No d’ordre :534 THESE présentée A...
No d’ordre :534
THESE
présentée
A L’UNIVERSITE PAUL SABATIER DE TOULOUSE
pour obtenir le grade de
DOCTEUR INGENIEUR
Abdou1 Aziz S Y
CONTRIBUTION A L’ETUDE DE
PYRICULARIA ORYZAE CAV.
- M O R P H O L O G I E , B I O L O G I E E T P H Y S I O L O G I E -
RECHERCHE IN VITRO D’ANTAGONISTES
DANS UNE PERSPECTIVE DE LUTTE BIOLOGIQUE
.Soutenue le 30 juin 1976 devant la commission d’examen :
M. C. HAMANT
Président
Me”c J. BERDUCOU
I
MM. L. ALBERTINI , bm-ninateurs
C .TOROSSIAN
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Tout au long de mon expérience au Laboratoire de Cytologie et
Pathologie Végétales de 1'E.N.S.A. Toulouse, j'ai bénéficié de l'attention,
de la disponibilité et de la confiance de Monsieur le Professeur HAMANT qui
a véritablement été l'initiateur du présent travail ; il a toujours su motiver
ma curiosité intellectuelle et aiguiser mon esprit critique ; je voudrais ici
lui exprimer ma sincère reconnaissance et mon respectueux attachement.
Mademoiselle BERDUCOU, professeur, dont j'ai gardé un très bon
souvenir apres 3 années de scolarité à 1'E.N.S.A.T.; me fait honneur en accep-
tant de participer à la commission d'examen ; je l'en remercie très vivement.
J’adresse ma profonde reconnaissance à Monsieur ALBERTINI, Ma4tw
Assistant,avec qui j'ai pu avoir des échanges enrichissants et dont les précieux
conseils m'ont été d'une grande utilité.
Monsieur TOROSSIAN, Ma4tre-Assistant, dont j'ai eu à apprécier les
qualités humaines et pédagogiques , m'a consacré un temps inestimable pour la
confection de documents photographiques ; je suis particulierement sensible à
l'honneur qu'il me fait en acceptant de participer à mon jury de thèse ; qu'il
trouve ici le gage de ma profonde gratitude.
Je remercie tout particulièrement Madame PAVILLARD, Assistant,
pour ses marques de sympathie ainsi que sa disponibilité permanente.
J’assure Monsieur LACOMBE, Assistant, de toute ma reconnaissance
pour le temps qu'il m'a consacré et ses précieux conseils afférents aux tests
statistiques.
Mademoiselle JEREMIE, dont j'ai beaucoup apprécié la patience, a
consenti un effort et un soin inestimables pour la dactylographie de la présente
thèse, je tiens à lui témoigner ma très sincère reconnaissance.
Monsieur GUERMQUCHE, ainsi que ses collègues de service, m'ont tou-
jours réservé un accueil agréable ; je les remercie du fond de moi-méme pour
l'intérét constant qu'ils portèrent à la reproduction de mon mémoire.
Mes remerciements vont également à Monsieur LAUGA, dont l'aide tech-
nique m'a procure un grand soulagement.
Je remercie Monsieur le Professeur MARIE de la Station d'Amélioration
des Plantes de Montpellier pour les informations utiles qu'il a bien voulu me
donner concernant les conditions de culture du riz sous serre.
Que l'ensemble du personnel technique et administratif de
l'E.N.S.A.T., et tous mes camarades de laboratoire soient ici remerciés pour l'a-
mabilité qu'ils surent me réserver.
Je remercie enfin tous mes camarades et amis auprès de qui j'ai
toujours trouvé un soutien sans limite.
S O M M A I R E
Pages
INTRODUCTION. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . m
1
- PREMIERE PARTIE -
CARACTERES DESCRIPTIFS, BIOLOGIE ET PHYSIOLOGIE DE
Pyrdcularia oryzae CAV. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . e
5
CHAPITRE PREMIER - ISOLEMENT ET PURIFICATION DE P. ozyzae,
ETABLISSEMENT DE CULTURES MONOCONIDIENNES, CYCLE EVOLUTIF DU
PARASITE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
6
1 - ISOLEMENT ET PURIFICATION DE P. oryzae . . . . . . . . . .
6
1.1 - Le matériel végetal
. . . . . . . . . . . . . . . .
6
1.2 - Révélation du parasite. . . . . . . . . . . . . . . .
6
1.3 - Isolement et purification : obtention de cultures
pures . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
7
II - ETABLISSEMENT DE CULTURES MONOCONIDIENNES . . . . . . . .
8
2.1 - Préliminaire. . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
8
2.2 - Méthode de dilution . . . . . . . . . . . . . . . .
9
2.3 - Méthode de la dilution améliorée. . . . . . . . . .
10
III - CYCLE EVOLUTIF DE L'AGENT PATHOGENE. . . . . . . . . . .
1 1
3.1 - Prélim naire . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1 1
3.1.1 - Remarque . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1 1
3.1.2 - Conservation des souches . . . . . . . . . .
1 1
3.2 - I n f e c t on de l'ht3te . . . . . . . . . . . . . . . .
1 2
3.2.1 - L'hbte . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
12
3.2.2 - L'inoculum . . . . . . . . . . . . . . . . .
13
3.2.3 - Technique d'inoculation. . . . . . . . . . .
