REPUBLIQUE DU SENEGAL MINISTERE DE...
REPUBLIQUE DU SENEGAL
MINISTERE DE L’ENSEIGNEMENT SUPERWEUR
ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE
SECRETARIAT D’ETAT A LA RECHERCHE
SCIENTIFIQUE ET TECHNIQUE
INSTITUT SENEGALAIS
DE RECHERCHES AGRICOLES
CENTRE NATIONAL DE R:ECHERCHES
I.S.R,A.
AGRONOMIQUES
C.N.R.A.
BAMBEY
Bambey
,
Le développement des cultures de légumineuses d'introduction re-
conte (cas du soja au Sénégal) ou 1'amcZlioration du systeme fixateur d'azote
des légumineuses traditionnelles, necessite souvent l'utilisation d’inocu-
lum bactérien contenant du rhizobium.
Il existe
sur les marchés internationaux, divers produits de
qualités variAes, et
dont certains
donnent satisfaction.
Cependant, en raison des difficultes d$approvisi.annement,
ainsi
que du caractke
p6riseabl.e de l'inoculum, i l s ’ e s t r a p i d e m e n t aw6ré préfB-
rable de produire
l'inoculum dans le pays utilisateur.
Les f ermenteurs classiquement
utilises dans les laboratoires, sont
fort coûteux,
et souvent inadaptés aux conditions techniques prgcaires des
pays en voie de développement.
D a n s c e t t e optiqub,
le laboratoire de rhizobiolagie de Bambey
(Institut Senégalais de Recherches Agricoles, SQnégal) a
dtudié et mis au
point un syst&me eimplifi.6 de fermenteurs, qui, utilisés en série,
peuvent
constituer
un petit atelier
de production
21 l'échelle semi-industrielle.
!
II
il l
- CONCEpTION DU FERMENTEUR K
11 - Rappel des principales exigences spécifiques pour la culture
du rhizobium
+ Milieu de culture :
--.---__w----a--_-
Il se caracterise
par sa richesse en gléments nutri-
- ---____ -------__-
tifs ;On préconise, en particulier pour le rhizobium ti croissance lente
le milieu YEM (J.M.
VINCENT, 1970, BURTON, 1967) qui se compose de 'K2 HP04
0>5 9>
Mg SO4 - 7H20 0.2 g, NaCl 0,2 g, CaC03 0,1 g. Mannitol 10 g, extrait
de levure (difco) 1 g ou eau de levure 200 ml, eau distillée qsp 1000 ml,
dont le
pH est ajustti à 6,8.
La source de carbone (Mannitol) peut êtra
remplacé par
l'arabinose pour les souches japonicum et lupini (GRAHAM, 1963).
P o u r
u n e p r o d u c t i o n ii g r a n d e echelle, il est mBne
preferable
d'utiliser
le sucrose(DATE ond 01, 1975).
+ Oxygénation du milieu :
----_-----_---___--_-
Le rhizobium.est une bactérie aérobie,
qui néces-
----1-----_-_-_---m-. .-.-
Site
une aération
COritinue. Une agitation rotative peut convenir dans le
cas d'une quantité réduite de milieu de culture (inferieure
2 1) et si sa
surface de contact du milieu de culture avec l’air
ambiant est grands.
Par
contre,
pour
des volumes plus importants, i l e s t necessaire
d'oxygdner l e
milieu par un flux d'air stérilisé. SKINNER (1969), prGconis&
jusqu'8 120
litres d”air
Par litre de milieu et Par heure. ROUGHLEY (1970) pense que 5
litras par ïitre Qc milieu et par heure seraient suffisants.
+ Température de culture : La température
d'incubation du rhizobium n'est
---_----_-------------
---_----_-_-----------
pas un facteur limitant déterminant. Maintenir cependant la culture à une
température
optimale permet
de réduire
notablement le
temps de culture, donc
1;~ risques
de contamination . On considére que 25 à 30°C est
une tempera-
turc convenant
4 presque
toutes les souches de rhizobium. BURTON (1967)
propose des températures de l’ordre
de 30 à 32’ particulièrement pour les
souches "Tropicales",
& c r o i s s a n c e l e n t e .
