cellulose dilue avec du P.S.G. pH C.0 (500mgr do DE 52 pour 2 litres
de P.S.G.) dans l¡¯entonnoir ou le corps do la seringue puis laisser se tasser
- Placer un papier filtre :&oup& suivant lc dimension de lvuntonnoir et verser du tam-
pon P.S.G. dcssus pour ouvrir ?t23 pores du filtre, rincer la preparation, et laisser 2
rouveau
.
s e tasser
- Verser lentement le sang pr¨¦leve sur ru?ticoagulsnt et contenant les trypanosomes sur
le filtre selon la proportio n d Oun volume de sang pour 3 volumes de DEA
et laisser
s q infiltrer
- Verser 2 nouveau du P.2.G. et laisser ¨¦luor
. l¡¯¨¦lvat est recueilli dans un b¨ºcher plac6 sous la sortie
de 1 * en tonnoir
- Afin de s¡¯assurer du passage des trypanosomes prelcvcr r¨¨guli¨¨rement une goutte de
lf(-luaS, ¨¤ 1:% s o r t i e Je 1Varitonnoir et, observer entre ~XK+ 2.t lamelle au microscope et
d¨¨s que la prkencc d*h¨¦matic sera constat¨¦e arr¨ºter l¡¯op¨¦ration et transvaser le pro-
duit de la r¨¦colte dans un tube ¨¤ essai
- Centrifuger 6. froid ci, raiscn de 1, WO tourskn
pcn\\iant 15 m22 en vue r?e consentrer I es
trypanosom3.s ainsi r¨¦colt&.
l . . / . . .
-6-
II. 2 - Tec!lnique de maintenarce des trypanosomes au l~borstoirc
Les trypanosomes pcuvent Ztre maitenus soit sur des animrux vivants de labora-
toire : souris, rats, lapi.ns,cobayes ou sur C?c petits ruminants : imU~Gils, ch¨¦vre en in-
jectant ¨¤ ces animaux du sang contenant les parasites, soit sur des tsAts6 en les fai-
sant nourrir avec ¡®du sang dvun animal porteur (de trypanosim8ds,
soit sous forme corig&e
et conserv¨¦s dans lqazote liquide.
II. 3 - Cl ?nage et stabilisation des trypanosomes
-
-
II. 3-1 - Cl ?nage
Le principe du clEnege consiste A d6vcloppcr chez un animal une souche de trypa-
nosome dont la pOpUl2YiCXI qui en sera issw proviendra d vu~ seul et ;Gme trypanosome et
pour ce faire deux techniqzs pwvent ¨ºtre utilis¨¦es :
a 1 - la premi¨¨re consiste i proc¨¦c¡¯4r ¨¤ un.: sQrie do dilutions progressives du sang para-
sita partant de 108 trypano/!zl. pour deboucher vers une concentration de 1 trypsnosome/ml;
Pr6lcver un ml de cette 5ilution, lp injecter en 1-V. 5 une souris : 3p.r
I
la veine caudale
et suivre l¡¯¨¦volution rie la parasitemie
b) - la deuxi¨¨me td?chniqas quant ¨¤ elle, pr¨¦st?nt.e beaucoup glus de certitude par le
proc¨¦d¨¦ dqisolenent d¡¯un seul trypanosome i partir de la m¨¦tho..:.~ sl:ivant :
- pr6lever du sang infeste !c!e trypanosomes dons un tube h¨¦pwink
- ¨¤ l¡¯ai& dqun¨¦ aiguiil<S trCs f i n e , ~rClcv3r unr trlute petit: goutta _Ie sang et la d¨¦po-
scr dans le godet 11 q une kme crwse ou lr:m<: d p entomologie,
- Gposer quelques gouttes de &.y&~;1 tout w tour du creux
. I
,Je la lame afin ZP¨¦viter
1 qass¨¨chement de la goutte de sang et recowrir d¡¯une lamelle 22 x 22,
- examiner la pr¨¦paration au microscopt: et s 2 assurer qu 1 on rtca coi t qu¡¯un sel11 trypenoso-
Ei
me dans toute la 5r¨¦pzration etkel est le cas
- retirer la lamelle et ajouter une ou deux gouttes de glyc¨¦rol ¨¤ la pr¨¦paration pour
la diluer.
- aspirer la totulit¨¦ C~L cette prepar:tic;n lkns un¨¦ seringue T: insulin St injecter tout
le contenu en I.V. ¨¤ une souris par 12. veine caudale co3~ne pr&e<e:~mant
- garder 12 souris en &vage et procciider ¨¤ des examens quoti:lie:s Je sang en vue de con-
tr ?lcr la sortie de trypanosomes.
l . . / ..#
-7-
Dans lc; Cas d'Ui ? &sUltat poSitl ? tCUt IC? sang de Ccitte 3xris pCR.VP2 ?QV
prc%v¨¦ et cons.erG dans lvazcte liquide apr¨¨s avoir p&alableml;nt stabilis¨¦ les trypano-
somes qu¡¯il contient.
II. 3 - 2 - Stabilisation et crnservstion des trypsosoicas sns 1 t Azote liquide
----*
La stabilisation d.krit 1.q &tho?c, de conservation :!cs tryponosomes bans 19a-
zota liquide tout en &ita;flt de leur faire subir un choc pouvant conc!uirc 2 leur alter+
tion,
.. Prelever une quantit¨¦ de sane h¨¦pzrin¨¦ ¨¤ pwtir dpun donneur fortement parasitk( con-
sentration finale d¡¯h¨¦parinti 5-10 unitE p:li ml de sang;)
- Ajouter quelques gouttes r?e glycerol jusqu 'ZI une consw ?tration de lO%
- Laisser pendant 1511x2 pour ¨¦quilibrer
- Pr2ndre une ran&e de micr::kubes et ¨¤ l paide d¡¯une piYpctte prstecr , remplir chaque mi-
crotube ¨¤ moiti.6 (enviror: 70 oicrolitres/tube 1
- Laisser un cspncc vide aux &XX extr6mit¨¦s de chaque tube puis les boucher chacune avec
du plasticine
- transfarer les microtubes dans de petits tubes ¨¤ essai en matiere pl?.stique et intro-
duir~.; ¨¤ lPint4rieur un morceau DDE papier portant toutes les inbications relatives au pr¨¦-
l¨¨vement : nL, :lak, origine. Puis .:n se servant Gvunc grosse aig-uille pratiquer des
trous ¨¤ chaque extri$mit¨¦ C!U tube pour permettre l¡¯infiltration de lTazote liquide ¨¤ lPin-
t¨¦rieur
-- Introduire les tube:: ¨¤ essai ccntenw t les mic:wtubcs
c?ans une bx~W.lla en plastique
et X lar,se ouverture am&a&e a cet effet prtr un syst¨¨me cl9 iscl2tion, en la recourant C:l
d vune couche 2s plasticin~e ;!¡®uno eprzisseur tIP 1 cm envir: ,n wintanue tout autour avec du
sparadrap.
. 1$3int¨ºd,r la bouteille er: suspension dans le container G~nzotc~; liquide afin quvelle
soit enti¨¨rement recouverte par les vapeurs pendant 2 heures pour refroiC5.r
. Apr¨¨s refrcidissemcnt i;iTX~Sf¡¯5rCP lC:s tubes ¨¤ essai contenant les micrctubes clans les
canisters adu ccntainer dlazoto liquide.
Le transfert devra Ctre op6rC ¨¤ l¡¯entr& du container ou 32 UFiliSc?i?t
un bain d¡¯azote
liquide pour ¨¦viter un-: hussa de 12 teri:pSratu.r~~
.zt c?,rj&c: ?x.loi 7 ':q
*
'1X
.'
canisters sont plong¨¦s
enti¨¨rement dans 1 ¡®azote.
..* /
.*.
,*
c
- Extraire un micrctube, 10 rechauffer , le couper et Gposer une goutto entre lam? et
iamclle, puis crbservcr au microsccrpe pow s13ssuror de 13 survie tics tr ?p~nosx?es.
II. 4 - PREPARRTIOI\\T DPAN ?ISERUM
--.a-
lvinjection r¨¦p&t$e ¨¤ 'un admal d9une certaine dcsc dPimmunoglobulincs en prove-
ninw dpunG espke differer,tc 5 pour effet chez lvanin!al qui rer,cit cet entigone 1~ prc-
duction ?Panticorps specifiques dirig¨¦s contre ces irnmunoglobulines et clCsign?s sous le
nom d'anti-imrwnoglobulines
qu90n retrwve dans lc S&U~ de cet animal qui porte ainsi
15 ncm d9antis&um.
Technique : '1O : &ulsionner ¨¤ pwties ¨¦gales une solution d9immunoglobulines
titrant 20ugr/ml avec dc ?var:juvar,t complet de Frct8nd pnis injecter 2ml 5u prcduit ¨¤ la
plante du pied d'un lapin en rcpxkissnnt 19 d5c.t--: en deux endroits diff6rents (le ContrC-
lc ;ivunc benne Gmulsirtn peut svop&er e?l d¨¦p<>SZn t une g:jutte ilte cette Gmulsion dans un
b¨ºcher c,xter,ant de lpti~:u.
Paix le cas dtune r¨¦assite, 17. gwtte reste intacte et
fl9ttc 5 la sur I-,ce dce l" ?aii tandis quvelle fond et s& rlissipr w cas ,-le for: r¨¦ussite et
ainsi lvop¨¦rntion dcvrs
¨ºtre pcursuivid jusquv¨¤ lPobte:\\tion d7ur, bon r¨¦sultat)
20 : 15 jours apr&s &p¨¦tw 12 m¨ºme injection et xix m¨ºmes w:k¨´its ti vune 2utre ¨¦mulsion
faite avec cette fois-ci l'adjuvant incomplet & Freuni¡¯: et titrant 15 ughl.
3" : IF, jours apr¨¨s, l-! ~:le¨¹xi¨¨ne injection reprendre comme pwr lc? lereinjection
4O : IC jours apr¨¨s, pr¨¦lcvw environ 15ml iu .sc?nc de cc m¨ºme lapin pnr ponction veineu-
se, r¨¦ccl'cer 15 scrum et 1.2 tcstcr en immunodiffusion ;xd immuno&lectr~phor¨¨se pour d¨¦ce-
ler ¨¤ pr¨¦sence :<vanticorps anti-immunoglobulines.
II. -Ej- Il%lUWODIFFUS ?OI:
Le princirx ?e lvimmunodiffusion est la I+ctection directe d9snticorps contenus
clans un serum donn¨¦ en mettant cz Grum en contact avec lvZntig¨¨nc; pour lequel les xnti-.
corps sont rechcrch&s.
Technique
-
-
- Etder une couche d9agerosC ¨¤ O,'l5% sur la lame + 0,05% ~?e i%?J2 puis ldsser s¨¦cher
- Pratiquer 4 ou 5 creux a la su-fxe <fu ,gei
_ !!v2garr=se d'abord, et tout sutour i;e chacun
ci9eux ensuite ci-wsw bes puits <!Pur~ diam¨¨tre be;-.ucoup plus petit que celui des premiers.
. . . / . . .
- 10 -
- D¨¦poser ltantig¨¨ne dilu-2 dans chaque creux tandis que les s¨¦rums 5 tester sont dispo-
s¨¦s dans les petits puits situt
autour
- Incuber pendant 24 heres a 37 O Zans une boite de petri contenant O,O% de %a'42
- Lt?s rkultsts positifs c'est ¨¤ <ire les ~~~ru~~scontecarii;l~rlnticorps
s;kifique de l'an-
tig@ne se traduisent p7.r des arcs de precipitation visible-s 5 lqocil nu et dont l'inten-
sit¨¦ est variable selon la teneur du skwm en immunoglcbulines.
II. - 6 - IMMUI\\rO~LECT;30P!IORI7SE
-e-w
Le principe ds l:i~!ununo¨¦lectrophor¨¦se est le m¨ºme que celui de 19immuno5iffusion
¨¤ la diff¨¦rence que dans cette technique on fait migrer
l'enti.g&e dans une chambre
ilectrophor¨¦tique.
TSCHNIQUE :
Etaler une couche d'agwose 5. 0,15% et 0,01X de thiomarsalate
Creuser des puits en surface toujours dms le sens de la lOIT@JE.!A ? Cd3 12 lame.
D¨¦poser lqnntig¨¨ne Ans chaque: puits puis laisser migrw Ans une chambre slectropho-
retique pendant 1 nuit
II. 7 *m ISOLEklENT ET P¨¹RIFICpiTIG?! DES II+lMUNGGLO:';ULIP!i:L,
--- --
- -
.--
II. - 7 " 1, - Isolement das globulines
----l-P
La m<i;E?o(ie utilis¨¦es est 12 mi:thotle )?e pr¨¦cipitatioi: pr:r la sulfate JPnmmonium
qui permet d-e s+.rer 1~s i>lobulincs ou anti-j.mn¨¹n~olobulinas tics autres composants <lu
sang.
TECHNIQUE :
--
Prendre ~;n volume don& (le s¨¦rum auquel on ajoute goutte ¨¤ soutte un ¨¦gal volume
d'uiw solution satur6o c.ie sulfate dFammonium (soit SF;G gr NH4 SO21 en agitant tout dou-
cement. laisser 30 mn a 1 heure a la tely&ature ambiante Tdis cer!trifui:,sr il froid ¨¤
raison Ze 3.GGO tours/ ?w pandant 15mn. rcdisscudre le culot de centrifugation dans un
volume $, q eau ,:lis tj.ll& a<.;,: 1. YJ volume de s¨¦rum initial utilis¨¦. Renouveler la w&i.pi.ta-
tien une deuxi¨¨me puis u.nd2 twisikm fois guis cj.i.~oucfx~ 1~2 (qt?r~~-l' Culot cian> cl11
. ../...
- 11 -
PDS 5M PI-I 3,8 ¨¤ un v,l.w:-. 6;::~.1 a la moiti¨¦s du v?lumc- de s&um initic:l, Dialyser contre
le tampon PSS et v¨¦ri ?ier 1: prCscnce de .l~ammonium en m<lanC;eant
1 ml Zu rro?uit
.A
de
dialyse 2 un &g,al volumi: ::'unc soluti?n ? l:C!Sk de chlorure de bar:. ,m. L,L virage au trou-
bic de ce m¨¦lxge t¨¦moi;gw de ln pt&3cncc dpions ilfe
,
'
dmmonlum et r?ans co cas, 17: ::ia1yse
devra Ztrc poursuivie jusquf$ la rkaction n¨¦gative cfsst-5-s.!ire ltcbtention d'un mslan-
gc clair,
II. 7 - 2 - Purification des immunoglobul:int.:s
---.