1 3
3.2.4 - L'infection. . . . . . . . . . . . . . . . .
13
3.3 - Symptbmes de la pyriculariose . . . . . . . . . . .
1 4
3.3.1 - La pyriculariose foliaire ou "LEAF BLAST". .
1 4
3.3.2 - La pyriculariose du cou. . . . . . . . . . .
15
3.3,.3 - Notations en serres après inoculation
artificielle . . . . . . . . . . . . . . . .
16
3.4 - Dissémination . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
16
3.5 - Longévité . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
17
SHAPITRE DEUXIEME . CARACTERES DESCRIPTIFS DE PyricuZatiaI
oryzae CAV.. * . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1 8
I- CARACTERES MORPHOLOGIQUES ET CYTOLOGIQUES DE L'AGENT
PATHOGENE. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1 8
1.1 - Le conidiophore . . . . . . . . . . . . . . . . . .
18
1.2 - Les conidies. . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1 9
1.3 - Caracteres cytologiques . . . . . . . . . . . . . .
21
II - CARACTERES CULTURAUX EN FONCTION DU MILIEU. . . m . . . .
2 2
2.1 - Morphologie de la culture . . . . . . . . . . . . .
2 2
2.2 - Lemycélium . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2 3
2.3 - Le revers des cultures. . . . . . . . . . . . . . .
2 3
HI1 - CARACTERES CULTURAUX EN FONCTION DE LA TEMPERATURE . . u
2 3
I V - CARACTERES CULTURAUX EN FONCTION DU pH (tampon Mc Ilvaine,
annexe technique no 7). . . . . . . . . . . . . . . . . u
2 4
CHAPITRE TROISIEME -
-
-
BIOLOGIE ET PHYSIOLOGIE DE PyrieuZaria~
oryzae CAV.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2 5
1 - PARAMETRES DE LA CROISSANCE DE PJ. oryzae. . . . . . . . .
2 5
1.1 - Préliminaire.
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
25
1.2 - Paramètres trophiques . . . . . . . . . . . . . . .
2 6
1.2.1 - Nature des milieux utilisés. . . . . . q , .
2 7
1.2.2 - Définition de l'inoculum . . . . . . . e . .
2 7
1.2.3 - Résultats. . . . . . . . . . . . . . . e , .
2 7
1.2.3.1 - Croissance en milieu solide . . . . .
2 7
1.2.3.2 - Croissance en milieu liquide. . . . .
28
1.2.4 - Expression des résultats : discussion. I . .
2 9
1.3 - Action de la température. . . . . . . . . . . . . .
3 3
1.3.1 - Résultats. . . . . . . . . . . . . . . . . .
3 3
1.3.2 - Expression graphique : interprétation. . . .
3 3
1.4 - Action de l'héméropériode . . . . . . . . . . . . .
3 5
1.4.1 - Résultats. . . . . . . . . . . . . . . . . m
3 5
1.4.2 - Expression graphique : discussion. . . . m .
3 7
1.5 - Action du pH sur la croissance de PJ. ozyzae. . * .
37
1.5.1 - Résultats. . . . . . . . . . . . . . . . . *
37
1.5.2 - Expression graphique des résultats :
discussion . . . . . . . . . . . . . . . . .
3 8
1.5.2.1 - Préliminaire. . . . . . . . . . . . .
3 8
1.5.2.2 - Analyse des courbes traduisant la
croissance pondérale en fonction du
p H . . . , . . . . . . . . . . . . . .
3 9
1.5.2.3 - Analyse des courbes traduisant le
phénomène d'autolyse. . . . . . . * .
45
1.5.2.4 - Régularisation du pH. . m . . . . . .
4 5
1.5.2.5 - Croissance radiale du parasite en
fonction du pH. . . . . . . . . . . .
4 6
II - PARAMETRES DE LA CONIDIOGENESE DE PyricuZarial oryzae . .
4 6
2.1 - Influence du milieu sur la conidiogénèse. . . . . .
48
2.1.1 - Précocité de la sporulation. . . . . . . . .
48
2.1.2 - Caractéristiques des conidies en fonction
du milieu. . . . . . . . . . . . . . . . . .
48
2.2 - Influence de la température sur la conidiogénèse. .
4 9
2.3 - Influence du pH sur la conidiogénèse. . . . . . . .
50
2.3.1 - Sur la précocité de la conidiogénèse . . . .
50
2.3.2 - Intensité de la conidiogénèse en fonction
dupH....................
5 2
2.3.3 - Caracteres des conidies en fonction du
pH.......... , . . . . . . . ..e
5 2
2.3.4 - Cinétique de la sporulation. . . . . . . . .
5 5
III - PROBLEMES RELATIFS A LA GERMINATION DES CONIDIES . . . .
5 6
3.1 - Germination en relation avec la concentration
conidienne : rbultats, expression, discussion. . .
5 7
3.2 - Germination des conidies en fonction de la
température : résultats, expression, discussion . .
58
3.3 - Germination des conidies en fonction du pH :
résultats, expression, discussion . . . . . . . . .
5 9
3.4 - Germination des conidies en fonction de l'hémé-
ropériode : résultats, expression, discussion . . .
6 0
- DEUXIEME PARTIE -
CONTRIBUTION A L'ETABLISSEMENT D'UNE METHODE DE LUTTE BIOLOGIQUE
CONTRE FyticuI-aria oryzae CAV . . . . . . . . . . . . , . a . . . .