+ Inoculation
du milieu et durée
de la culture : Une inoculation massive du
---___-----_--c-I_ -_---------------_--------
---___-_-_-_--_--_-__I__________________----
milieu de culture
permet d’atteindre rapidement la
phase expoaenticlle
de
la multiplication bacterienne
et la concentration maximum de cellules via-
bles. DATE (1975) propose d'utiliser un pied de cuve de O,? à 1 'i: du velums
du milieu de culture à inoculer.
Les
souches de rhizobium
à croissance rapide
atteignent leur
concentration maximum de cellulesviablesen 36-72 heures (temps de généra-
tion 4 heures), et celles ? croissance lente
en 108-192
heures (temps
de
génération
6-12 heures).
Il convient donc d'interrompre la fermentation d?s
que ce niveau maximum est atteint, soit une concentration
de l’ordre
de 2 à
9
72 - Descriptif
d'un module de production d'inoculum (schéma no i et 2)
121 - La cuve dc production est un cylindre étanche, en acier
-----_---------------
inoxydable (paroi : 1,5
mm 6paisseur)
dont le fond est constitué d'un pla-
teau du mâme matériau, mais d’épaisseur sup8rieurc (4 21 6
mm), de façon 5
obtenir un fond le pius plat possible. Le couvercle
(6 & 6,5 mm épaisseur)
est également plat et rendu solidaire
de la cuve par un syst8me de colle -
rette et de vis, l'étanchéité étant assurée par
un joint torique.
Les dimensions approximatives de la cuva Dont donn8oe dane le
tableau qui suit :
!
!
!
-1
, Volume utile
,Diam&tre
de la ,Profondeur
de 1-1
Volume global !
(1)
; cuve (mm)
; cuue (mm)
!
!
(1)
!
!
!
!
!
-!
!
20
!
280
!
400
!
24,6
!
!
!
!
!
!
!
35
!
340
!
4 5 0
!
40,9
!
!
!
!
!
!
!
5 0
!
360
!
600
!
61,'l
!
!
!
!
!
!
Les
dimensicns des cuves sont éteblies an tenant compte des di-
mensions classiques des autoclaves utilisés dans les laboratoires.
Des cuves de volume plus important (jusqu'à 100 1) se sont mon-
trés de manutention très
difficile; Si moins d'utiliser des moyens mécani-
ques conséquents.
122 - L'oxygénation du milieu nutritif est r8alisée généralement
------1----1-----------
9s.r
agitation pour les
volumes de milieu réduit, ou par barbotage d’air pour
des volumes plus importants.
Après
plusieurs essais de bullage avec et sans agitation simul-
tanée du milieu, on a remarqué que :
- l'agitation trop forte et
une aération excessive,
conduisent
3 la formation
de mousses abondantes, et augmentent les risques
de conta-
mination
m a l g r é l a
présenta d e s f i l t r e s d ’ a i r .
- une oxygénation insuffisante et sans agitation du milieu ra-
lentit notablement
la multiplication des rhizobium.
Nous
avons donc retenu
une oxygénation modéree (1 A 1,5 l/mn/
f ermcntour
> dont on augmente l'efficacité par un microbullage obtenu à
‘L’aide d’un verre
Ritté II@ pores : 150 à 200
>
d o n t l a pa,rtie p o r e u s e
est orientée vers le haut,
et placé excentriquement par rapport à l’axe
Los bulles d'air ainsi formées sont entrainees par l'agitation
circulaire moderée ((IOO-150 tours/mn) induite par un barreau
magnétique
(Longueur 100 m, # 28 mm). L'air est stérilisg par passage B travers un
filtr;!
Whatman (# pores : j?f pores O,>U) que l'on peut QwcntuelLowent dé-
doubler par
mesura ds précaution ,tour assurer
une parfaite sfërilisation d-l
l'air .