Tandis que lz, pr&ipitaiAon p¨¦rmot :!tisvler la totalit¨¦ &s globulines s¨¦riques,
Z'autres techniques sont utilis¨¦es pour -5limir-w la sulfate ::?-dmmonium ou bien pour ot-
tenir ux, classe ou une subclassc dPirxxxx~globulines.
II. 7 - 2. 1 - Filtraticn sur gel
_I
Le principe consiste ¨¤ eluer 1~ substxnce desir&?+. travers une colonne de S¨¦pha-
dex G 25 par le grincipc ~~*cxploitation ('es diff¨¦rences dc <!imensions :?¨¦ mol<cuics pvr-
mettant de faire passw rapi~.:ement l.-~c*
cIU unes pendant que le p3ssaSe t'es autres est retar-
d¨¦.
TECHN ?OUE
- Mettre du gel de S¨¦phadcx G 25 pr¨¦ainblement &quilibr¨¦ avec un tampon TX3 SM 3. un pH
7,8 dans une colonne de chromztographic
v& laisser se tasser.
- Rincer la pr¨¦p aration en ajoutant du. P,C.S, puis laisser Q-outtor
- Verser lentement la solutic:1 Ue zlobulirws enx surface, ajouter du tampon PDS pour
diluer et laisser ¨¦lurr
- L*elu?t ccnstituant la fraction ~~Pimmunogl~~bulincs est recueilli dans des tubes et
chaque tube devra &re contr ?li peur v¨¦rifiw 1:: pr¨¦sence de xulfat¨¦ d7ammonium comre
pr¨¦c&!erment en ajoutant du chlorure de barium.
Ii, 7 - 2. 2 - Chr~matographie sur khangeur dvions
En faisant pousser une substance c? chnrlr;<: &ctrique dG?Yl& a tra-vers un gel ci
charge contraire, on cr:%: un effet de r¨¦tention de la substance par 1~: o;el sous forme
.*. /
..*
- 12 -
de liaison. Cette liaison gel-substance peut etre rompu: lorsq~~.'on ajouto un tampon ci?
charqe electrique de m$m<; nature mais plus forte quo celle r)e 1~. substance retenue.
Et c'est suivant ce pro&6 que les Io C,, Ig (ii2 et Ig ¡®1 Sont. isolk.
TECHNIQUE
_-
- Mettre du DB 52 k@X.5r~ 2 un pH 7,5 #avec du tampon ?O 5
4 id dans une colonne de
chronatogrzphic
connrct~k ¨¤. un collecteur et laisser se tasser.
- Ajouter la m¨ºme tampon pour rincer le contenu (le la cclonno 61; laisser egouter avec
le m¨ºme tampon.
Verser lertement la solution de glcbulines Cr~is 1;: colanna
. I
puis ajouter l!r Campon
PG4 et laisser ¨¦luer. Les IgQ2 sont ¨¦lu?&3 en premier lieu et sont recueillis dans les
tubes dispos& au fliVcZ:l CIIl COlleCtSlt.
- Ajouter du tampon P04 10 M pour faire elucr 10 premier pic correspondant alu 1 QG
J 1 jus-
q!i'¨¤ ¨¦puisement complet.
- Ajouter du tampon PO4 50 I! pour -avoir une derni¨¨re 6lution corxspondant ¨¤ un mslange
d'un ler gic d'J+C, et TgG2 puis d9un deuxi¨¨me pic dvIgM ot (391 p l
9 1
II. 7 - 2 - 3 - Chromatogrephic dPAffinit6
_I-^.--IIY--
Lc principe consisk ¨¤ coupler un gel appel6 mr:tri.cc: i: un ce1 biospki ?iquo
appel6 ligant ct capable de se lier &lecti&ment avec 1~. fr2lction
iluFon d¨¦sire isoler
d9une substance donke. Cette fraction peut constituer 1 P¨¦lfkknt ¨¤ retenir ou ?lorr
19¨¦l&~ent a rejeter. Dans le cas ou 19¨¦l¨¦ment ¨¦st ¨¤ retenir OJ alors l'el~me-nt ¨¤ reje-
ter. Dans le cas 06 1~6lCment est 5 retenir, l2 liaison avx li: ligt.iit devra Ztrc r¨¦ver-
sible afin de pouvoir 19;~iu~:r se:.1 apr¨¨s. Dans 1~: 5:s cc il dwra $tre ¨¦cwt¨¦, cette
revwsibilit¨¦ n'est plus neccsseire puisque seul l'&lSmont dkir& aura travers& la co-
lonne.
TECHNIQUE
m--.
- Prendre du se1 de S6phzroso constituant la mrt.ri.cc cci¨¹pl~¨¦ avec do lc? proikine A qui
est le ligwt.
- Equilibrer avec un tampon PBS 0,01 renfermant 0,2% ciPazide ci\\: sodim,
.*. /
. . .
- ¡®13 -
-- Mettre dans une colonne connectes ¨¤ un collecteur.
- Verser 12 solution $2 ;;lcbtilincs ;3t apr+s leur absorption totale pzr le gel faire ¨¦luer
avec du tampon NaH2 PG4 9,1 M pH 5,9, Pour obtenir le Ier Tic >'es IgG2
- Apr¨¨s le premier pic, a2outer du tampon AaH2P04 0,l Y pH 5,0 pour obtenir le second
pic des IgG,
Les 2 pics sont colloctEs s¨¦paremont et corksponkn t aux fractions IgG2 et IgG,.
La densit6 optique dt! chaque pic est d&tarmin¨¦e par une kcture au spectrophotom¨¨tre en
vue du calcul cIes taux de proteines skiques fractionn6es.
II. 8 - PREPARATION D9ZJJTIGENES
Les pr¨¦parations r!'antig¨¨nes utilis6s dans les Bpreuves s¨¦r?,lo,giques varient 2n
fonction dc la technique de diagnostic envisagee. Et c'est ainsi qw 13anti$ne destin¨¦
¨¤ la technique d9immunofluorescence
et compo& d ?une suspension de trypanosomes sera
cliff¨¦rent de celui de 17ZLISA cu les trypancsomes
doivent subir une desint¨¦grztion par
le proc¨¦r!¨¦ de la sonification,
II. a - 1 -Antig¨¨nes pour immuncfluorescence
-11_1_
- Saigner des animaux dont 1.~ sang est fo:rtez5nt parasit¨¦ sur anticr:agulant.
- Centrif+uger le sang ainsi reweilli ¨¤ 2.00 tours/mn pendant 15 mn ¨¤ froid.
- Verser les 2/3 du surnageant et recueillir lPinterphase.
- Diluer le surnageant au 1/2 avec du tampon P.S.G. pH 8,O.
- S¨¦parer les trypanosomes c?u reste du sa.rlg par la metho& ce lanhnm <¨¦crite plus haut.
- Centrifuger l'¨¦luat 2 trypanosomes recueilli a raison de 2.OGO tours/m ? pendant 20mfl
¨¤ froid pour CCX@entrer les paraSiteS
- prendre un volume dlcau physiologique repr¨¦sentant 10 fois celui du vclume de sang
initial et remettre le culot <je centrifugation en suspension
- Fixer de la maniere suivante :
1 volume de suspension de trypsyiosomes pour
2 volumes de fixateur puis placer sur un agitateur magnetique pendant 1 mn et laisser
fixer une
nuit ¨¤ - 2C¡ãC.
..a /
. . .
- 14 -
Composition du fixateur :
Ac¨¦tone r¨¦fri;;&C : 80 ml
FOPKGI.
: 0,25 ml
Nac1 ¨¤ c3 ¡®, 0
: 19,75 ml
(le fixL.
.r davra ¨ºtre une greparation extemporan¨¦e)
- Centrifuger a 1.500 tours/mn pendant 15mn ¨¤ + 4*C afin dP¨¦liminer le fixateur.
- Resuspendre le culot rie try¡®Janosomes dans d- lveau physiologique ¨¤ raison de 2 fois
le volume initial de sang.
- centrifuger ¨¤ 2 _
.5G3 tours/mn pendant 15 mn ¨¤ 4*C puis r¨¦p¨¦ter 3 fois cette op&ation
afin d¡¯eliminer enti¨¨rement toute trace de fixateur.
-. Recueillir le dernier culot de lavage ot suspendre dans du P .U. S. 0,Ol M pH 7,2 ren-
fermant 0,2 04 d 7azide de sodium.
- L¡¯antig¨¨ne ainsi pr¨¦par¨¦ , peut ¨ºtre stock¨¦ soit ¨¤ 4*C, soit ¨¤ la tempercture ambiante
apr¨¨s avoir 6t6 titr6 puis reparti dans des flacons de 1 ml.
II. - i7,. - 2 - Antig¨¨ne pour 1¡¯ELISA
-1_11_
- R ?colter et isoler les trysanos¨´mes comme prec¨¦demmect.
- Ar¨¨s centrifugation, remettre 12 culot en suspension dans un tampon tris Hcl pH 8, ?
contenant 1 iq de PMSF (Phenyl-m6thyl-sulfcny-fluorido} et 5 7~1 U91c. ¡°z-&tamide selon un
volume ¨¦gal au I/l0 du volume initial de sang et r&&er cette operation jusquv& lqob-
tention dvun volume ¨¤ -eu pr¨¨s de 20 ml. ci? culot do centrifugation
- sonifier 11 pr¨¦paration jusqu¡±¨¤ la lyse compl¨¨te Ces trypancsomes dans de la glace
avec un o.ppareil de sonificati ?n.
- Centrifuger le s0nics.t ¨¤ 3.00 tOU?S/lTXI per&nt 15 i!lIl ¨¤. 4*C.
- Recueillir le surnzi;eant, centri.fugw 5 nouveau ; 15,O::G twrs/mn pendant 30 mn 1A.s
filtrer le surnageant ¨¤ travers un filtre milliporc.
Ultracentrifuger le filtrat 2 40.000 tours/mn pendant 3G mn.
Recueillir lc surnagc:c?nt ct lu mettre ¨¤ dialyser contre un tampon tris 5rJ PI pH 3 ,O
puis lyophiliser le produit de dialyse ainsi obtenu.
- D¨¦terminer le taux de ?wt6ines, Fuis titrer ¡®et stocker a - 2OOC.
. . . / . . .
- 151
II. - 9 - PREPARATIOW DE CONJIJGUE POUR ELISA
Le test dtELI% requiert l'utilisation d'un conju=& ?r&par6 en couplant la mo-
l¨¦culc d'anticorps avec l'enzyme, horseradish peroxykse (H.Z.P.1 et, il est utilis¨¦
dans les analyses s¨¦rologiques dsune large gamme de maladies arlimaltts. Cette technique
est le plus souvent utilis¨¦e %tns les m&tho,:!es indirectes de ditection de 1: pr¨¦sence
d'anticorps sp¨¦cifiques ,q'un nnti&ne connu. La m¨¦thode de conjugaison decrite ci-
dessous conserne sp¨¦cialement la p¶tion dvun ccnju& dPantis&um do ch¨¨vre anti-
immunoglobulines de bovin, toutefois cette proc¨¦dure de conjugaison peut k%re utilis¨¦e
pour le couplage dtantigobulinw produits dans une large vari¨¦t¨¦ dPesp¨¨ces animales.
II.9 - 1. - Pr¨¦paration des immunoglobulines
.-
Les fractions immunoglobuliniques de l'antis¨¦rum sont pr¨¦cipftoes p-r une solu-
tion satur¨¦e de sulfate dvammonium ¨¤ 50%
- Les slobulinos pr¨¦cipit&s sont lav¨¦es deux fois avec une solution L:e sulfate d'amtno-
nium ¨¤ 50% puis dissout@ddans un tampon PO4 10 M pH 7,G
- Ensuite dialyser lwgement contre le m¨ºme tampon une nuit ¨¤ 4*
- Fractionner les zlcbulines an faisant passer le produit de dialyse ¨¤ travers une co-
lonne DEhE 52 cellulose (comme d¨¦crit prec¨¦detmnent)
- Tester en immuno&~ffusi.cn les fractions obtenues et colles qui prkentent des bandes
de. pr¨¦cipitation sont consentr¨¦es
- D¨¦terminer au spectrophotom¨¨tre le taux de proteines &cntuellement pr¨¦sentes dans
les fractions.
II. 9 - 2 - Pre-Laration de 1'Enzyme (OXYDATION)
w - . - - -
-..-
- Mettre 10 mn de HRP dans un fiole
- Ajouter 1,8 ml d'eau distill¨¦e
- Ajouter 200 ml d'une preparation toute fra ?che de sodium p¨¦riodate (32mgr/ml goutte
par gouttejet
laisser r&langer 9u fur et t ? mesur~avec un agitateur magneti-
que pendant 30 mn a la temperature
ambiante pour permettrelbxydation de lpenzymec
- Dialyser contre un tai!pon sodium acetate 1 M pH 4.4 pendant une nuit a 4O.
. . . / . . .
- 15 -
IX. g - 3 - Preparation du conjugu¨¦
- I - w - -
- Pren!re 12 Ml de 13 soluZ.on dpenzym~tr ainsi obtenue auxquels on ajoute 2ml de tampon
carbonate 0,2 M pH 9,G.
- Ajouter 30 mgr de In sclution d'immunozlobulines (proportion dpl part dfenzyme pour
3 parts de globulines) et laisser melanger pendent 2 heures 2 la temp¨¦rature ordinaire.
- Ajusttir le pH de 1~. sclution ¨¤ 7 ,2 mec du Na2 1-I Pc),, il,1 m et laisser ¨¤ 4O pondant
1 nuit au repos.
- Bjouter 2 ml dsune solution frniche 'de glycine (rl mgr f.1~ ,r;lyc,inc dans IDOml de PBS
fJ,Ol M pH 7,2) ou borohydrate de sodium et laisser ,'i ncuvoau a~1 repos penclant 2 heures
a la tcmpirature ambiante.