6 2
CHAPITRE PREMIER - DEFINITION DU MATERIEL BIOLOGIQUE ET CRIBLAGE
SELECTIF DES GERMES SAPROPHYTES. . . . . . . . . . . . . . . .
67
1 - GERMES CRYPTOGAMIQUES. . . . . . . . . . . . . . . . . a .
6 7
1.1 - Fyticularia~ oryzae CAV. . . . . . . . . . . . w .
6 7
1.2 - Germes saprophytes isolés a partir du riz . . . . .
6 7
1.3 - Germes fournis par BAARN. . . . . . . . . . . . . .
68
II - CRIBLAGE SELECTIF EN VUE DU CHOIX DES GERMES UTILISA-
BLES DANS UNE PERSPECTIVE DE LUTTE BIOLOGIQUE
(Planche no 1). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
6 8
III - GERMES SELECTIONNES. . . . . . . . . . . . . . . . e . .
72
CHAPITRE DEUXIEME - MISE EN EVIDENCE DU PHENOMENE D'ANTAGONISME
-
-
in vitro . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
73
1 - PRELIMINAIRE . . . . . . . . . . . . . . . s . . . . . . .
73
1.1 - Comportement des germes en fonction de la
température . . . . . . . . . . . e . . . . .
. .
74
??
1.2 - Comportement des germes en fonction de
l'héméropériode . . . . . . . . . . . . . . .
. *
77
??
1.2.1 - Résultats. . . . . . . . . . u . . . . . . .
78
1.2.2 - Caractères descriptifs en fonction de
l'héméropériode. . . . . . . . . . . . . . .
79
1.2.3 - Expression graphique . . . . . . . . . . . .
79
1.3 - Comportement des germes en fonction du pH . . . . .
79
1.3.1 - Formulation des résultats. . . . . . . . . .
a4
1.3.2 - Caracteres descriptifs en fonction du pH
après 3 jours d'incubation . . . . . . . . .
a4
1.3.3 - Expression graphique . . . . m . . . . . . .
a5
1.4 - Synthese. . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. .
a5
II - EXPERIENCE DE MISE EN EVIDENCE DU PHENOMENE D'ANTAGO-
NISME in vitro : CONFRONTATION SIMULTANEE (CS) DU
PARASITE AVEC LES GERMES “ANTAGONISTES” . . . . . . . . .
a7
2.1 - Appréciation de l'inhibition (%) exercée par les
germes antagonistes sur la croissance radiale
(mm) dePI. oryzae. . . . . . . . . . . . . . . . .
a7
2.X.1 - Caractères descriptifs . . . . . . . . . . .
88
2.1.1.1 - Examen macroscopique (Planche no II).
88
2.1.1.2 - Examen microscopique (Planche no III).
90
2.1.2 - Expression graphique des résultats
(fig. 16 A et C) : interprétation. . . . . .
91
2.2 - Appréciation de l'inhibition (%) exercée par les
germes "antagonistes" sur la croissance en sur-
face (cm2) de PJ. oryzae . . . . . . . . . . . . . .
93
2.2.1 - Résultats. . . . . . . . . . . . . . . . . .
93
2.2.2 - Expression numérique des résultats . . . . .
94
2.2.3 - Signification. . . . . . . . . . . . . . . .
94
2.3 - Expression graphique des résultats : discussion . .
95
2.3.1 - Analyse comparative des pourcentages d'inhi-
bition relative des croissances radiale (mm)
et en surface (cm2) de PI. oryzae confronté
durant 5 et 7 jours aux germes "antagonistes"
(cf fig. 16, diagrammes A-C et B-D respec-
tivement). . . . . . . . . . . . . . . . . .
95
2.3.2 - Evolution du pourcentage d'inhibition de la
croissance en surface (cm2) de Pl. oryzae
exercée par les germes "antagonistes" en
fonction du temps ; PCA/25OC/pour 2 valeurs
de pH/obscurité continue . . . . . . . . . .
98
2.3.3 - Représentativité de chacune des methodes . .
98
2.4 - Remarques . . . . . . . , . . . . . . . . . . . . .
98
CHAPITRE TROISIEME - ESSAI D’INTERPRETATION DU PHENOMENE D’ANTA-
GONISME in uitm . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
103
I- REMARQUE PRELIMINAIRE. . . . . . e . . . . . . . . . . . ,
103
II - CONFRONTATION DU PARASITE ET DES GERMES ANTAGONISTES SUR
MILIEU SOLIDE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
104
2.1 - Confrontation différée du parasite avec les
germes antagonistes . . . . . . . . . . . . . . . .
104
2.1.1 - Résultats. . . . . . . . . . . . . . . . . .
104
2.1.2 - Observations . . . . . . . . . . . . . . . .
105
2.1.2.1 - Examen macroscopique (Planche no IV).
105
2.1.2.2 - Examen microscopique (apres 6 jours
d'incubation ; planche no V). . . . .
105
2.1.3 - Expression numérique des résultats . . . . .
106
2.1.4 - Expression graphique : discussion. . . . . .
106
2.2 - Conjugaison des confrontations simultanée et
différée (CS x CD) du parasite avec les germes
antagonistes (Planches no VI et VII). . . . . . . .
109
2.2.1 - Résultats. . . . . . . . . . . . . . . . . .