L’a.ir nécassairo e s t f o u r n i p a r
u n c o m p r e s s e u r à sec p r é f é r a b l e
au compresseur x'à l~huilt?'~
dont l'air propulstS est
facilement pi~ll1.16.
Hais css compresseurs
ne sont
jamais à l'abri d'une panne Svsn-
tuelle
qui immobilise totalement L’atelier,
puisqu'i.l est commun à l'an-
semble des modules de production.
Nous awtins dGnc cherché B individialiser
le fonctionnement de chaque fsrmenteur en adjoignant un petit compresseur
à chaque module.
Différents modèles ont été testés, Notr,
choix s'ust porté sur
les compresseursà mcmbrano de type "pompe
d'aquarium",
qui d'une part ré-
pondent aux
qualités reqUiSùS puur la production d’inocul,Jm, et dlautrL:
part
présentent
une scuplosse d'utilisatiun incontestable et
un faible prix
dv
rovicrlt.
123 - La régulation
thermique n'est pas indispensable sila tempé-
-----------------1_-_I_
roture ambiante du fE!rwntcur reste
constante et wuisine de 25 à 28OC pwr
i.tis souches dites " tcmpéréas”, et de 30°C
pour les souches “tropi.cales”.
A temp6ratura supkrieure,
une climatisation cl0 la piàcc: s'impssv.
Par contre, si la température
ambiantc est inférieure ÈI
25"C, môme
Lccasiünnellement,il est alors
indispansablc de prévoir 12 régulation thar-
miqua du milieu.
Plusieurs syst8mes c!e r0gulation
ont Bté testes :
- plonger
la cuve dans un bain-marie est
un système cwranrmont
utilisé, mais présente
comme inconvénients majeurs du rendre
difficile
l'agitation magnetique, et de ne pas ctre tr8s
commode d'utilisation en
particulisr pour les fermenteurs de gros volume.
- 1 ‘agitateur
chauffant muni d'une thermosonde permet Egalement
de réguler 10 milieu de culture,
mais la précision n’est
ni constsnte ni
fiable ; car ce principe
de regulation est très
sensible à toute IJariation
de tensicn
du r6seau électrique.
Le
systeme le plus avantageux semble être la r8sistanco
plongeante
ccmmandée par
une thermumùtre à
contact. Cas élements sont introduits
dans
dtjs gainos
p r é v u e s à c e t effet d a n s 10 c o u v e r c l e , ot
égal.ement excentréss
par rappcrt à ~%XC
du 1cGuw-7rnlc)-
i 2 - ?lISE EN FONCTIONNEMENT D'UN MODULE DE PRODUCTION 0
I
B
2î - Préparation du fermenteur et st6rilisation(Schéma 3)
Apr&s introduction du milieu nutritif dans la cuve (jusqu'a ICI cm
du bord
supérieur maximum, on fixe le couvercle A l’aide des ecrous de ver-
?? ?????????
? ?
Le tubo d'entrée d’air est obturé
e n t r e l e c o u v e r c l e e t 10
f i l -
tra, cc: dernier restant ouvert sur L’extérieur ;
La sortie d’air
est équipiic d'une fiole, connectée à un filtre.
La sortie d’air
est maintenue ouverte
de faLon C% permettre
l'équilibre de
pression entre
le milieu ambiant et l’intérieur
de la cuve ;
La sonde (de prél+voment est obturée,
ainsi que le tube d'inocu-
lation.
L'ensemble est introduit eans l'autoclave, et stérilisé h la
chaleur
humide a 12U"C.
Il est conseillé de proct>der systématiquement 4
dwx autoclavagos
e s p a c e s d ' u n e @riode
d e r e f r o i d i s s e m e n t do 6 à 0 hsuros.
La durée
de chaque autoclavage est fonction du volume du milieu
nutritif.