- S¨¦parer 1~ conjug& de prot6incs du rGsti2,
en le faisant p:zssor ¨¤ travers une colon-
ne s¨¦phadex G 100 apros une nuit de dialyse,
- Filtrer l'¨¦luat ainsi recueilli 5 travers une membrane filtranto O,45 u et mettre
dans une bouteille sombre pour prot¨¨ger contre la lumi¨¨re.
- Ajcuter 0,25 ml dgazi3e de sodium pour la consentration finale
- Filtrer puis stocker ¨¤..2V"
Conjugu¨¦ pOUY immunofluor¨¦scence :
- - -
Le conjugu¨¦ pour 1~ :ests dgimmunofluorascence est prGpar6 ¨¤ partir dOun coupla-
ge d~immunc~lobulines avec 19isnthiocy~nate du fluorescoinc.
- Prendre un volume l!onx~C: de solution de prot¨¦ines titrant IF msr/ml et lt: diluer dans
un autre volume 2e tampon carbonate O,O5 M pR Ij,6
- Prendre: lt: fois le volume du m¨ºme tampon de .%.lution des immun{o@obulin,:s et dans
lequel on diluera 13 fluorcsceine ¨¤ raison cl91 mgr/ ml de tampon.
- Dialyser la solution de protkincs pendant une nuit 5 Lt0 contre du tampon carbor;ate
bicarbonate pTI 9>fi.
- Transferer la membrane de dialyse contenant les pwt¨¦ines clans la solution de fiuo-
resc¨¦ine et proc¨¦der ¨¤ une seconde dia1ys.e de 24H pour faire la conjugaison proprement
dite.
.". /
. . .
- F i l t r e r a tiTVerS une csl~mne ie &phatlex G.56 pwr $lirnin::r lSds traces d e fluores-.
ceini; yi.on fixiks.
Les dluats c!ont ce ra?pwt est CWlpi~iS entre? 2,s <.:t 7 constituent lt-s fractions
5 retenir et ;rinsi tous les autres se ¡¯sI.tuant hws <!e ces bimittis s:mt ¨¦limirGs,
- Faire passer 5 travers UI? ?,iltre et njwter C!,?j d 9iizi.k C:C SGdi¨¹m $!iY d i l u e r 3J 1/2
avec cte la glyc¨¦rine pure, puis titrer et stocker ¨¤ -20¡ã
II. 70 - TECHNIQUES DE DIACNDSTIC SEIIOLC)GIQUE
---.-
L t im3-wnofluore~c¨¦nce indirwte et 1¡¯ELISrS. sont ¨¤ l¡¯heure act:uell~ lzs deux m&
tho=les 3e diagnostic
s¨¦rolo,~ique 1~s plus utilis¨¦es e:~ raison de leur sensibilit¨¦,
IltJ
leur aspect prc?tique permet tan t 4 *effCctger i:e@d 7dnlysas ~.!ifP¨¦iG?S c;t surtout
1:~ leur hautesp¨¦cificit5.
II. - 10 Y> 1 - Immunof luorescencc
Lc principe consiste 5 mettre en ¨¦vid ?r!ce la grGscncc iPanticorgs scriques per
contact gdvun s¨¦rum suspect avez lv 7ntiC;¨¨nc agent de 1,: mal3:lic consi~&5r&, r¨¦&16 en-
suite par un antis¨¦rum sp¨¦cifique de ce s&um conjugu:: CI 1. s iscthiocyancte de fl¨¹wos-
chine.
TECHNIQUE
- Diluer lDantig¨¦n~~ dans un tsmpon I?X O,Gl K pH 7,% ot lt: ?¨¦posw claw 12s cercles
~dpun~ l?.mc ¨¤ imz?unafluoroscence (di~peniblc c!nns li: mwch;i puis lG.sscr s¨¦chw 15 ¨¤
29 mn 5 In ternp&uturc zm!d.c33t,e 3u 5 5 10 mn (A ?¡°OC.
-3 ;¡°:bsorber l e s&um d,ans ;lu lysat de lymphtcytes ¨¤ raison d¡¯un vOlurne C!e S¨¦rUm pO3r
39 volumes cte lysct et laisser 3cSm-1 2~ la ten?p&ature a ?:bi:xte.
sil Dilutiw ICS s¨¦rums 5 testar i-ians !du tzqon ¡®E%S pH 7,3 ad~!itionnk de &PU~,: +lbumine
de bovin ¨¤ 2 74.
-8¨¦poser dzns C!12tTlleiti CrPclc: 25 ul de Jilaltion 6.e s&um corrcs~cn~~nt et lzisser 39 mn
en atmosph¨¨re humide 5 1~ tunp¨¦raturo ambiante.
Y Monter une 1c:melle 22 x 59 5 l¡¯r?i:!e r17un5 ?r6parntion ?i parties +$.a de r$.yc¨¦rini;-
et PBS gE; 8 ,a3 guis lire :L*u mi ?rcmcope ; ultraviolet.
Les rt&t&is positives sont r& ?¨¦l¨¦es pZti2 une flUoresCc?nc0 des trypanosomes
constituant 19antig¨¨no et Sur L:uquc:i.s s¡¯est ?ix¨¦ l¡¯aritico;-;JS li6 rli 17z9tis¨¦rum marqu¨¦.
Les r&xtions n-a¡¯,¡®,;al;ives par contre sont sombres.
II. 10 - 2 - ELIS;1
Le Crincipe de 1- ? ELISA comme celui de 1Qi?INiXX¨¹:'lUOK2sCWX~ d¨¦crit ci-dessus
consiste ¨¤ d¨¦cel.cr 13 prkence 6 9 anticcrps ou d ¡®anti.$ncs circulacts ;:~~~~S un s¨¦rum
cOnsicGr4 2ar le m¨ºme s~stkiz de r6aetion antigCrX-anticcv::s r¨¦v¨¦l¨¦e ensuite par une
substance chromOg&e
II. lG - 2, - 1 - D¨¦tection d¡¯anticorw
p.-
-I-
Cettt teclaiquu sert EL
d¨¦tecter des anticorps cirxukwts dans un s&um sus-
pect permetttlnt i.imi C~:E: 3ire si l¡¯animal. a ¨¦tt< au mcins unu foi,s eii contact nvec 17an-
tig¨¨ne cl.~ 1~. malx!i ? recherch¨¦e au mA>me!:t du pr¨¦l&emcnt c ?yazt alors provoqu¨¦ la pro-
duction d ganticorp; 5irigis contre 1 Vantig¨¨nc de cette mnladie,
. . . / . . .
TECHIXQUE
- Sensibilisation de plaques de microtitragc :
ou 20 ugr/ml
- Diluer lqanti&x~ 5 1: cvnsentration requise : 5 u&iil 1C: uer/ml/avec u:x solution
de P13S O,Ol M ?H 7¡®2 contenant 3,22X d!azide de sndium
- Emplir chaque puits do la plaque avec 100 ul dfantiC;¨¨nti c?iluC,
%- Incuber la plaque ¨¤ 37O pendant 2 heures puis transf&r h 4" pendant une nuit.
- Verser lqanti&x: puis l:.vcr 32s pl-ques 3 fois successives avec du tampon de lavnge
mGlang6 a du tween 20 ¨¤ S,l% : remplir chaque puis jusqu'aux bords avec 1~; tampon,
laisser 3 - 5minutes en contact puis verser et s¨¨chor,
- Rloquor 11~ parois ~10 la p?:quc avec une prot&,x de provenance diff¨¨rcnte de celle
de lfcspGce aximlfl~ pour l::queile 1~ &rum est nnalys¨¦ (albumine C?C ch¨¨vre, moutxn,
lapin, etc...) ¨¤ unt concentration de O,2 01.D -lr
L.i distribuant 200 ul du tampon de blocage
dans chaque cupv.1~ et incuber pendant 30 mn ¨¤ 37O. '.coutcfois, ce blocage peut i:tre
omis mais dans ce cas, le s¨¦rum ¨¤ tester devra Vtre Cil& dans un tampon ¨¤ O,F;n/o de
prot¨¦ine, L'inter¨ºt dc cette pratiqu:>L est C!i-; saturer lr: plaque un f?.isant occuper tous
l¨¦s pores laiss¨¦s libres p-r la prot¨¦ine de sorte ¨¤ Eviter toute 5~~5s~; r¨¦action,
Y Remplir 1;: plaque avec des s¨¦rums ds: contr6l.e ct 1~s s&ums j tester dilu<s ¨¤ I/l00
avec du tampon de diluts.on nuis incuber 3 37O peudant li heur? GI. ¨¤ la temperature am-
biante pendant 2 heures.
Il est en outre rccomrxand6 de tester aussi bien 12s serums do contr ?le que ceux
destin¨¦s t: ¨ºtre analys&s en dr;ublc c'est 5 cliro cn utilisent 2 puits par s&um, et de
remplir 1~ rang¨¦t; 1 de A h H avec du tampon de dilution si on doit utiliser unlecteur
multiskan pour mesurer les densit¨¦s optiques
- Laver 1~. plaquti 3 fvis successives com~fie pr¨¦c¨¦demment
- kjou%er lC.6 ul de conjugu6 dilu¨¦ en fonction de son titre de travai* dans du tampon
de dilution et incuber pendant 1 h ¨¤ 30" ou 2 heures ¨¤ la tempdrature ambiante,
- Laver 3 fois de suite de la m¨ºme mani¨¨re avec du t.ampon de lavage et s¨¨cher.
- Diluer le substrat G-phenylendiamine & une consentration do 1 mgJm1 dans un tampon
citrate G,G5 M pi-I 5,5 auquel on a ajoutL 1% dvhydr?,$ne pcroxydose.
- Remplir tsus 1s.~ puits .wec If:! ul de cette preparztion pour r¨¦v¨¦ler et incuber 15 ¨¤
31kn S. 37O et dans lPobscurite puis arr¨ºter la r¨¦action en a,j%tant 25 ul d*acide sul-
furique 2 N dans chaque pui+ .
- Mesurer l*absorbence au spectrophotom¨¨tre et i une vitesse de 492 nm
II. 10. 2 - 2. - D¨¦tection tks Antig¨¨nes a Partir d'Anticorps Monoclonaux
.I_.--
Un anticorps mc>no&.kal est un anticorps produit 2 partir d'un seul clone de
cellule. Par consSquent, 52 sp¨¦cificit¨¦ est qufil est diri.g@ vers un ¨¦pitope ¨¤ l'oppo-
s.5 de lvsntis&ua produit chez les animaux par immunisation qui contient un melange
d'anticorps dirig¨¦s vers plusieurs ¨¦pitopes de lvanti&ne immunisant. En raison de
cette specificit6, les antigitnes monoclon ?ux constituent un excellent moyen pour 10s
analyses de m¨¦lange d9anti&nes en vue d'identifier et de purifier les antig¨¨nes qui
conviennent pour un besoin donn¨¦.
L'application dos anticorps monoclonaux est en hausse non seulement ¨¤ cause de
leur grande sp¨¦cificit¨¦ mais aussi la facilit¨¦ selon laquelle ils peuvent Gtre standar-
dis¨¦s et le fait que les cellules hydrides produisant les anticorps monoclonnux peuvent
¨ºtre conservk de mani¨¨re permanente.
Ces ar;ticorps monoclonaux d*utilisation r¨¦ct;nt ?,pormetterrt la d¨¦tection dPanti-
g¨¨nes circulants dans le s¨ºrum d'un animal donn¨¦ et d9avoir ainsi des pr¨¦cisions sur
lvktat pathologique de cet animal ¨¤ la p¨¦riode tixacte selon laquelle le prel¨¦vement
de sang a 6t¨¦ effectu¨¦.
. . /. ..*
- 21 -
La technique d¡¯utilisation des anticorps monoclonaux dans les m¨¦thodes de
diagnostic s¨¦rologique est ¨¤ peu pr¨¦s semblable ¨¤ celle d¨¦crite pour la d¨¦tection
d q anticorps pzr ELISA.
II. 10, - 2 2 - 1 - Fr¨¦parakion d9anticorps Monoclonaux
a) Immuniser un animal (rat- souris etc . ..) avec lvantig¨¨ne qu¡¯on veut rechercher dans
s¨¦rums ¨¤ tester et v¨¦rifier si la production d¡¯anticorps est abondante en utilisatn
par exemple la m¨¦thode d¡¯immunodiffusion
et en cas de r¨¦action positive
b) sacrifier lvanimal, pr¨¦lever fa rate puis la macerer en vus de pouvoir fusionner
les cellules spleniques avec des cellules cencereuscs incapables de synth¨¦tiser leur
propre immunoglobuline et la proportion cellules spleniques : cellules cancereuses
est de 10 : 1
c) La fussion est assur¨¦e par du polycthylene glycol ou du SandiVirus. Dans LE? cas
d¡¯une bonne fusion la cellule cancereuse sPapproprie le pouvoir immunog¨¨ne du lympocy-
te.
d) Distribuer le m¨¦lange de cellules ainsi obtenu dans les puits d¡¯une plaque de cnl-
ture tissulaire.
e) Faire pousser les cellules pendant 10 ¨¤ 14 jours dans un milieu de culture selectif
qui permet la survie des cellules fusionnees tandisque celles rest¨¦es libres meurent.
f) Remplacer le milieu par un autre quifavorisele d¨¦veloppement ra pide des cellules,
avant de tester la pr¨¦sence dPanticorps contre l¡¯antig¨¨ne immunisant,,lc choix du test
ayant ¨¦t¨¦ op¨¦r¨¦ avant de proc¨¦der ¨¤ la fusion des cellules.
g) Les cellules cortenues dans des puits dont le surnagent compos¨¦ du liquide de cul-
ture pr¨¦sentent, urw activit¨¦ anticorps sont ensuite transf¨¦&s dans des flacons de
culture tissulaire et d¨¦velopp¨¦es.
1) Les cellules ainsi d¨¦velopp¨¦es sont ensuite cl ?n¨¦s par la m¨¦thode de dilution ou
en utilisant
de 19agarose. Ensuite on termine avec une population de cellules prove-
na:?t d¡¯une seule cellule appel¨¦ cl ?ne de cellultis. L¡¯anticorps synth¨¦tis¨¦ par ce cl ?ne
prend alors le nom d9anticorps monocl ?nal.
l . . / . . .