109
2.2.2 - Expression numérique des résultats . . . . .
1 1 0
2.2.2.1 - Relativement au témoin
Tl = PJ. oryzae x 0 . a . . . . . . .
1 1 0
2.2.2.2 - Relativement à T2 = Sel X (3) . . . .
110
2.2.3 - Expression graphique (fig. 20) :
discussion . . . . . . . . . s . . . . . . .
111
2.2.3.1 - Par rapport à Tl. . . . . . . . . . .
111
2.2.3.2 - Par rapport à T2. . . . . . . . . . .
113
2.3 - Essai de mise en évidence de la production d'anti-
biotiques en milieu liquide . . . . m . . . . . . .
1 1 4
2.3.1 - Résultats. . . . . . . . . . . . . . . . . .
194
2.3.2 - Discussion . . . . . . . . . . . . . . . . .
116
III - CONFRONTATION DU PARASITE ET DES GERMES ANTAGONISTES SUR
MILIEU LIQUIDE : CROISSANCE PONDERALE (mg) DU PARASITE
INCUBE SUR FILTRAT OU MELANGE DE FILTRATS DE CULTURES
DES GERMES ANTAGONISTES. . . . . . . . . s . . . . . . .
117
3.1 - Résultats . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
118
3.2 - Expression numérique des résultats. . . . . . . . .
119
3.3 - Expression graphique (fig. 21 et 22) : discussion .
119
3.3.1 - Relativement au pH, 4,lO . . . . . . . . . .
119
3.3.2 - Relativement au pH0 6,D. . . . . . . . . . .
122
3.3.3 - Remarques.
. . . . . . . . . . . . . . . . .
123
IV - INFLUENCE DE L’ANTAGONISTE SUR LA GERMINATION DES CONIDIES
DU PARASITE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . <I
. .
125
4.1 - Action de la suspension conidienne (SC) et du
mélange de SC (dans l'eau distillée) des antago-
nistes sur la germination du parasite . . . . . . .
126
4.1.1 - Préliminaire . . . . . . . . . . . . . . . .
126
4.1.2 - Résultats et expression numk ique. . . . . .
128
4.1.3 - Expression graphique (fig. 23 et 24) :
discussion . . . . . . . . . . * . . . . . .
128
4.2 - Action des filtrats "naturels" (FCN) et filtrats
autoclavés de cultures (FCA) des germes antagonis-
tes sur la germination des conidies de PJ. oryzae .
132
4.2.1 - Résultats et expression numérique. . . . . .
132
4.2.2 - Expression graphique : discussion. . a . . .
132
4.3 - Influence du mélange de filtrats "naturels" (MFCN)
ou autoclavés (MFCA) des cultures antagonistes agées
de 10 j/25"C/obscurité continue sur la germination
des conidies de Pl. oryzae. . . . . . . s . . . . .
136
4.3.1 - Résultats et expression numérique. . . . . .
136
4.3.2 - Expression graphique (fig. 27 et 28) :
discussion . . . . . . . . . . . . . . . . .
136
4 . 4 - Influence des conidies antagonistes maintenues en
suspension dans le liquide de culture (CMS) sur la
germination des conidies du parasite. . . . . . . .
140
4.4.1 - Résultats et expression numérique. . . . . .
141
4.4.2 - Expression graphique : discussion. . . . . .
142
4.5 - Remarques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
142
CHAPITRE QUATRIEME - ELEMENTS DE REFERENCE : ACTION DE QUELQUES
FONGICIDES SUR LA CROISSANCE MYCELIENNE DU PARASITE. . . . . .
144
1 - EXAMEN MACROSCOPIQUE (cf planches no VIIIA et VIIIB) . . .
144
1 . 1 -Bénomyl . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
144
1.2 - Chloronèhe.
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
145
1.3-EL-291.......................
145
1.4 - Tridémorphe . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
145
II - R E S U L T A T S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
146
III - EXPRESSION NUMERIQUE : DISCUSSION. . . . . . . . . . . .
147
CONCLUSION GENERALE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
150
SYNTHESE DES ABREVIATIONS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
157
BIBLIOGRAPHIE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
159
ANNEXES TECHNIQUES. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
173
PLANCHES PHOTOGRAPHIQUES
INTRODUCTION
Du fait de l'accroissement de la consommation de riz dans le monde,
de nombreux cultivars hautement productifs ont été mis au point dans le sud-est
asiatique notamment ; ces cultivars ont cependant dû @tre progressivement délais-
sés en raison de leur sensibilité à la pyriculariose.
Connue par le passé sous le terme de "fièvre du riz" usité dans la
littérature chinoise et japonaise , successivement décrite par TSUCHIYA (1.704),
MIAYANAGA (1788), KOJIMA (1793)) KONISHI (1809)) la pyriculariose a en realité
eté signalée depuis 1637 en Chine par SOONG YING-SHIN dans son ouvrage intitule
"Utilisation des ressources naturelles".
En Italie, la maladie alors connue sous l'appellation de brusone
-
-
fut décrite par ASTOLFI (1828), BRUGNATELLI (1838) et GERA (1846).
METCALF (1906, 1907) au vu de l'intensité des dégâts engendrés par
la pyriculariose en 1876 dans le sud de la Caroline, la dépeignit comme étant
la plus grave parmi les 8 maladies importantes répertoriées sur le riz aux
U.S.A.. Il fut le premier à lui attribuer la dénomination anglaise de "blast'".