2 x 1 heure pour
des volumes de 20 litres
2 x
1 heure 30 pour
des volumes de 20 à 40 litres
2 x 2 heures pour des volumes
de 50 litres.
Après
stérilisation on laisse refroidir le fsrmenteur.
22 - Inoculation du milieu de culture (Schéma 4)
Lo fermenteur
est place devant la hotte ii flux laminaire, de
façon à pouvoir introduire l'extrémité de la sondo d'inoculation dans l'en-
ceinte stérile.
Le pied de cuve est également placé dans cette enceinte stérile.
Il est recommandé toutefois, pour faciliter
les manipulations de prévoir
un tube d'inoculation et
une sortie
latérale souple du pied de cuve suffi-
samment long, de façori à permettre leur jonction
devant un bec BUNSEN sans
avoir à manipuler le pied
de cuve, n i à i n t e r v e n i r
directumant s u r le fer-
menteur . Une personne
seule, peut dans ce cas effectuer
l'inoculation du
milieu de culture.
Opération 1 :
-.w--------..
Stériliser
à la flamme les extrêmités
du tubs d'inoculation du
fermenteur et
de la sortis latérale
du pied de cuve. DÉgager les orifices
(4) e t (6) e t tzffecturr
L'inoculation du milieu de culture.
Opération 2 :
-m.------I--
Supprimer les pinces d'obturation
(2) et (7).
Opération 3 :
---m.-------
Transvaser Id pidd da cuvu Ln PlaGant 12 contenant 50 cm au-dr;ssus
du fcrmenteur.
i'inoculurn s'ecoul~rs progrussiwsmant
clans 1~ fcrmzntcur.
Operation 5 :
- - - - - - - - - - -
L e t r a n s f e r t tormin6, o n replace
la pince (2) et on deconnccto 10
pied de cuva. L’embout place en a v a l de l a p i n c e ( 2 )
est r i n c e h l”alCoo1.
Opération 5 :
---.“---v.-e.-
Introduira stérilement
Le liquide aseptisant (chlorure
mcrcuriqut:
1 .?+,o ou eau de hd). E n l e v e r l e f i l t r e d ’ a i r .
2 3 -
L - i p r o d u c t i o n
d'inoculum
231 - Misu
on routti
------------^
Lk: frJrmbntcxtr
ainsi préparé, e s t p o s e s u r l’agitateur
magnétiquu
qui t:st aussitet mis i3fl
action ;lë c@Flprusseijr #t cocflocté Sur l'entrés d’air
rt 7i.s
en marche. Ouvrir J.e circuit d’aeratinn
cr! debridant la pince (1).
En cas de nBcessit4 do tharmo-regulation, o n inserre l a résistants
et le thosmomètsa
à contact dans les gainos plongeantes prevue5
sur le couvercle
du fermenteur,
puis on ajuste la tempesatura souhaitée.
La tmise sn température du milisu doit i>tri+ progressive.
232 - Prélhvument d'un Bchsntillon de milieu de culture
--------------------_-I-------------^-------------------.-
11 suffit ds desserrer la pince (3), e t obtur,:r
quclquC,s s o c o n d o s
la sortit< d’air.
Lo milieu
do cultur2
s'écouls dans l'ampoule dt; recupers-
tion ;
fermer
,?nsuitc l a pince ( 3 ) u,t o u v r i r (5), l e
m i l i e u s ' é c o u l e . Il
>st
:_, preférablz, aprts ct:ttc
operation, da rincar
l'ampoule avec du l'alcool
ii 900,
en l'injectant par li!
tube d1f2coulement & l'aide d'uns pissette.
233 - Vidange du f ermenteur
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
Tout dn laissant le systèmt, L!n fonctionnement (aération, agita-
tion),
cn procède
à La, vidange du contenu de la cuve par la sonde de pré-
Lèwcmcnt,
en opQrant
de la même façon qut, pour la prisa d'échantillon ; il
cnnuiant r;opandant di: coupcr préslablcmcnt le
systèms do régulation thermi-
que.