- 22 -
II. 10 a* 2-2 . . TECHMIQUE DE D!ZTECTTON DES ANTIGENES CIiiCULA?J'B
- ------.
I-.--e
Le test peut Ztre effectu¨¦ sur une plaque ¨¤ micrctitra~e pr¨¦alablement sensibi-
lis¨¦e par l'anticcrps monocl ?nal pour lP&tude d'un grand nombre de &runBou dans de
petits tubes ¨¤ essai dans le cas de diagilostic a titre individ!!el.
Lorsque 19antig¨¨ne est pr¨¦sent dais le s¨¦rum ¨¤ tester, cet an&--¨¨ne est retenu
par l'anticorps et lrs ¨¦l¨¦ments non fix¨¦s sont ¨¦?.iminRs par lnvage, Pour &v¨¦ler la fixa-
tion de lvantig¨¨ne, on ajoutc le m¨ºme anticorps qui a servi a se~isibiliser la p ?aauc
mais cette fois-ci conjugu¨¦ ¨¤ une enzyme qui va se fixer ii lPantig¨¨ne et former ainsi
un complexe. Cette combinaison antig¨¨ne-anticorps est ensuite r¨¦v¨¦lk par addition dpun
indicateur appropri¨¦, J.Jn chan,gomcnt de couleur se produit p;ir un virage au vert do s¨¦-
rums positifs alors que leoL1 s¨¦rums n&gatifs restent claires, La lecture de la densit¨¦9
optique des plaques au spectrophotom¨¨tre donne d:?s indications sur le pourcentage d'an-
tig¨¨ne pr¨¦sent dans l*¨¦chai~tillon.
1 - Sensibiliser 12 plaque avec 1¡ãanticorps monocl'kl
2 - Laver avec du P.U.S .
3 - Ajouter 50 ul de s&um ¨¤ tester et laisser incuber pendant 15 mn ¨¤ la temp&
rature ambiaato
4 - Vider la pieque et laver avec du tampon do lavage
5 - Ajouter 1GG ul i,e conjugu¨¦ et laisser incuber 15 mn ¨¤ la temp¨¦rature ambiante,
6 - Laver et rincer 3 fois
6 - Ajouter 100 ul de substrat et laisser incuber pour obtenir lc, coloration.
Les serums positifs sont color¨¦s en vert tandis que 1;~ n¨¦gatifs restent ciaires,
. . /. ..,
- 23 -
COMCLUSIOM
Les cours suivis pendant la p¨¦riode qu¡¯a dur¨¦ le stage ont permis non setile-
ment d¡¯enrichir les connaissances th¨¦oriques dans les domaines scientifique et techni-
que mais surtout de manipuler des appareils de laboratoire hautement perfectionn¨¦s et
de pratiquer des m¨¦thodes de diagnostics s¨¦rologiqutis de pointe.
Le d¨¦tection des antig¨¨nes circulants ? partir d¡¯anticorps monocl ?nux qui en
est la plus r¨¦cente pr¨¦sente un avantage certain puisqu 9~Lle pcrmtt dPeffectuer des
diagnostics tr¨¨s pr¨¦coces en ce sens que leur pr¨¦sence dar s le s¨¦rum est contemporaine
¨¤ le maladie. la d¨¦tection des anticorps quant t¡®r elle, n9est possible q¨¹e doux semaines
au moins apr¨¨s qu.e la maladi¡¯~tr se soit install¨¦e et et peut se Prolonger jusqu¡¯¨¤ 3 mois
apr¨¨s la gu¨¦rison de Ilanimal.
De telles techniques repr¨¦sentent donc un outil tr¨¨s utile da:ls 12s m¨¦thodes
de diagnostic s¨¦ro7ogiq¨¹ e i cause de leur rapidit¨¦ d9ex¨¦cution et surtout de 12 fiabi-
lit¨¦ des r¨¦sultats quvils donnent.
Les autres techniques de laboratoire ¨¦tudi¨¦es dans le m¨ºme cours (pr¨¦paration
de r¨¦actifs surtout) offrent ¨¦galcmknt un int6r¨ºt s ?r car m&k si certains de ces r¨¦ec-
tifs sont disponibles dans lu march¨¦, Leur prGparation sur place permet de mieux mai-
triser leurs perforrn~zwzs,
Cependant, la mise en application de toutes ces techniques pour la plupart
requiert l¡¯utilisation au minimum dPun mat¨¦riel. de haute pr;rfection qui doit consti-
tuer une mesure d¡¯accompagnement ¨¦troitement li¨¦e, m¨ºme si des accomodations peuvent
¨ºtre op¨¦r¨¦es au niveau de certaines ex¨¦cutions pratS.ques.
l . . / . . .
. 24 -
Pendant tout le temps qu9a dur¨¦ le cours nous avons et6 Ifobjet drune attention
toute particuli¨¨re de la part des autorit¨¦s de LOILRAD et ¨¤ ct: sujet, nous tenons ¨¤
adresser nons vifs remerciements :
Au Dr. GRAY Directeur de 191LRAD pour lvaccueil chaleureux qu¡¯il nous rl. r¨¦serv& et le
suivi conskant qu9il a su assurer au bon dkoulement du stage.
Au Dr. Jim LEMMUJ, Coordonateur de l¡¯unit¨¦ de formation pour 19e:ccelente organisation
et la richesse du programrk0 de cours et surtout 19assi~tance continue qu¡¯il a toujours
eue ¨¤ notre ¨¦gard.
Au Dr. MUSOKE, Directrice du cours pour sa disponibilit¨¦,
son d¨¦vouement et sa modestie
qu¡¯elle n¡¯a jamais m¨¦nag¨¦s afin de nous assurer un s¨¦jour tr¨¨s riche dqenseignements.
Au Dr, Mody TOTJRE responsable des relations scientifiques avec LES pr:ys francophones
pour l¡¯int¨¦ressement qu¡¯il a manifest¨¦ ¨¤ l¡¯organisation et au d¨¦roulement du stage,
A tout le personnel scientifique et technique de lvILRAD qui a t¨¦moign¨¦ d9un haut ni-
veau de connaiss¡®axes necessaires ou parfait djroulement des cours.
A tout le personnel administratif pour les facilit¨¦s accord¨¦es ¨¤ toutes nos sollicita-
tions quotidiennes.
-1"11-~~~~-"
I\\IINIST?ZRE DU DEVELOPPEt%NT RURAL
INSTITUT SENGALAX DE RECHERCHYS
AGRICOLES (I.S.R.,I.)
-wm--...m-LIPI
DEPARTEMENT DE RECHERCHES SUR LZS
PRODUCTIONS ET LA SANTE !iISIMf&ES
~"m.~d~~~1~--...
LOBORATOIRE !<JATIONAL DE LPELEVAGE
ET DE RECHERCHES VETEXINKIRES
B.P. - 2G57
DAKAR - HANN
COURS SUR LES DIAGNOSTICS DES HEMOPARASSTOSES
ANIKLES hVYC INSISTANCE SUF LI+S
TRYP?,NOSOt?IRSES OiXiWlSE PAR
L'ILRAD DU ?w AU 26 MAL 1989
PFF
\\.i. .
No 53,'PARASITO.
SEPTEMBRE 1989,
P L A N
INTRODUCTION
I- ASPECTS GENERAUX SUR L D IMHUNOLOC;IE
1" 1 " L t immunite ¨¤ media tion cellulaire
1- 2 - L f immun ? t¨¦ humcr&>
I-3 - Les antig¨¨nes
I-4 - Les anticorps
I-5 - Lc co@erner t
II- 1 - SEPAHHTION des trypanosomes du sang
II- 2 - Technique de maintenance des trypanosomes au laboratoire
II- 3 - Cl ?naga et stabilisntion des trypanosomes
II- 3-1 - c16nage
II- 3-2 - Stabilisation et conservation des trypanosomes
dans 1 D azote liquide
II- 4 - pr¨¦paration d t antiserum
I I - 3- Immunodiffusion
I I - 0 - Immuno¨¦lectrophor¨¦se
II- 7 - Isolement et purification des immunoglobulines
II- 7 - 1 - Isolement des globulines
II- 7-2
- Puri ?ication des im~~unoglobulines
I I - 7-2-l - Filtration sur gel
I I - 7-2-2 - Chromatographi,-5 sur ¨¦changeur d¡¯ions
II- 7-2-3 - Chromatcgraphie dPa.ffinit¨¦
I I - a - Fr¨¦pzr$.tion d 7 antig¨¨nes
II- 8-1 -
Antig¨¨nes pour immunsfluorescence
II- 8-2 -
Antig ¨¨nes pour 1¡¯FLISA
II- g - Pr¨¦paration de conjugu¨¦ pour l*ELISh
I I - Y-1 -
Pr¨¦paration des iwdnoglobulines
II- g-2 -
Pr¨¦paration de 1 p er.zyme I Oxydation)
*a. / . . .
II-g-3- Pr¨¦paratiw crie conjugu¨¦
II - 10 - Techniques <e c!iagr?ostic s&ol@qae
II - 10-l - Irimunofluorescence
-s
II - 10-2 - ELISA
II _ 10-2-1- D¨¦tection dPanticorps
II - yi-J..,24- Detection des antig¨¨nes ¨¤ prtir dvacticorps monoclonaus
II - IO-2-2- Techniq.le de de~ecticn c?3aiiti$mes circulants
CONCLUSION
-III-
REPIJZRCIEHWTS
--.m.-.---
INTRODUCTION
Le d¨¦veloppement ¨´e l¡¯industrie animale africaine a ¨¦t¨¦ de tout temps entra-
,
vc par les ~robl¨¨mkX do pathologie et surtout les methodes irrationnelles de $?Stion
des troupe2ux qui ne sont ~33 toujours orient¨¦e s vers un objectif de production maxi-
mum. De nos jours, beaucoup de maladies virales ou ba ?teriennes economiquement impor-
tantes peuvent. ¨ºtre facilement contr21¨¦es
par la m¨¦thode de vaccination. Cepend ?nt,
1s situation est tout ¨¤ fait differente pour ce qui concerne 11~~ h¨¦moparasitoses ani-
males parce qu¡¯il nlcxwL
iste aucune vaccination approuv¨¦e et efficace pour ce groupe de
maladies S
LgILRAD s9est donc vu assign¨¦ comme premier objectif de d¨¦velopper de mani¨¨re
plus certaine desmesures de contr ?le officacee LI et ¨¦conomiquement possibles des deux
plus importantes malndies du rhoptel que sont : la trypanosomiase animale africaine
et la l¡¯heileriose ¨¤ theiloria parv.: ou la fi¨¨vre de 12 vallk du Rift.
Ces doux m2ladies sont responsables de la mort d9,apprcxim~tivement 3 millions d¡¯ani-
maux p3r an en Afrique et 12 fi¨¦vre de la vall¨¦e du Rift ¨¤ elle seule est accus& de
la mortalit6 de 500.000 animaux par an en Afrique de l¡¯Est. Pour rztteindre donc cet
ohjcctif, 1~ILRAD dont le finysctement est support¨¦ par le Grou ?e Consultatif pour 12
Recherche agricole intc;rnr~tionale/¨¦quip~ t, de r;mt6riel de haute. performance et d¡¯un
personnel scicntifiquc et tcchniquc tr¨¨,= qualifi.6 en faisant ainsi un la50ratoire de ::;
r¨¦f¨¦rence. En vue de rspsndre 5. son second objectif qui est la forniztion, un progranlme
de cours bas¨¦ esscntiellemcnt sur iw r¨¦sultats acqui.s par les chercheurs et techni-
ciens et les innovati.cJns dans les m¨¦thodes de travail utili& d¡¯une part, et 19exp¨¦-
riencc personnelle des urs o: &zs autres d¡¯autre part est organis6 chaque annge par
lgunit& de formation du centre et, le cours que j¡¯ai suivi sur proposition du Directeur
des &chepches
sur la Sant¨¦ et les Productions finimales, s Cinscrit dans ce cadre.
Ce cours a ¨¦t¨¦ surtout ax6 autour de quelques g¨¦n¨¦ralit¨¦s sur lvimmunologie et les
techniques de d¨¦tection des diffkentes h¨¦moparasitoses animales par les methodes
directes d ooxamen de sangs: frais, de frotd;is de sang, de ganglions lymphatiques, de :Y: 4:
cortex etc.. . ld¡¯nbord, cnsuite les mbthodcs d e ciiagnostic s&oSsgiqw : immu2odiffusion
immuno¨¦lectro-phorese,
ii?XnuY~Gfluorcsocnce
directe et ELISA.
. . . / .*.
Tiuti~s ces techniqucsi ne pouvmt pas ¨ºtre traitees ckns ce rapport dont
l'objet est de rendre compte du d&oulement .!e ces cwrs seules celles ¨¦tant les plus
habituellement
collicit¨¦es dans la conduite des recherches sur ces malndies seront
expo&s. 3ans une premi¨¨re partie seront rsppelies quelques nations en immunologie,
re ?ues sous forme d ~expos&s et de conf¨¦rences tandis que 232s la deuxi¨¨me partie seront
abord& les m6thodes dz prapsration des diffirents rhactifs et les techniques de
ltiur utilisation dans lrs diagnostics scrologiques.
Dans una troisi¨¨me et derni¨¨re
partie seront tirdes le,- conclusions sur le cours.
1. - CSPECTS G%NEWUX SUR L'IMMUNOLOGIE
LVimmuno1ogi.e peut ¨ºtre d4finie comme ¨¦tant l?¨¦tude de lvimrnunit¨¦ vis-¨¤-vis
des bact¨¦ries, mais cette d6finition peut ¨ºtre ¨¦largie par analogie aux rCactions
sp&ifiques ou non ¨´
-19 u-.
n antigeen tendant ¨¤ ¨¦liminer des substances ¨¦trang¨¨res.
Les antig¨¨nes sont des substances qui r¨¦agissent sp¨¦cifiquement avec des
anticorps ou des r% ?epteurs cellulaires et sont capables dz stimuler une production
d'anticorps ou une rdaction cellulaire et la spkificit¨¦ des antig¨¨nes 2. provcquer
une r¨¦action im ? ?unitaire dZficit ltimnunog6n~kit¨¦,
Dans le syst¨¨me immunitaire, on
distingue deux types d'immunit¨¦
: 1¡ãimmunit6 ¨¤ mediation cellulaire et ltimmunit¨¦
humoralo,
I.l- LtImmunit¨¦
.