En Inde enfin, la présence de la maladie daterait de 1913 ; l'épidé-
mie catastrophique observée dans l'état de Madras en 1919 serait imputable a
i'agent de la pyriculariose (PADMANABHAN, 1965).
En raison de sa plasticité par rapport aux conditions du milieu, de
son spectre de répartition et des attaques graves engendrées par l'agent patho-
@ne 5 la pyriculariose est considérée comme étant la principale maladie du riz
dans le monde.
-2-
Les recensements du C.M. 1. ("Commonwealth Mycological Institute")
de Ig7'l!, rëvelent sa présence dans 70 pays des cinq continents (cf annexe
no 9).
Dans le cas particulier du Sénégal, la pyriculariose semble coloni-
ser des régions de plus en plus vastes :
- 1951, CHEVAUGEON (cité par BOUHOT et MALLAMAIRE dans "les principales
maladies des plantes cultivées au Sénégal") établissait la rareté de la maladie.
- 1972, l'I.R.A.T. la définit comne étant "la principale maladie cryptoga-
mique du riz au Sénégal"(cf "les variétés de riz au Sénégal" - juillet 1972).
- Mai 1974, nous avons isolé et purifié le parasite à partir de la variété
L.5.26 récoltée à SAVOIGNE (delta du fleuve Sénégal) ; cette région nord-ouest
du pays etait jusqu'alors exempte de germes infectieux.
- Octobre 1974 enfin, nous observons des infections paniculaires dans les
parcelles de ROSSO en Mauritanie ; l'introduction de la riziculture datait seu-
lement de quelques années (à l'origine, il y aurait eu notamment une importation
de semences infectées).
La persistance et l'extension de la maladie ne sont donc plus à dé-
montrer tant sur le territoire sénégalais que dans le monde.
Les pertes et dégâts occasionnés par la maladie sont considérables ;
quelques chiffres suffisent pour nous en convaincre :
- Au Japon, en 1953, les pertes étaient évaluées à 800 000 tonnes.
- Durant la campagne agricole 1960-1961 en Inde, les pertes s'élevèrent à
266 000 tonnes.
-' En 1960, au Japon, les pertes furent estimées à 273 000 tonnes (soit
24,8 % du total des pertes dues aux insectes, au froid, au typhon, aux inonda-
tions et maladies diverses).
- De méme en 1962 (toujours au Japon), sur 909 000 ha traités chimiquement,
l'infection paniculaire eut malgré tout lieu sur 721 000 ha.
- Au Sénégal, en octobre 1974, nous avons été amenés à observer le grillage
foliaire très précoce affectant la variété 6044 sur près de 44 ha (MEDINA SANGAKO
au SINE-SALOUM).
-3-
L'attaque foliaire pendant ou avant le tallage peut ~!eterminer la
destruction complè,te de l'hôte (cf planche n*XA) '; moins précoce, elle engendre
malgré tout un rabougrissement des plantes, une réduction du nombre de p-anicu-
les mures ainsi qu'une diminution du poids de 1 000 grains.
L'infection paniculaire est d'autant plus catastrophique qu'elle est
précoce,
L'attaque du cou aboutit à une profonde altération qualitative et
quantitative des grains (cf planche no 9).
L'agent phytopathogène, baptisé pour la première fois QricuRzria
oryzae par CAVARA en 1891 (Italie) fut décrit par SHIRAX en 1896 (Japon).
L'espece PyrimZaria oryzae Cav. se définit selon le diagrarrme
suivant :
- Classe des Champignons,
e- Groupe des Adelomycètes (champignons imparfaits),
- Ordre des Moniliales,
- Famille des Mucedinacées,
-- Gen w Pyricularia.
L'amélioration des resistances verticale ou horizontale de l'hôte,
l'influence du type de fertilisation et le rôle des techniques culturales sur
les relations hôte-parasite, l'action des facteurs physiques (température, humi-
dité, lumière, etc...) et chimiques (oxygene, etc...) du milieu sur le parasite,
la chimiothérapie, l'étude des mécanismes agressifs de l'agent pathogène, la
multiplicité des races physiologiques, etc..., sont autant de thèmes importants
préoccupant les chercheurs pour une meilleure connaissance et partant, un meil-
leur contrôle des relations hôte-parasite.
A ce jour cependant, aucune solution définitive n'a été trouvée au
problème de la pyriculariose en raison notamment de la très forte variabilité
de l'agent pathogène (PARTHASARATHY et OU, 1965) ; peu de choses ont été tentées
dans le domaine de la lutte biologique ; on sait seulement que des souches avi-
rulentes du parasite, préalablement inoculées sur l'hôte pouvaient induire une
meilleure tolérance voire une meilleure résistance de celui-ci vis-à-vis d'une
souche virulente (YOSHII, 1950 ; KIYOSAWA et FUJIMAKI, 1967).
-4-
Nous nous proposons, dans la présente etude, d'apporter une modeste
contribution pour combler ce que nous osons appeler une lacune.