Si l'on sotihaite
aussit6t utiliser
la culture
liquide (préparaticn
d'inoculum tourbe
par axomple), il suffit de connecter
une épsoutistte
jaugec
stésilw sur le tuyau d'évacuation, et d'effectuer le transfart du ferrwn-
t!Jur
dans l’éprouvette
comme indiqué precédemment, et
de cette ddrnibre
* ,
24 - Ca acite de production d'un module
Si l'on considére que 1~ modulz
est
mis en fonctionnemunt
F;ond-nt 5 rois
~ons&cutifs (viabilité de lfinoculum SUI support tourbu dc-
6 mois :i 1 û n > , zt % raison de trois productions p.~r mois, on puut 6valu~r
1.3 production dt! culture iiquid..: à :
- 300 litres pour un volui& dc milieu par fermentetir dz 20 litrds
- 525 litres
II
If
II
35 litr,s
750 litras
11
-
II
1,
50 litres.
8 PMTERTEL
NECESSAIRE AU MONTAGE D~IJN MODULE CE PRODUCTION D" INOCULUM
3--I
r?
31 -
Cuve de production
Les aimensions appraximativos de la cuve selon le volume retenu,
sont mentionnées dans le paragraphe (221). La schbma R" 2
, prGcise h titre
d'exemple,
les carac>teri.stiques
détaillées d'une cuve de 50 litres.
32 -
Aqitation
Elle est obtenua par
un agitateur
magnétique classique j la
puissance niniwm requiss du moteur est
de l’ordre do 100 31
pour agiter
un
volume de 20 à 30 l i t r e s d e milieu, et
de 150 UI pour un
voiume de 50 litres.
Ce type d'appareil se trouve facilement dans 1,: commarce
(ex. magn8tique
? x 9 ou tharmolyne, chez Rioblock)
; on
peut t-Sgal.emont adapter
soi-m$mti
un aimant sur
un moteur
d'aqitation classique (cx : agitation-moteur à
rSgulation mécanique de l
a
vitosso)f c e systhme a l ’ a v a n t a g e d ’ ê t r e
m o i n s
onereux.
il est consceill.8 d'utiliser des barreaux aimantés de grande taille
(2 : barreau geant 108 x 26
mm) qui provoquent
une agitation érvergfqug à
vit;:sse
ds r o t a t i o n reduite.
33 - Thermo-réqulation
Il
n'ast pas nécessaire d’utiliser
des résistancus chauffantes
cie fort:3
pUiSsanci2 ; dr!s r é s i s t a n c e s d e 3 0 0 111 p o u r 1~s fermentours
d e 20 1,
,_t 500 !LI pour 1~s 35 ot 50 l i t r e s s o n t
s u f f i s a n t e s (ex : Tharmo-plonqcur
calorifuqé
dn silice pur).
C e t t e r é s i s t a
n c t:! est relitje à un thcrmomQtrV! CI
contact (à doubio
échelle 0' h 6O'C) et commandée par
un relai éloctroniqui.
34 - Circuit d’asration
ot de prelevement
Outrcl 13s f i l t r e s de steril.isation d ’ a i r (urhatman $ p o r e s 0,3 )
et 1.3 compresseur
à S>C (typa pompe d'aquarium) il. est nQcassairu de prguoi1;
Jn
c;nsombl&z da petit matoridl destine aux differents circuits :
- orlonmeyor B s o r t i e l a t é r a l e dr 500
m l (barbotags
du sortit!
d ’ a i r ) ;
- pinces à lames parallèles ;
- 2 tés en inox
de 4 mm de $ ;
- 3 embouts do tuyau inox de 4 mm de $ ut de 100 mm d,:? long ;
- 1 assortiment
de bouchon caoutchouc autoclavablz ;
- tuyau silicone Fhodosil de 6 mm, 6 mm et de F3 mm de I?I ;
- 2
tubes de barootagc:
on verre fritte,
de porosite 15O à 2OO;U..
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