¨¤ kdiation cellulaire
Elle est nssurdc par la lign¨¦e zle lymphocytes I d6veloppes et muris par le
thymus et sp¨¦cifiqucmcnt sensibilist% venant au contact de l*antig¨¨ne et y agissant
par cytotoxiciY6 directt ou Lib&ation de m¨¦dizteurs non sp¨¦cifiques de lvantig6nc.
cette forme dtimnunit6 est transmiss ible nis(tment par des transferts de cellules
mais ne l'est pas par le s¨¦rum.
s. 2 - Lv Imrwnit¨¦ Humcrale :
Quant ¨¤ ltimmunit4 humorale, elle est medi& pw des mol¨¦cules sp¨¦cifiques
de l'antig¨¨nti, les anz;icorps produits ¨¤ distance de leur s_i.to dvaction et la produc-
tion de ces mol¨¦cules est assur¨¦e par les lymphocytes l3 q,ui sont dapendants de la
Zourse de Fabricius chez les oiseaux, mais chez les nami;if¨¨res, 15k2quivalcnt de la
Bourse de Fabricius demeure toujours inconnu.
. . . / l . .
¡°3¡±
1, - 3 - Les Antig¨¨nes
Ils pcuwnt Etre dCfinis comiic des mol¨¦cules qui, introduites dans un organisme,
induiscnt une &ponse immunitaire par le d¨¦clcnchument *Apun processus biologiqus impli-
quant en pwtioulier 1s prolif&ration ~31: cellules lympho! ?des et aboutissant ¨¤ la syn-
th¨¨se par ces dernieros de molkules de reconnaissance (anticorps ou &cepteurs), Cas
-nol&~lcs ont la. capacit& do se combiner spkifiquem¨ºnt in vive comme in vitro avec
1 I antigenis inducteur e t ¨¦limincr ainsi xx7 effet.
1. - 4 - LE~ Anticorps
Lorsqu¡¯un animal recoit un antig¨¨ne dans cwtaines conditions, ii peut produire
un antis¨¦rum spkifique ne rcagissant qu¡¯avec cet 2.3 tig¨¨na et contenant des prot¨¦ines
responsables de cotte reconnaissance. Gfl dit alors que ces protsines sont dou¨¦es d¡¯une
¡°fonction anticorps¡± et sfest cecrit¨¨re fonctionnel qui sert ¨¤ dkignw ces prot6ines
sous le terme ci9 znticcrps DJ encore dgune nani¨¦ro plus g¨¦n?rale ttimmunoglobulinestl qui
peuvent ¨ºtre isol5cs des autres constitua,nts de sang par t.!es techr?iquss qui seront d¨¦-
crites plus loin.
Ces immunoglobulines sont classks d ¡®aprk leurs caractkes physico-chimiques et
leurs crit¨¨res anti&nl.que s et sur la base dc critk-es &nkaczx, tous les individus d¡¯une
m¨ºme esp¨¨ce don& ont en commun diverses cat6gories d * iamunoglobulines
appel¨¦es isoty-
PCS. Chez l¡¯homme par exemple, on a defini 1G isotypcs r¨¦parties en 5 classes :
- Les IgG sont 12s immunoglobulines majoritaires du S&UI~ s ¡®attaquant <aux micro-
organismes et aux toxines et sont capables de traverser le placenta ;
. les IgM apparai,,,;
qnnt trks t ?t au d&but de In r<ponse immunitaire et constituent
donc la premi¨¨re barri&e contre les agressions mais disparaissent progressivement au
profit des IgG. Ils n¡¯onV pas unti capacit¨¦ transplacentairo mai s peuvent fixer le compl¨¦-
ment ;
- Les IgA sont trou& dans le s¨¦rum et dans les secrb b.L,,ns
:c; ,-
f colostrum surtout,
mucus intestinal oubronchique, lnrmcs etc...), ils participent 3.u revetement exerne du
corps ;
/
. . . .*.
-Les IgD : pr¨¦sente:; en faible quantite dans le S&Um et pouvant jouer un rjle de r¨¦..
cepteurs sur les membrerles dcslymphccytes ;
Les IgE sont les moins repr¨¦sentkzs des immunoglobulinos s¨¦riyues et
jouent
un r ?le tr¨¨s important en immunopathologie car elles sont Lt support des manifestations
d'hypcrsensibilit$ immkZate comme lc choc anaphylactique, l'asthme, lti rhume des foins.
1. - 5 - Le compl¨¦ment
C'est un systeme biologique qui intervient dans les procossus immunologiques en
se fixant sur le complexe specifique antig¨¨ne-nnticorps form¨¦, Il est compos¨¦ de 9 S¨¦-
Quencesde C1 & Cg agissant s6parement les unes les autres, et dont ltt C3 le plus abondant
produit le C3a qui augmente la permkbilit¨¦ vasculaire ¨¤ lthistaminc ot qui est en m¨ºme
temps chimiotactique pour les leucocytes polynucl¨¦aires. Le C b activ¨¦ lib¨¨re lc C
3
5 dont
le ($2 a les m¨ºmes propriet¨¦s que le C3a
tandi:;que le C5b active le Ce et le Cy qui par-
ticipe ¨¤ lri destruction .?o la membrane ?es cellules cnvahisseuses cntrainant ainsi leur
lyse.
1. - 5 - La r¨¦action Antigene-Anticorps
La mise zn urkence
*
clPun antigene et de son anticorps correspondant produit un
complexe antigCne-anticcrps qtii se traduit par 17union de ces d eu:: &l<ments dpo¨´ la no-
tion de sp¨¦cificit< de cette r¨¦action car un sdrum arki.-hCm;:ities de bovin par exemple
nz r¨¦agira qu'en pr¨¦sonce dVh¨¦maties de bovin uniquement et jamais en pr¨¦sence d'h¨¦maties
de mouton ou de chien. Il ne r&@rr non plus dtvent n'importe quel autre antigine mGme
si cet antigenc
est de provenance d'un bovin.
-% Elle subit l'influence de l'cnvircnncment at surtout des conditions thermiques
en ce sens qu'une temp&nturc ¨¤ 40¡ã peut modifier la confornation des antig¨¨nes et des
anticorps et enduire ¨¤ de fausses kactions,
- La teneur ~~lcvc;So en sel ou snlinite du milieu dans kquel se produit la r&c-
tion amoindrit sensiblement son sff'ct alors
"y1:: faible teneur es sel le favorise
- Elle J¨¦pend dans une tr¨¨s large mesure des conscntrations de l'antig¨¨ne et de
l¡¯anticorps et SC prokit tr¨¨s rapi:.iemcnt d¡¯o¨´ Ik neccssi% et ltimportance d'¨¦viter des
contaminations pouvant mener ¨¤ des r¨¦sultats tr¨¨s difficilement intcrprEtables.
- Son intensitb pe:.it ¨ºtre reduite en fonction de la variation du pH du milieu
dans lequel elle a lieu.
. . /. ..*
I I . - PARTIE PRATIQUE
Toutes les technique relat¨¦6¡®s sous cc chapitre ont et& d¡¯abord. pr¨¦sent¨¦es au
cours SGUS fcrne d¡¯expose avant dt ?tre miscscn application pretiqu ? au laboratoire.
II. - 1 m S¨¦paration des trypanosomes du sang
Elle 3 pour objectif 4 gextr3ire les trypanosomes du sang et B&+ pouvoir aussi les
ccnsentrcr en vue des pr¨¦parations d?ai:tig¨¨nes destin¨¦s aux test s¨¦rologiques et 3. ce
titre deux techniques sont utilis¨¦es,
a) la m&tnode de Lanham : clla consiste ?3 faire passer le ~a:12 infostc de trypanosomes ¨¤
travers une colonne DYGZ cellulose.
Les h¨¦milties ayant une f¡¯orto charTe n¨¦gative soni;
v
retenues par la colonne ct les trypanosomes charg¨¦s moins nCga tivement sont ¨¦lues et
collect¨¦s dans un b¨ºcher ;
Technique
m....-
- Fixer un entonnoir oi? porcelaine sur t!n support ou a d¨¦faut dc l¡¯entonnoir utiliser
corps d¡¯uno seringw ;
- ijett;rc du DEAC cellulose dilue avec du P.S.G. pH C.0 (500mgr do DE 52 pour 2 litres
de P.S.G.) dans l¡¯entonnoir ou le corps do la seringue puis laisser se tasser
- Placer un papier filtre :&oup& suivant lc dimension de lvuntonnoir et verser du tam-
pon P.S.G. dcssus pour ouvrir ?t23 pores du filtre, rincer la preparation, et laisser 2
rouveau
.
s e tasser
- Verser lentement le sang pr¨¦leve sur ru?ticoagulsnt et contenant les trypanosomes sur
le filtre selon la proportio n d Oun volume de sang pour 3 volumes de DEA
et laisser
s q infiltrer
- Verser 2 nouveau du P.2.G. et laisser ¨¦luor
. l¡¯¨¦lvat est recueilli dans un b¨ºcher plac6 sous la sortie
de 1 * en tonnoir
- Afin de s¡¯assurer du passage des trypanosomes prelcvcr r¨¨guli¨¨rement une goutte de
lf(-luaS, ¨¤ 1:% s o r t i e Je 1Varitonnoir et, observer entre ~XK+ 2.t lamelle au microscope et
d¨¨s que la prkencc d*h¨¦matic sera constat¨¦e arr¨ºter l¡¯op¨¦ration et transvaser le pro-
duit de la r¨¦colte dans un tube ¨¤ essai
- Centrifuger 6. froid ci, raiscn de 1, WO tourskn
pcn\\iant 15 m22 en vue r?e consentrer I es
trypanosom3.s ainsi r¨¦colt&.
l . . / . . .
-6-
II. 2 - Tec!lnique de maintenarce des trypanosomes au l~borstoirc
Les trypanosomes pcuvent Ztre maitenus soit sur des animrux vivants de labora-
toire : souris, rats, lapi.ns,cobayes ou sur C?c petits ruminants : imU~Gils, ch¨¦vre en in-
jectant ¨¤ ces animaux du sang contenant les parasites, soit sur des tsAts6 en les fai-
sant nourrir avec ¡®du sang dvun animal porteur (de trypanosim8ds,
soit sous forme corig&e
et conserv¨¦s dans lqazote liquide.
II. 3 - Cl ?nage et stabilisation des trypanosomes
-
-
II. 3-1 - Cl ?nage
Le principe du clEnege consiste A d6vcloppcr chez un animal une souche de trypa-
nosome dont la pOpUl2YiCXI qui en sera issw proviendra d vu~ seul et ;Gme trypanosome et
pour ce faire deux techniqzs pwvent ¨ºtre utilis¨¦es :
a 1 - la premi¨¨re consiste i proc¨¦c¡¯4r ¨¤ un.: sQrie do dilutions progressives du sang para-
sita partant de 108 trypano/!zl. pour deboucher vers une concentration de 1 trypsnosome/ml;
Pr6lcver un ml de cette 5ilution, lp injecter en 1-V. 5 une souris : 3p.r
I
la veine caudale
et suivre l¡¯¨¦volution rie la parasitemie
b) - la deuxi¨¨me td?chniqas quant ¨¤ elle, pr¨¦st?nt.e beaucoup glus de certitude par le
proc¨¦d¨¦ dqisolenent d¡¯un seul trypanosome i partir de la m¨¦tho..:.~ sl:ivant :
- pr6lever du sang infeste !c!e trypanosomes dons un tube h¨¦pwink
- ¨¤ l¡¯ai& dqun¨¦ aiguiil<S trCs f i n e , ~rClcv3r unr trlute petit: goutta _Ie sang et la d¨¦po-
scr dans le godet 11 q une kme crwse ou lr:m<: d p entomologie,
- Gposer quelques gouttes de &.y&~;1 tout w tour du creux
. I
,Je la lame afin ZP¨¦viter
1 qass¨¨chement de la goutte de sang et recowrir d¡¯une lamelle 22 x 22,
- examiner la pr¨¦paration au microscopt: et s 2 assurer qu 1 on rtca coi t qu¡¯un sel11 trypenoso-
Ei
me dans toute la 5r¨¦pzration etkel est le cas
- retirer la lamelle et ajouter une ou deux gouttes de glyc¨¦rol ¨¤ la pr¨¦paration pour
la diluer.
- aspirer la totulit¨¦ C~L cette prepar:tic;n lkns un¨¦ seringue T: insulin St injecter tout
le contenu en I.V. ¨¤ une souris par 12. veine caudale co3~ne pr&e<e:~mant
- garder 12 souris en &vage et procciider ¨¤ des examens quoti:lie:s Je sang en vue de con-
tr ?lcr la sortie de trypanosomes.
l . . / ..#
-7-
Dans lc; Cas d'Ui ? &sUltat poSitl ? tCUt IC? sang de Ccitte 3xris pCR.VP2 ?QV
prc%v¨¦ et cons.erG dans lvazcte liquide apr¨¨s avoir p&alableml;nt stabilis¨¦ les trypano-
somes qu¡¯il contient.
II. 3 - 2 - Stabilisation et crnservstion des trypsosoicas sns 1 t Azote liquide
----*
La stabilisation d.krit 1.q &tho?c, de conservation :!cs tryponosomes bans 19a-
zota liquide tout en &ita;flt de leur faire subir un choc pouvant conc!uirc 2 leur alter+
tion,
.. Prelever une quantit¨¦ de sane h¨¦pzrin¨¦ ¨¤ pwtir dpun donneur fortement parasitk( con-
sentration finale d¡¯h¨¦parinti 5-10 unitE p:li ml de sang;)
- Ajouter quelques gouttes r?e glycerol jusqu 'ZI une consw ?tration de lO%
- Laisser pendant 1511x2 pour ¨¦quilibrer
- Pr2ndre une ran&e de micr::kubes et ¨¤ l paide d¡¯une piYpctte prstecr , remplir chaque mi-
crotube ¨¤ moiti.6 (enviror: 70 oicrolitres/tube 1
- Laisser un cspncc vide aux &XX extr6mit¨¦s de chaque tube puis les boucher chacune avec
du plasticine
- transfarer les microtubes dans de petits tubes ¨¤ essai en matiere pl?.stique et intro-
duir~.; ¨¤ lPint4rieur un morceau DDE papier portant toutes les inbications relatives au pr¨¦-
l¨¨vement : nL, :lak, origine. Puis .:n se servant Gvunc grosse aig-uille pratiquer des
trous ¨¤ chaque extri$mit¨¦ C!U tube pour permettre l¡¯infiltration de lTazote liquide ¨¤ lPin-
t¨¦rieur
-- Introduire les tube:: ¨¤ essai ccntenw t les mic:wtubcs
c?ans une bx~W.lla en plastique
et X lar,se ouverture am&a&e a cet effet prtr un syst¨¨me cl9 iscl2tion, en la recourant C:l
d vune couche 2s plasticin~e ;!¡®uno eprzisseur tIP 1 cm envir: ,n wintanue tout autour avec du
sparadrap.