La lutte biologique, impliquant des organismes vivants est évidem-
ment des plus complexes, des plus délicates yuisqire les composantes fondamenta-
les en sont :
- la recherche de germes antagonistes,
.- la définition de l'action des germes considerés sur tous les élëments
de la biosphère : l'antagoniste, outre son action contre le parasite, ne doit
manifester aucune influence néfaste,directe ou indirecte sur 1 "hbte, les vegétaux
u,tiles du milieu, l"homne:, les animaux, l'envsronnement de façon genérale,
- l'étude du mécanisme du phénomene d'antagonisme,
- la définition des conditions d'application (temperature, humidité, etc...)
et d'efficacité,
- Tes problèmes économiques posés par Ta vulgarisation.
.
La première partie de ce travail traitera de la morphologie, la bio-
logie et de la physiologie du parasite ; 1"objet de ?a deuxieme partie étant la
mise en évidence du phénomène d'antagon9sme ainsi que de l"essai d'interpréta-
tion des mécanismes impliqués.
Quant au matériel biologique de base, a1 comporte :
- Les variétés hotes :
.__
.-
les échantillonnages ont e?;é réalisés soit en plein
champ, soit en parcelles expérimentales au cours de prospections effectuées au
Senégal et en Mauritanie au cours des campagnes agricoles 1973 et 1974 ; au to-
tal, nous avons observé, noté et récolté 77 varlétes dont la liste est con,si-
gnée dans l'annexe pIo 8.
- Les germes cryptogamiques : classés dans le tableau 118 et le paragraphe
1.3 de la deuxieme partie (p. 68).
~ÈRE
P A R T I E
CARACTERES DESCRIPTIFS,
BIOLOGIE ET PHYSIOLOGIE DE
P~r7kuZarict oryzae C~V.
C H A P I T R E P R E M I E R
1 SQLEMENT E T P U R 1 F I C A T I O N D E ?. oryzae
E T A B L I S S E M E N T D E C U L T U R E S M O N O C O N I D I E N N E S
CYCLE EVOLUTIF DU PARASITE
1 - ISOLEMENT ET PURIFICATION DE z-. ory~tn
- - -
- - - - . -
1 . 1 - Le matériel végétal
Le matériel végétal qui a servi à nos experiences a été récolté en
CASAMANCE (région sud du Sénégal), dans le périmètre expérimental de l'I.F!,A.T.
(Institut de Rec herches Agronomiques Tropicales et des Cultures Vivrières) connu
sous l'appellation de SEFA.
Ce matériel a été récolté le 17 septembre 1.973 ; le séchage et la
conservation ayant eté réalisés dans du papier journal a l'abri de l'humidité.
1 . 2 - Révélation du parasite
--_I_
Quelle que soit la technique employée, elle requiert toujours une
humidité relative élevée ; deux méthodes ont été utilisées pour révéler et ex-
térioriser le parasite présent dans les lésions foliaires.
- Dans la première, le fragment foliaire porteur de lésions est directement
- 7 -
.
.
i
<L L J
1. Ise*?ernent et qw-~i Fication
: obtentjon de cultures pures
. ..-.-_" --_---. ~ -----_--..-----_..--- --- ,-- _.I. _--_-"_ ..,--<. --...----.11
iiprf!s 3 à 4 jours d'incubation, la d@tection de t!. LW~ZCXS se fait
C;d i::.i ')(y-a;'ta j pe '; c 'est 5. 'la lumière de ces observations que la deuxième méthode
lieus Est apparue preférable
: en effet, la prtisence d'une multjt;ude de saprophy-
tes masque tres preicocement les colonies tres discrètes du parasite ; par contre,
: 2 jeijh -i t?,me tra-j tement )I s"i1 n'elimine pas errei6remer:t la proliferation de ger-
ws tel ,J 1 es %4;:,7 o1 ri It~rw~~k~, ~;.~rl324l~::1’:~d, :'r.~:~kc'~-rnl~.,""c; ) etê ) . . en 1 imite tout
au iwins l'ïnstallation.
Par ailleurs, nous avons, au cours de cette opération, été confron-
tés ac~ problème de souillure par des germes bactériens ; nous disposions alors
d'une série de mt!thodes dont certaines ont fait 1 'objet d'une application et ont
abouti à des rësultats plus ou moins satisfaisants :
'- Incorporation dans le substrat nutritjf d'antibiotique spécifique : en
.v-Ve------, .~-ll_-ll_- l_--.. __--_-_-._l-_---
-
-
1 ' wxrence y nous avions opéré avec de la streptomycine (bactéricide et bacté-
rIostitti!~uej mais awons dir renoncer à ce procCd6 du fait que l'antibiotique @tait
:;~O!S induire une modification des caracteristique5 physiologiques du parasite
et pa;qJnt son i:ornportement phytopathogène ; c 'est du reste ~3 c't tftre que nous
avons préf&6 1 'hypochlorite de sod.iurn 10 % au chKwure mercurique comme désin-
C~ec,Lan~t: superfr ciel <
'. irlcehcde prëi;onis& par VOLKQNSKY " f? c,"ag"it d'ensemencer un milieu gëlo-
.----. ^_--.-_- ---.-_, I_ -"-~ -,--,----- _
s 16 :, Ta face ifiterne du couvercle aÿant eté pr:ialablemerrt recouverte par un peu
,Fj 1 1 r$j 'i j !? i,j 3' 1 rj 5 6 ) nous incubons à l'ktuve couvercle en bas ; le myc6lium en
t:ri~'-is:;~t:r:e finit. par venir au contact du couvercle quï fournit dès lors un ino-
-8-
1:ulum exempt. de ge'rmes etrangers et conduisant après repiquage à une culture
pu rc .
Cette méthode nous a semblé inadéquate d'abord parce que le germe
'i,e C:aractérise par une croissance en surface et non de type aérien ; ensuite
parce que des bactéries se développant plus vite que la colonie parasite par-
yienn-nt dans un tres bref délai (48 heures environ) a recouvrir l'inoculum à
purifier.
Compte-tenu de, la croissance relativement lente du parasite étudié3
~OU!; avons éliminé ce procédé de purification.
- Technique de RAPER (1937) : un anneau de verre prklablement stérilisé
-
-
-
-
-
est placé dans une boite de Petri stérile ; le milieu gelosé est coulé jusqu'à
,trcis-quarts de la hauteur de l'anneau ; l'inoculum à purifier est placé au cen-
tre de l'anneau ; on observe alors la persistance des germes bactériens a l‘inte-
rieur de l'anneau tandis que ceux du champignon migrent a 1"extérieur de l'anneau
par la zone de contact emntre la base de l'anneau et le fond de la boîte de Petri.
Seule la première méthode avait retenu notre attention, dans la pé-
riode où nous réalisions une incubation sans désinfection prealable ; nous avons
contourné ces difficultés supplémentaires de purification en procédant à une
désinfection préillable ; dès lors il est possible, moyennant le respect des
conditions d'asepsie, d'obtenir directement une culture pure aprës un seul repi-
quage ,
A TITRE INDICATIF, nous citons une méthode de purification consis-
tant à ensemencer l'inoculum à purifier dans un tube incliné qui est ensuite
'dressé verticalement ; les auteurs affirment que le dëveloppement des champignons
s'efb'ectuerait vers la région supérieure du substrat et se detacherait des germes
bactWiens ; il suffirait d'un repiquage pour obtenir une culture pure
(cf RAPILLY dans "TECHNIQUES DE MYCOLOGIE EN PATHOLOGIE VEGETALE"' : obtention de
cultures pures'I).
1s - ETABLISSEMENT DE CULTURES MONOCONIDIENNES
2.1 - Préliminaire
Une preuve éclatante de la variabilité des races de P2jY’<i?l4 Zm~rx oryzue
2 , i - Mét.rtcide de d i 1 uti on
.-.-. . ..--" ,.._. .._- _- _.-. -.-.- . ..-
“ u - l I - * I - ~
C . . - . l , . . l
_ ,_--.
-.
- _ - -
-
- - - _ I _ m . - - - I - _ I
- 10 -
considérée donnerait d'emblée une culture monoconidjenne.
La relation UNE CONIDIE-UNE COLONIE n"étant pas nécessairement véri-
fiable, cette méthode ne nous paraft pas sike ; de plus, la chance d'obtenir
des colonies reellement issues de conidi es isolées est d'autant plus grande que
la concentration est réduite ; or, plus la concentration de l'inoculum est fai-
ble dans cette méthode, plus s'amenuise la fréquence des conidies dans le volume
étalé ; d'où la nécessité d'un nombre él evé de répétitions et 1 "utilisation d'un
matériel considérable.
Enfin, au fil des dilutions successives, une infime quantité de ger-
mes étrangers dans l'une des dilutions mères suffirait pour contaminer toutes
celles de concentration inférieure et partant rendrait difficile l'établissement
d'une culture monoconidienne.
Pour toutes ces raisons nous avons dii délaisser cette méthode qui
nous para4t moins satisfaisante que celle de la dilution améliorée.
2.3 - Méthode de la dilution améliorée
Nous réalisons une suspension conidienne mëre à partir de la culture
pure determinée plus haut ; par dilutions successives, nous ajustons la concen-
tration conidlenne à environ 1 000 conidies/ml
; cette concentration permet, à
l'aide d'une pipette' PASTEUR très fine, de déposer sur une lamelle des micro-
gouttes ne renfermant qu'un nombre très réduit de conidies à défaut d'une seule.
Le dénombrement des conidies présentes dans une microgoutte se fait au micros-
cope, le dessechement de la microgoutte étant évité par 1"usage d'une chambre
hum<de de VAN TIE:GHEM préalablement stérilisée.
Ayant repéré la ou les microgouttes ne renfermant chacune qu'une
SEULE conidie, nous les captons individuellement par la pointe d'un triangle de
papier filtre stérilisé ; le fragment de papier filtre ainsi chargé d'une coni-
dia est aseptiquement déposé à la surface du substrat nutritif qui est inocule
et incubé à 28°C.
Cette technique très délicate nous a neanmoins permis en 12 jours
d'observer une colonie très nette dont la multiplication nous assurait suffisam-
ment d'inoculum pour pouvoir démarrer les expériences proprement dites. Par cette
méth,ode, nous avons établi 11 cultures monoconidiennes notées Se i (i = 1 à 11)
* 11 -
et 7 cultures monoconidiennes notées
IKPj à partir de l'hi3te !KONG PAO.