. 1$3int¨ºd,r la bouteille er: suspension dans le container G~nzotc~; liquide afin quvelle
soit enti¨¨rement recouverte par les vapeurs pendant 2 heures pour refroiC5.r
. Apr¨¨s refrcidissemcnt i;iTX~Sf¡¯5rCP lC:s tubes ¨¤ essai contenant les micrctubes clans les
canisters adu ccntainer dlazoto liquide.
Le transfert devra Ctre op6rC ¨¤ l¡¯entr& du container ou 32 UFiliSc?i?t
un bain d¡¯azote
liquide pour ¨¦viter un-: hussa de 12 teri:pSratu.r~~
.zt c?,rj&c: ?x.loi 7 ':q
*
'1X
.'
canisters sont plong¨¦s
enti¨¨rement dans 1 ¡®azote.
..* /
.*.
,*
c
- Extraire un micrctube, 10 rechauffer , le couper et Gposer une goutto entre lam? et
iamclle, puis crbservcr au microsccrpe pow s13ssuror de 13 survie tics tr ?p~nosx?es.
II. 4 - PREPARRTIOI\\T DPAN ?ISERUM
--.a-
lvinjection r¨¦p&t$e ¨¤ 'un admal d9une certaine dcsc dPimmunoglobulincs en prove-
ninw dpunG espke differer,tc 5 pour effet chez lvanin!al qui rer,cit cet entigone 1~ prc-
duction ?Panticorps specifiques dirig¨¦s contre ces irnmunoglobulines et clCsign?s sous le
nom d'anti-imrwnoglobulines
qu90n retrwve dans lc S&U~ de cet animal qui porte ainsi
15 ncm d9antis&um.
Technique : '1O : &ulsionner ¨¤ pwties ¨¦gales une solution d9immunoglobulines
titrant 20ugr/ml avec dc ?var:juvar,t complet de Frct8nd pnis injecter 2ml 5u prcduit ¨¤ la
plante du pied d'un lapin en rcpxkissnnt 19 d5c.t--: en deux endroits diff6rents (le ContrC-
lc ;ivunc benne Gmulsirtn peut svop&er e?l d¨¦p<>SZn t une g:jutte ilte cette Gmulsion dans un
b¨ºcher c,xter,ant de lpti~:u.
Paix le cas dtune r¨¦assite, 17. gwtte reste intacte et
fl9ttc 5 la sur I-,ce dce l" ?aii tandis quvelle fond et s& rlissipr w cas ,-le for: r¨¦ussite et
ainsi lvop¨¦rntion dcvrs
¨ºtre pcursuivid jusquv¨¤ lPobte:\\tion d7ur, bon r¨¦sultat)
20 : 15 jours apr&s &p¨¦tw 12 m¨ºme injection et xix m¨ºmes w:k¨´its ti vune 2utre ¨¦mulsion
faite avec cette fois-ci l'adjuvant incomplet & Freuni¡¯: et titrant 15 ughl.
3" : IF, jours apr¨¨s, l-! ~:le¨¹xi¨¨ne injection reprendre comme pwr lc? lereinjection
4O : IC jours apr¨¨s, pr¨¦lcvw environ 15ml iu .sc?nc de cc m¨ºme lapin pnr ponction veineu-
se, r¨¦ccl'cer 15 scrum et 1.2 tcstcr en immunodiffusion ;xd immuno&lectr~phor¨¨se pour d¨¦ce-
ler ¨¤ pr¨¦sence :<vanticorps anti-immunoglobulines.
II. -Ej- Il%lUWODIFFUS ?OI:
Le princirx ?e lvimmunodiffusion est la I+ctection directe d9snticorps contenus
clans un serum donn¨¦ en mettant cz Grum en contact avec lvZntig¨¨nc; pour lequel les xnti-.
corps sont rechcrch&s.
Technique
-
-
- Etder une couche d9agerosC ¨¤ O,'l5% sur la lame + 0,05% ~?e i%?J2 puis ldsser s¨¦cher
- Pratiquer 4 ou 5 creux a la su-fxe <fu ,gei
_ !!v2garr=se d'abord, et tout sutour i;e chacun
ci9eux ensuite ci-wsw bes puits <!Pur~ diam¨¨tre be;-.ucoup plus petit que celui des premiers.
. . . / . . .
- 10 -
- D¨¦poser ltantig¨¨ne dilu-2 dans chaque creux tandis que les s¨¦rums 5 tester sont dispo-
s¨¦s dans les petits puits situt
autour
- Incuber pendant 24 heres a 37 O Zans une boite de petri contenant O,O% de %a'42
- Lt?s rkultsts positifs c'est ¨¤ <ire les ~~~ru~~scontecarii;l~rlnticorps
s;kifique de l'an-
tig@ne se traduisent p7.r des arcs de precipitation visible-s 5 lqocil nu et dont l'inten-
sit¨¦ est variable selon la teneur du skwm en immunoglcbulines.
II. - 6 - IMMUI\\rO~LECT;30P!IORI7SE
-e-w
Le principe ds l:i~!ununo¨¦lectrophor¨¦se est le m¨ºme que celui de 19immuno5iffusion
¨¤ la diff¨¦rence que dans cette technique on fait migrer
l'enti.g&e dans une chambre
ilectrophor¨¦tique.
TSCHNIQUE :
Etaler une couche d'agwose 5. 0,15% et 0,01X de thiomarsalate
Creuser des puits en surface toujours dms le sens de la lOIT@JE.!A ? Cd3 12 lame.
D¨¦poser lqnntig¨¨ne Ans chaque: puits puis laisser migrw Ans une chambre slectropho-
retique pendant 1 nuit
II. 7 *m ISOLEklENT ET P¨¹RIFICpiTIG?! DES II+lMUNGGLO:';ULIP!i:L,
--- --
- -
.--
II. - 7 " 1, - Isolement das globulines
----l-P
La m<i;E?o(ie utilis¨¦es est 12 mi:thotle )?e pr¨¦cipitatioi: pr:r la sulfate JPnmmonium
qui permet d-e s+.rer 1~s i>lobulincs ou anti-j.mn¨¹n~olobulinas tics autres composants <lu
sang.
TECHNIQUE :
--
Prendre ~;n volume don& (le s¨¦rum auquel on ajoute goutte ¨¤ soutte un ¨¦gal volume
d'uiw solution satur6o c.ie sulfate dFammonium (soit SF;G gr NH4 SO21 en agitant tout dou-
cement. laisser 30 mn a 1 heure a la tely&ature ambiante Tdis cer!trifui:,sr il froid ¨¤
raison Ze 3.GGO tours/ ?w pandant 15mn. rcdisscudre le culot de centrifugation dans un
volume $, q eau ,:lis tj.ll& a<.;,: 1. YJ volume de s¨¦rum initial utilis¨¦. Renouveler la w&i.pi.ta-
tien une deuxi¨¨me puis u.nd2 twisikm fois guis cj.i.~oucfx~ 1~2 (qt?r~~-l' Culot cian> cl11
. ../...
- 11 -
PDS 5M PI-I 3,8 ¨¤ un v,l.w:-. 6;::~.1 a la moiti¨¦s du v?lumc- de s&um initic:l, Dialyser contre
le tampon PSS et v¨¦ri ?ier 1: prCscnce de .l~ammonium en m<lanC;eant
1 ml Zu rro?uit
.A
de
dialyse 2 un &g,al volumi: ::'unc soluti?n ? l:C!Sk de chlorure de bar:. ,m. L,L virage au trou-
bic de ce m¨¦lxge t¨¦moi;gw de ln pt&3cncc dpions ilfe
,
'
dmmonlum et r?ans co cas, 17: ::ia1yse
devra Ztrc poursuivie jusquf$ la rkaction n¨¦gative cfsst-5-s.!ire ltcbtention d'un mslan-
gc clair,
II. 7 - 2 - Purification des immunoglobul:int.:s
---.
Tandis que lz, pr&ipitaiAon p¨¦rmot :!tisvler la totalit¨¦ &s globulines s¨¦riques,
Z'autres techniques sont utilis¨¦es pour -5limir-w la sulfate ::?-dmmonium ou bien pour ot-
tenir ux, classe ou une subclassc dPirxxxx~globulines.
II. 7 - 2. 1 - Filtraticn sur gel
_I
Le principe consiste ¨¤ eluer 1~ substxnce desir&?+. travers une colonne de S¨¦pha-
dex G 25 par le grincipc ~~*cxploitation ('es diff¨¦rences dc <!imensions :?¨¦ mol<cuics pvr-
mettant de faire passw rapi~.:ement l.-~c*
cIU unes pendant que le p3ssaSe t'es autres est retar-
d¨¦.
TECHN ?OUE
- Mettre du gel de S¨¦phadcx G 25 pr¨¦ainblement &quilibr¨¦ avec un tampon TX3 SM 3. un pH
7,8 dans une colonne de chromztographic
v& laisser se tasser.
- Rincer la pr¨¦p aration en ajoutant du. P,C.S, puis laisser Q-outtor
- Verser lentement la solutic:1 Ue zlobulirws enx surface, ajouter du tampon PDS pour
diluer et laisser ¨¦lurr
- L*elu?t ccnstituant la fraction ~~Pimmunogl~~bulincs est recueilli dans des tubes et
chaque tube devra &re contr ?li peur v¨¦rifiw 1:: pr¨¦sence de xulfat¨¦ d7ammonium comre
pr¨¦c&!erment en ajoutant du chlorure de barium.
Ii, 7 - 2. 2 - Chr~matographie sur khangeur dvions
En faisant pousser une substance c? chnrlr;<: &ctrique dG?Yl& a tra-vers un gel ci
charge contraire, on cr:%: un effet de r¨¦tention de la substance par 1~: o;el sous forme
.*. /
..*
- 12 -
de liaison. Cette liaison gel-substance peut etre rompu: lorsq~~.'on ajouto un tampon ci?
charqe electrique de m$m<; nature mais plus forte quo celle r)e 1~. substance retenue.
Et c'est suivant ce pro&6 que les Io C,, Ig (ii2 et Ig ¡®1 Sont. isolk.
TECHNIQUE
_-
- Mettre du DB 52 k@X.5r~ 2 un pH 7,5 #avec du tampon ?O 5
4 id dans une colonne de
chronatogrzphic
connrct~k ¨¤. un collecteur et laisser se tasser.
- Ajouter la m¨ºme tampon pour rincer le contenu (le la cclonno 61; laisser egouter avec
le m¨ºme tampon.
Verser lertement la solution de glcbulines Cr~is 1;: colanna
. I
puis ajouter l!r Campon
PG4 et laisser ¨¦luer. Les IgQ2 sont ¨¦lu?&3 en premier lieu et sont recueillis dans les
tubes dispos& au fliVcZ:l CIIl COlleCtSlt.
- Ajouter du tampon P04 10 M pour faire elucr 10 premier pic correspondant alu 1 QG
J 1 jus-
q!i'¨¤ ¨¦puisement complet.
- Ajouter du tampon PO4 50 I! pour -avoir une derni¨¨re 6lution corxspondant ¨¤ un mslange
d'un ler gic d'J+C, et TgG2 puis d9un deuxi¨¨me pic dvIgM ot (391 p l
9 1
II. 7 - 2 - 3 - Chromatogrephic dPAffinit6
_I-^.--IIY--
Lc principe consisk ¨¤ coupler un gel appel6 mr:tri.cc: i: un ce1 biospki ?iquo
appel6 ligant ct capable de se lier &lecti&ment avec 1~. fr2lction
iluFon d¨¦sire isoler
d9une substance donke. Cette fraction peut constituer 1 P¨¦lfkknt ¨¤ retenir ou ?lorr
19¨¦l&~ent a rejeter. Dans le cas ou 19¨¦l¨¦ment ¨¦st ¨¤ retenir OJ alors l'el~me-nt ¨¤ reje-
ter. Dans le cas 06 1~6lCment est 5 retenir, l2 liaison avx li: ligt.iit devra Ztrc r¨¦ver-
sible afin de pouvoir 19;~iu~:r se:.1 apr¨¨s. Dans 1~: 5:s cc il dwra $tre ¨¦cwt¨¦, cette
revwsibilit¨¦ n'est plus neccsseire puisque seul l'&lSmont dkir& aura travers& la co-
lonne.
TECHNIQUE
m--.
- Prendre du se1 de S6phzroso constituant la mrt.ri.cc cci¨¹pl~¨¦ avec do lc? proikine A qui
est le ligwt.
- Equilibrer avec un tampon PBS 0,01 renfermant 0,2% ciPazide ci\\: sodim,
.*. /
. . .
- ¡®13 -
-- Mettre dans une colonne connectes ¨¤ un collecteur.
- Verser 12 solution $2 ;;lcbtilincs ;3t apr+s leur absorption totale pzr le gel faire ¨¦luer
avec du tampon NaH2 PG4 9,1 M pH 5,9, Pour obtenir le Ier Tic >'es IgG2
- Apr¨¨s le premier pic, a2outer du tampon AaH2P04 0,l Y pH 5,0 pour obtenir le second
pic des IgG,
Les 2 pics sont colloctEs s¨¦paremont et corksponkn t aux fractions IgG2 et IgG,.
La densit6 optique dt! chaque pic est d&tarmin¨¦e par une kcture au spectrophotom¨¨tre en
vue du calcul cIes taux de proteines skiques fractionn6es.
II. 8 - PREPARATION D9ZJJTIGENES
Les pr¨¦parations r!'antig¨¨nes utilis6s dans les Bpreuves s¨¦r?,lo,giques varient 2n
fonction dc la technique de diagnostic envisagee. Et c'est ainsi qw 13anti$ne destin¨¦
¨¤ la technique d9immunofluorescence
et compo& d ?une suspension de trypanosomes sera
cliff¨¦rent de celui de 17ZLISA cu les trypancsomes
doivent subir une desint¨¦grztion par
le proc¨¦r!¨¦ de la sonification,
II. a - 1 -Antig¨¨nes pour immuncfluorescence
-11_1_
- Saigner des animaux dont 1.~ sang est fo:rtez5nt parasit¨¦ sur anticr:agulant.
- Centrif+uger le sang ainsi reweilli ¨¤ 2.00 tours/mn pendant 15 mn ¨¤ froid.
- Verser les 2/3 du surnageant et recueillir lPinterphase.
- Diluer le surnageant au 1/2 avec du tampon P.S.G. pH 8,O.
- S¨¦parer les trypanosomes c?u reste du sa.rlg par la metho& ce lanhnm <¨¦crite plus haut.
- Centrifuger l'¨¦luat 2 trypanosomes recueilli a raison de 2.OGO tours/m ? pendant 20mfl
¨¤ froid pour CCX@entrer les paraSiteS
- prendre un volume dlcau physiologique repr¨¦sentant 10 fois celui du vclume de sang
initial et remettre le culot <je centrifugation en suspension
- Fixer de la maniere suivante :
1 volume de suspension de trypsyiosomes pour
2 volumes de fixateur puis placer sur un agitateur magnetique pendant 1 mn et laisser
fixer une
nuit ¨¤ - 2C¡ãC.
..a /
. . .
- 14 -
Composition du fixateur :
Ac¨¦tone r¨¦fri;;&C : 80 ml
FOPKGI.
: 0,25 ml
Nac1 ¨¤ c3 ¡®, 0
: 19,75 ml
(le fixL.
.r davra ¨ºtre une greparation extemporan¨¦e)
- Centrifuger a 1.500 tours/mn pendant 15mn ¨¤ + 4*C afin dP¨¦liminer le fixateur.
- Resuspendre le culot rie try¡®Janosomes dans d- lveau physiologique ¨¤ raison de 2 fois
le volume initial de sang.
- centrifuger ¨¤ 2 _
.5G3 tours/mn pendant 15 mn ¨¤ 4*C puis r¨¦p¨¦ter 3 fois cette op&ation
afin d¡¯eliminer enti¨¨rement toute trace de fixateur.
-. Recueillir le dernier culot de lavage ot suspendre dans du P .U. S. 0,Ol M pH 7,2 ren-
fermant 0,2 04 d 7azide de sodium.
- L¡¯antig¨¨ne ainsi pr¨¦par¨¦ , peut ¨ºtre stock¨¦ soit ¨¤ 4*C, soit ¨¤ la tempercture ambiante
apr¨¨s avoir 6t6 titr6 puis reparti dans des flacons de 1 ml.
II. - i7,. - 2 - Antig¨¨ne pour 1¡¯ELISA
-1_11_
- R ?colter et isoler les trysanos¨´mes comme prec¨¦demmect.
- Ar¨¨s centrifugation, remettre 12 culot en suspension dans un tampon tris Hcl pH 8, ?
contenant 1 iq de PMSF (Phenyl-m6thyl-sulfcny-fluorido} et 5 7~1 U91c. ¡°z-&tamide selon un
volume ¨¦gal au I/l0 du volume initial de sang et r&&er cette operation jusquv& lqob-
tention dvun volume ¨¤ -eu pr¨¨s de 20 ml. ci? culot do centrifugation
- sonifier 11 pr¨¦paration jusqu¡±¨¤ la lyse compl¨¨te Ces trypancsomes dans de la glace
avec un o.ppareil de sonificati ?n.
- Centrifuger le s0nics.t ¨¤ 3.00 tOU?S/lTXI per&nt 15 i!lIl ¨¤. 4*C.
- Recueillir le surnzi;eant, centri.fugw 5 nouveau ; 15,O::G twrs/mn pendant 30 mn 1A.s
filtrer le surnageant ¨¤ travers un filtre milliporc.
Ultracentrifuger le filtrat 2 40.000 tours/mn pendant 3G mn.
Recueillir lc surnagc:c?nt ct lu mettre ¨¤ dialyser contre un tampon tris 5rJ PI pH 3 ,O
puis lyophiliser le produit de dialyse ainsi obtenu.
- D¨¦terminer le taux de ?wt6ines, Fuis titrer ¡®et stocker a - 2OOC.
. . . / . . .
- 151
II. - 9 - PREPARATIOW DE CONJIJGUE POUR ELISA
Le test dtELI% requiert l'utilisation d'un conju=& ?r&par6 en couplant la mo-
l¨¦culc d'anticorps avec l'enzyme, horseradish peroxykse (H.Z.P.1 et, il est utilis¨¦
dans les analyses s¨¦rologiques dsune large gamme de maladies arlimaltts. Cette technique
est le plus souvent utilis¨¦e %tns les m&tho,:!es indirectes de ditection de 1: pr¨¦sence
d'anticorps sp¨¦cifiques ,q'un nnti&ne connu. La m¨¦thode de conjugaison decrite ci-
dessous conserne sp¨¦cialement la p¶tion dvun ccnju& dPantis&um do ch¨¨vre anti-
immunoglobulines de bovin, toutefois cette proc¨¦dure de conjugaison peut k%re utilis¨¦e
pour le couplage dtantigobulinw produits dans une large vari¨¦t¨¦ dPesp¨¨ces animales.
II.9 - 1. - Pr¨¦paration des immunoglobulines
.-
Les fractions immunoglobuliniques de l'antis¨¦rum sont pr¨¦cipftoes p-r une solu-
tion satur¨¦e de sulfate dvammonium ¨¤ 50%
- Les slobulinos pr¨¦cipit&s sont lav¨¦es deux fois avec une solution L:e sulfate d'amtno-
nium ¨¤ 50% puis dissout@ddans un tampon PO4 10 M pH 7,G
- Ensuite dialyser lwgement contre le m¨ºme tampon une nuit ¨¤ 4*
- Fractionner les zlcbulines an faisant passer le produit de dialyse ¨¤ travers une co-
lonne DEhE 52 cellulose (comme d¨¦crit prec¨¦detmnent)
- Tester en immuno&~ffusi.cn les fractions obtenues et colles qui prkentent des bandes
de. pr¨¦cipitation sont consentr¨¦es
- D¨¦terminer au spectrophotom¨¨tre le taux de proteines &cntuellement pr¨¦sentes dans
les fractions.
II. 9 - 2 - Pre-Laration de 1'Enzyme (OXYDATION)
w - . - - -
-..-
- Mettre 10 mn de HRP dans un fiole
- Ajouter 1,8 ml d'eau distill¨¦e
- Ajouter 200 ml d'une preparation toute fra ?che de sodium p¨¦riodate (32mgr/ml goutte
par gouttejet
laisser r&langer 9u fur et t ? mesur~avec un agitateur magneti-
que pendant 30 mn a la temperature
ambiante pour permettrelbxydation de lpenzymec
- Dialyser contre un tai!pon sodium acetate 1 M pH 4.4 pendant une nuit a 4O.
. . . / . . .
- 15 -
IX. g - 3 - Preparation du conjugu¨¦
- I - w - -
- Pren!re 12 Ml de 13 soluZ.on dpenzym~tr ainsi obtenue auxquels on ajoute 2ml de tampon
carbonate 0,2 M pH 9,G.
- Ajouter 30 mgr de In sclution d'immunozlobulines (proportion dpl part dfenzyme pour
3 parts de globulines) et laisser melanger pendent 2 heures 2 la temp¨¦rature ordinaire.
- Ajusttir le pH de 1~. sclution ¨¤ 7 ,2 mec du Na2 1-I Pc),, il,1 m et laisser ¨¤ 4O pondant
1 nuit au repos.
- Bjouter 2 ml dsune solution frniche 'de glycine (rl mgr f.1~ ,r;lyc,inc dans IDOml de PBS
fJ,Ol M pH 7,2) ou borohydrate de sodium et laisser ,'i ncuvoau a~1 repos penclant 2 heures
a la tcmpirature ambiante.
- S¨¦parer 1~ conjug& de prot6incs du rGsti2,
en le faisant p:zssor ¨¤ travers une colon-
ne s¨¦phadex G 100 apros une nuit de dialyse,
- Filtrer l'¨¦luat ainsi recueilli 5 travers une membrane filtranto O,45 u et mettre
dans une bouteille sombre pour prot¨¨ger contre la lumi¨¨re.
- Ajcuter 0,25 ml dgazi3e de sodium pour la consentration finale
- Filtrer puis stocker ¨¤..2V"
Conjugu¨¦ pOUY immunofluor¨¦scence :
- - -
Le conjugu¨¦ pour 1~ :ests dgimmunofluorascence est prGpar6 ¨¤ partir dOun coupla-
ge d~immunc~lobulines avec 19isnthiocy~nate du fluorescoinc.
- Prendre un volume l!onx~C: de solution de prot¨¦ines titrant IF msr/ml et lt: diluer dans
un autre volume 2e tampon carbonate O,O5 M pR Ij,6
- Prendre: lt: fois le volume du m¨ºme tampon de .%.lution des immun{o@obulin,:s et dans
lequel on diluera 13 fluorcsceine ¨¤ raison cl91 mgr/ ml de tampon.
- Dialyser la solution de protkincs pendant une nuit 5 Lt0 contre du tampon carbor;ate
bicarbonate pTI 9>fi.
- Transferer la membrane de dialyse contenant les pwt¨¦ines clans la solution de fiuo-
resc¨¦ine et proc¨¦der ¨¤ une seconde dia1ys.e de 24H pour faire la conjugaison proprement
dite.
.". /
. . .
- F i l t r e r a tiTVerS une csl~mne ie &phatlex G.56 pwr $lirnin::r lSds traces d e fluores-.
ceini; yi.on fixiks.
Les dluats c!ont ce ra?pwt est CWlpi~iS entre? 2,s <.:t 7 constituent lt-s fractions
5 retenir et ;rinsi tous les autres se ¡¯sI.tuant hws <!e ces bimittis s:mt ¨¦limirGs,
- Faire passer 5 travers UI? ?,iltre et njwter C!,?j d 9iizi.k C:C SGdi¨¹m $!iY d i l u e r 3J 1/2
avec cte la glyc¨¦rine pure, puis titrer et stocker ¨¤ -20¡ã
II. 70 - TECHNIQUES DE DIACNDSTIC SEIIOLC)GIQUE
---.-
L t im3-wnofluore~c¨¦nce indirwte et 1¡¯ELISrS. sont ¨¤ l¡¯heure act:uell~ lzs deux m&
tho=les 3e diagnostic
s¨¦rolo,~ique 1~s plus utilis¨¦es e:~ raison de leur sensibilit¨¦,
IltJ
leur aspect prc?tique permet tan t 4 *effCctger i:e@d 7dnlysas ~.!ifP¨¦iG?S c;t surtout
1:~ leur hautesp¨¦cificit5.
II. - 10 Y> 1 - Immunof luorescencc
Lc principe consiste 5 mettre en ¨¦vid ?r!ce la grGscncc iPanticorgs scriques per
contact gdvun s¨¦rum suspect avez lv 7ntiC;¨¨nc agent de 1,: mal3:lic consi~&5r&, r¨¦&16 en-
suite par un antis¨¦rum sp¨¦cifique de ce s&um conjugu:: CI 1. s iscthiocyancte de fl¨¹wos-
chine.
TECHNIQUE
- Diluer lDantig¨¦n~~ dans un tsmpon I?X O,Gl K pH 7,% ot lt: ?¨¦posw claw 12s cercles
~dpun~ l?.mc ¨¤ imz?unafluoroscence (di~peniblc c!nns li: mwch;i puis lG.sscr s¨¦chw 15 ¨¤
29 mn 5 In ternp&uturc zm!d.c33t,e 3u 5 5 10 mn (A ?¡°OC.
-3 ;¡°:bsorber l e s&um d,ans ;lu lysat de lymphtcytes ¨¤ raison d¡¯un vOlurne C!e S¨¦rUm pO3r
39 volumes cte lysct et laisser 3cSm-1 2~ la ten?p&ature a ?:bi:xte.
sil Dilutiw ICS s¨¦rums 5 testar i-ians !du tzqon ¡®E%S pH 7,3 ad~!itionnk de &PU~,: +lbumine
de bovin ¨¤ 2 74.
-8¨¦poser dzns C!12tTlleiti CrPclc: 25 ul de Jilaltion 6.e s&um corrcs~cn~~nt et lzisser 39 mn
en atmosph¨¨re humide 5 1~ tunp¨¦raturo ambiante.
Y Monter une 1c:melle 22 x 59 5 l¡¯r?i:!e r17un5 ?r6parntion ?i parties +$.a de r$.yc¨¦rini;-
et PBS gE; 8 ,a3 guis lire :L*u mi ?rcmcope ; ultraviolet.
Les rt&t&is positives sont r& ?¨¦l¨¦es pZti2 une flUoresCc?nc0 des trypanosomes
constituant 19antig¨¨no et Sur L:uquc:i.s s¡¯est ?ix¨¦ l¡¯aritico;-;JS li6 rli 17z9tis¨¦rum marqu¨¦.
Les r&xtions n-a¡¯,¡®,;al;ives par contre sont sombres.
II. 10 - 2 - ELIS;1
Le Crincipe de 1- ? ELISA comme celui de 1Qi?INiXX¨¹:'lUOK2sCWX~ d¨¦crit ci-dessus
consiste ¨¤ d¨¦cel.cr 13 prkence 6 9 anticcrps ou d ¡®anti.$ncs circulacts ;:~~~~S un s¨¦rum
cOnsicGr4 2ar le m¨ºme s~stkiz de r6aetion antigCrX-anticcv::s r¨¦v¨¦l¨¦e ensuite par une
substance chromOg&e
II. lG - 2, - 1 - D¨¦tection d¡¯anticorw
p.-
-I-
Cettt teclaiquu sert EL
d¨¦tecter des anticorps cirxukwts dans un s&um sus-
pect permetttlnt i.imi C~:E: 3ire si l¡¯animal. a ¨¦tt< au mcins unu foi,s eii contact nvec 17an-
tig¨¨ne cl.~ 1~. malx!i ? recherch¨¦e au mA>me!:t du pr¨¦l&emcnt c ?yazt alors provoqu¨¦ la pro-
duction d ganticorp; 5irigis contre 1 Vantig¨¨nc de cette mnladie,
. . . / . . .
TECHIXQUE
- Sensibilisation de plaques de microtitragc :
ou 20 ugr/ml
- Diluer lqanti&x~ 5 1: cvnsentration requise : 5 u&iil 1C: uer/ml/avec u:x solution
de P13S O,Ol M ?H 7¡®2 contenant 3,22X d!azide de sndium
- Emplir chaque puits do la plaque avec 100 ul dfantiC;¨¨nti c?iluC,
%- Incuber la plaque ¨¤ 37O pendant 2 heures puis transf&r h 4" pendant une nuit.
- Verser lqanti&x: puis l:.vcr 32s pl-ques 3 fois successives avec du tampon de lavnge
mGlang6 a du tween 20 ¨¤ S,l% : remplir chaque puis jusqu'aux bords avec 1~; tampon,
laisser 3 - 5minutes en contact puis verser et s¨¨chor,
- Rloquor 11~ parois ~10 la p?:quc avec une prot&,x de provenance diff¨¨rcnte de celle
de lfcspGce aximlfl~ pour l::queile 1~ &rum est nnalys¨¦ (albumine C?C ch¨¨vre, moutxn,
lapin, etc...) ¨¤ unt concentration de O,2 01.D -lr
L.i distribuant 200 ul du tampon de blocage
dans chaque cupv.1~ et incuber pendant 30 mn ¨¤ 37O. '.coutcfois, ce blocage peut i:tre
omis mais dans ce cas, le s¨¦rum ¨¤ tester devra Vtre Cil& dans un tampon ¨¤ O,F;n/o de
prot¨¦ine, L'inter¨ºt dc cette pratiqu:>L est C!i-; saturer lr: plaque un f?.isant occuper tous
l¨¦s pores laiss¨¦s libres p-r la prot¨¦ine de sorte ¨¤ Eviter toute 5~~5s~; r¨¦action,
Y Remplir 1;: plaque avec des s¨¦rums ds: contr6l.e ct 1~s s&ums j tester dilu<s ¨¤ I/l00
avec du tampon de diluts.on nuis incuber 3 37O peudant li heur? GI. ¨¤ la temperature am-
biante pendant 2 heures.
Il est en outre rccomrxand6 de tester aussi bien 12s serums do contr ?le que ceux
destin¨¦s t: ¨ºtre analys&s en dr;ublc c'est 5 cliro cn utilisent 2 puits par s&um, et de
remplir 1~ rang¨¦t; 1 de A h H avec du tampon de dilution si on doit utiliser unlecteur
multiskan pour mesurer les densit¨¦s optiques
- Laver 1~. plaquti 3 fvis successives com~fie pr¨¦c¨¦demment
- kjou%er lC.6 ul de conjugu6 dilu¨¦ en fonction de son titre de travai* dans du tampon
de dilution et incuber pendant 1 h ¨¤ 30" ou 2 heures ¨¤ la tempdrature ambiante,
- Laver 3 fois de suite de la m¨ºme mani¨¨re avec du t.ampon de lavage et s¨¨cher.
- Diluer le substrat G-phenylendiamine & une consentration do 1 mgJm1 dans un tampon
citrate G,G5 M pi-I 5,5 auquel on a ajoutL 1% dvhydr?,$ne pcroxydose.
- Remplir tsus 1s.~ puits .wec If:! ul de cette preparztion pour r¨¦v¨¦ler et incuber 15 ¨¤
31kn S. 37O et dans lPobscurite puis arr¨ºter la r¨¦action en a,j%tant 25 ul d*acide sul-
furique 2 N dans chaque pui+ .
- Mesurer l*absorbence au spectrophotom¨¨tre et i une vitesse de 492 nm
II. 10. 2 - 2. - D¨¦tection tks Antig¨¨nes a Partir d'Anticorps Monoclonaux
.I_.--
Un anticorps mc>no&.kal est un anticorps produit 2 partir d'un seul clone de
cellule. Par consSquent, 52 sp¨¦cificit¨¦ est qufil est diri.g@ vers un ¨¦pitope ¨¤ l'oppo-
s.5 de lvsntis&ua produit chez les animaux par immunisation qui contient un melange
d'anticorps dirig¨¦s vers plusieurs ¨¦pitopes de lvanti&ne immunisant. En raison de
cette specificit6, les antigitnes monoclon ?ux constituent un excellent moyen pour 10s
analyses de m¨¦lange d9anti&nes en vue d'identifier et de purifier les antig¨¨nes qui
conviennent pour un besoin donn¨¦.
L'application dos anticorps monoclonaux est en hausse non seulement ¨¤ cause de
leur grande sp¨¦cificit¨¦ mais aussi la facilit¨¦ selon laquelle ils peuvent Gtre standar-
dis¨¦s et le fait que les cellules hydrides produisant les anticorps monoclonnux peuvent
¨ºtre conservk de mani¨¨re permanente.
Ces ar;ticorps monoclonaux d*utilisation r¨¦ct;nt ?,pormetterrt la d¨¦tection dPanti-
g¨¨nes circulants dans le s¨ºrum d'un animal donn¨¦ et d9avoir ainsi des pr¨¦cisions sur
lvktat pathologique de cet animal ¨¤ la p¨¦riode tixacte selon laquelle le prel¨¦vement
de sang a 6t¨¦ effectu¨¦.
. . /. ..*
- 21 -
La technique d¡¯utilisation des anticorps monoclonaux dans les m¨¦thodes de
diagnostic s¨¦rologique est ¨¤ peu pr¨¦s semblable ¨¤ celle d¨¦crite pour la d¨¦tection
d q anticorps pzr ELISA.
II. 10, - 2 2 - 1 - Fr¨¦parakion d9anticorps Monoclonaux
a) Immuniser un animal (rat- souris etc . ..) avec lvantig¨¨ne qu¡¯on veut rechercher dans
s¨¦rums ¨¤ tester et v¨¦rifier si la production d¡¯anticorps est abondante en utilisatn
par exemple la m¨¦thode d¡¯immunodiffusion
et en cas de r¨¦action positive
b) sacrifier lvanimal, pr¨¦lever fa rate puis la macerer en vus de pouvoir fusionner
les cellules spleniques avec des cellules cencereuscs incapables de synth¨¦tiser leur
propre immunoglobuline et la proportion cellules spleniques : cellules cancereuses
est de 10 : 1
c) La fussion est assur¨¦e par du polycthylene glycol ou du SandiVirus. Dans LE? cas
d¡¯une bonne fusion la cellule cancereuse sPapproprie le pouvoir immunog¨¨ne du lympocy-
te.
d) Distribuer le m¨¦lange de cellules ainsi obtenu dans les puits d¡¯une plaque de cnl-
ture tissulaire.
e) Faire pousser les cellules pendant 10 ¨¤ 14 jours dans un milieu de culture selectif
qui permet la survie des cellules fusionnees tandisque celles rest¨¦es libres meurent.
f) Remplacer le milieu par un autre quifavorisele d¨¦veloppement ra pide des cellules,
avant de tester la pr¨¦sence dPanticorps contre l¡¯antig¨¨ne immunisant,,lc choix du test
ayant ¨¦t¨¦ op¨¦r¨¦ avant de proc¨¦der ¨¤ la fusion des cellules.
g) Les cellules cortenues dans des puits dont le surnagent compos¨¦ du liquide de cul-
ture pr¨¦sentent, urw activit¨¦ anticorps sont ensuite transf¨¦&s dans des flacons de
culture tissulaire et d¨¦velopp¨¦es.
1) Les cellules ainsi d¨¦velopp¨¦es sont ensuite cl ?n¨¦s par la m¨¦thode de dilution ou
en utilisant
de 19agarose. Ensuite on termine avec une population de cellules prove-
na:?t d¡¯une seule cellule appel¨¦ cl ?ne de cellultis. L¡¯anticorps synth¨¦tis¨¦ par ce cl ?ne
prend alors le nom d9anticorps monocl ?nal.
l . . / . . .
- 22 -
II. 10 a* 2-2 . . TECHMIQUE DE D!ZTECTTON DES ANTIGENES CIiiCULA?J'B
- ------.
I-.--e
Le test peut Ztre effectu¨¦ sur une plaque ¨¤ micrctitra~e pr¨¦alablement sensibi-
lis¨¦e par l'anticcrps monocl ?nal pour lP&tude d'un grand nombre de &runBou dans de
petits tubes ¨¤ essai dans le cas de diagilostic a titre individ!!el.
Lorsque 19antig¨¨ne est pr¨¦sent dais le s¨¦rum ¨¤ tester, cet an&--¨¨ne est retenu
par l'anticorps et lrs ¨¦l¨¦ments non fix¨¦s sont ¨¦?.iminRs par lnvage, Pour &v¨¦ler la fixa-
tion de lvantig¨¨ne, on ajoutc le m¨ºme anticorps qui a servi a se~isibiliser la p ?aauc
mais cette fois-ci conjugu¨¦ ¨¤ une enzyme qui va se fixer ii lPantig¨¨ne et former ainsi
un complexe. Cette combinaison antig¨¨ne-anticorps est ensuite r¨¦v¨¦lk par addition dpun
indicateur appropri¨¦, J.Jn chan,gomcnt de couleur se produit p;ir un virage au vert do s¨¦-
rums positifs alors que leoL1 s¨¦rums n&gatifs restent claires, La lecture de la densit¨¦9
optique des plaques au spectrophotom¨¨tre donne d:?s indications sur le pourcentage d'an-
tig¨¨ne pr¨¦sent dans l*¨¦chai~tillon.
1 - Sensibiliser 12 plaque avec 1¡ãanticorps monocl'kl
2 - Laver avec du P.U.S .
3 - Ajouter 50 ul de s&um ¨¤ tester et laisser incuber pendant 15 mn ¨¤ la temp&
rature ambiaato
4 - Vider la pieque et laver avec du tampon do lavage
5 - Ajouter 1GG ul i,e conjugu¨¦ et laisser incuber 15 mn ¨¤ la temp¨¦rature ambiante,
6 - Laver et rincer 3 fois
6 - Ajouter 100 ul de substrat et laisser incuber pour obtenir lc, coloration.
Les serums positifs sont color¨¦s en vert tandis que 1;~ n¨¦gatifs restent ciaires,
. . /. ..,
- 23 -
COMCLUSIOM
Les cours suivis pendant la p¨¦riode qu¡¯a dur¨¦ le stage ont permis non setile-
ment d¡¯enrichir les connaissances th¨¦oriques dans les domaines scientifique et techni-
que mais surtout de manipuler des appareils de laboratoire hautement perfectionn¨¦s et
de pratiquer des m¨¦thodes de diagnostics s¨¦rologiqutis de pointe.
Le d¨¦tection des antig¨¨nes circulants ? partir d¡¯anticorps monocl ?nux qui en
est la plus r¨¦cente pr¨¦sente un avantage certain puisqu 9~Lle pcrmtt dPeffectuer des
diagnostics tr¨¨s pr¨¦coces en ce sens que leur pr¨¦sence dar s le s¨¦rum est contemporaine
¨¤ le maladie. la d¨¦tection des anticorps quant t¡®r elle, n9est possible q¨¹e doux semaines
au moins apr¨¨s qu.e la maladi¡¯~tr se soit install¨¦e et et peut se Prolonger jusqu¡¯¨¤ 3 mois
apr¨¨s la gu¨¦rison de Ilanimal.
De telles techniques repr¨¦sentent donc un outil tr¨¨s utile da:ls 12s m¨¦thodes
de diagnostic s¨¦ro7ogiq¨¹ e i cause de leur rapidit¨¦ d9ex¨¦cution et surtout de 12 fiabi-
lit¨¦ des r¨¦sultats quvils donnent.
Les autres techniques de laboratoire ¨¦tudi¨¦es dans le m¨ºme cours (pr¨¦paration
de r¨¦actifs surtout) offrent ¨¦galcmknt un int6r¨ºt s ?r car m&k si certains de ces r¨¦ec-
tifs sont disponibles dans lu march¨¦, Leur prGparation sur place permet de mieux mai-
triser leurs perforrn~zwzs,
Cependant, la mise en application de toutes ces techniques pour la plupart
requiert l¡¯utilisation au minimum dPun mat¨¦riel. de haute pr;rfection qui doit consti-
tuer une mesure d¡¯accompagnement ¨¦troitement li¨¦e, m¨ºme si des accomodations peuvent
¨ºtre op¨¦r¨¦es au niveau de certaines ex¨¦cutions pratS.ques.
l . . / . . .
. 24 -
Pendant tout le temps qu9a dur¨¦ le cours nous avons et6 Ifobjet drune attention
toute particuli¨¨re de la part des autorit¨¦s de LOILRAD et ¨¤ ct: sujet, nous tenons ¨¤
adresser nons vifs remerciements :
Au Dr. GRAY Directeur de 191LRAD pour lvaccueil chaleureux qu¡¯il nous rl. r¨¦serv& et le
suivi conskant qu9il a su assurer au bon dkoulement du stage.
Au Dr. Jim LEMMUJ, Coordonateur de l¡¯unit¨¦ de formation pour 19e:ccelente organisation
et la richesse du programrk0 de cours et surtout 19assi~tance continue qu¡¯il a toujours
eue ¨¤ notre ¨¦gard.
Au Dr. MUSOKE, Directrice du cours pour sa disponibilit¨¦,
son d¨¦vouement et sa modestie
qu¡¯elle n¡¯a jamais m¨¦nag¨¦s afin de nous assurer un s¨¦jour tr¨¨s riche dqenseignements.
Au Dr, Mody TOTJRE responsable des relations scientifiques avec LES pr:ys francophones
pour l¡¯int¨¦ressement qu¡¯il a manifest¨¦ ¨¤ l¡¯organisation et au d¨¦roulement du stage,
A tout le personnel scientifique et technique de lvILRAD qui a t¨¦moign¨¦ d9un haut ni-
veau de connaiss¡®axes necessaires ou parfait djroulement des cours.
A tout le personnel administratif pour les facilit¨¦s accord¨¦es ¨¤ toutes nos sollicita-
tions quotidiennes.