.III - CYCLE EVOLUTIF DE L'AGENT PATHOGENE
3.1 - Préliminaire
3.1.1 - Remarque
Partant d'une culture monoconidienne, nous aboutissons, au fil des
repiquages, à une culture relativement différente de celle de départ ; ce qui
se traduit généralement par une réduction de la croissance, probablement liée à
une variation dans la physiologie du parasite ; dès lors, le recyclage du
1'. oryzae sur l'hôte nous para'it nécessaire puisqu'au cours de la confrontation
HOTE-PARASITE, ce dernier retrouve certains de ses caractères de base (exemple :
taille, forme, vitesse de croissance, etc...) ou en acquiert de nouveaux à la
faveur des relations nouvellement établies avec l'hote.
3.1.2 '- Conservation des souches
Dans l'état actuel de nos travaux, nous avons réalisé un repiquage
toutes les 2 à 4 semaines ; nous n'avons observé aucune réduction de croissance.
Nous avons, par ailleurs, conservé des souches à température de
10°C; pendant 60 jours ; le substrat nutritif utilisé étant soit de l'eau de
pomme de terre (20 g de pomme de terre par litre d'eau), soit du PCA 50 % (10 g
de pomme de terre, 10 g de carotte, 3. 000 ml d'eau distillée) ; aucune réduction
de croissance n'a été observée ; mieux, le repiquage sur PCA révèle ml5me une vi-
tesse de croissance relativement plus importante que celle observée à partir
d'un inoculum régulièrement reproduit sur PCA.
De nombreux auteurs ont préconisé l'usage de la basse température
(4°C) ; le substrat usité est généralement appauvri : exemple, MILIEU de
SABOURAUD (glucose massé = 30 g ; peptone = 10 g ; gélose = 20 g ; eau distillée =
1 000 ml) ; eau de pomme de terre ou encore malt à 1 %.
Cette dernière méthode permettrait des repiquages espacés de 6 mois.
Il convient de situer ici le problème très fréquent des pollutions
aux températures moyennes (20°C et 15°C notament) ; ce qui, à notre avis, tien-
a*----
,“U.--l”-.---
---
----l----UI~-m.lsl-
. 12 ”
;;?ait d la ventilation necessaire pour une bonne régulation thermique ; 1 'enve-
loppement minutieux des boFtes de Petri par du papier filtre devrait permettre
de pallier cet inconvenient.
Enfin la presence d'acariens
doit être systématiquement combattue
pckr une desinfection prealable des étuve s à l'alcool éthylique 95" puis néces-
sairemedi au formol .
A ce propos, il nous paraft plus aisé de conserver intacte une cul-
ture en tube incline ou en erlenmeyer qu'en bofte de Petri.
3.2 - Infection de l'hôte
------I_L.--
3.2.1 - L'hôte
Les graines de trois variétés de riz (63-83 ; SEFA 302 G ; IKONG-
PAO) sont abondamment rinciies à l'eau de robinet d'abord, à l'eau permutée en-
suite afin d'éliminer les fongicides de conservation ; elles sont alors réparties
dans les boîtes de Petri tapissées intérieurement par du papier filtre humecté
(50 graines par boite de Petri de diamètre 90 mm) ; la prégermination dure
5 jours ; à cet age,, la première racine et le coléoptile sont tres nets ; le
repiquage se fait SLW perl ite ; pendant les 5 à 7 jours qui suivent la date de
repiquage, l'arrosage se fait à l'eau permutée ; au-dela, nous arrosons à l'aide
d'une solution nutritive de KIMURA dont la formule est définie dans l'annexe
technique no II.
Cependant, un procédé encore plus avantageux parce qu'aussi satis-
faisant et relativement plus simple, consiste à repiquer les graines prégermées
sur dae la terre de jardin débarrassée des grosses particules par tamisage et
lestée par environ 20 % de fumier.
Une fois par mois, nous avons arrosé à l'aide de la solution nutri-
tive de KIMURA pour suppleer à un épuisement éventuel des réserves du substrat
de culture. Pendant la durée de l'expérience (octobre à avril), la photopériode
s'est révélee comme étant une donnée fondamentale ; la faible intensité lumi-
neuse diu jour impose un éclairage intense de 35 000 lux (mesure effectuée au
niveau supérieur des cuves placées à 70 cm sous le dispositif d'ëclairage) main-
tenu de 4 à 20 heures. La tempërature et l'humidité relative sont groupées dans
le tableau de ?'annexe technique no III. L'inoculation a été réalisée au 45e
jour. j/
- 13 -
3.2.2 - L'inoculum
L'inoculum est issu soit d"une culture liquide de P. oryzae sur PC
(milieu à base de pomme de terre et de carotte) dgée de 15 jours, soit d'une
culture sur PCA Sgée de 8 a 12 jours ; l'incubation ayant été réalisée a 25°C
et a l'obscurité continue. Après broyage et filtration, nous avons ajusté la
concentration conidienne à 30 000 conidies/ml, valeur qui, selon FUJIMAKI
(Y.967) induirait le maximum de lésions foliaires.
Deux à trois gouttes de TWEEN 80 (jouant le role de mouillant) sont
ajoutées a la suspension conidienne ainsi préparée et disposée dans la cuve du
pulvérisateur.
3.2.3 - Technique d'inoculation
Nous avons inoculé par pulvérisation directe de la masse foliaire ;
les plantes ainsi traitées et celles témoin sont incubées 4 jours en chambre
humide,
A cette méthode classique, des auteurs préfèrent l'usage d'une cham-
bre à nébulisatisn permettant une meilleure répartition des conidies sur le ma-
tériel végétal.
Cependant, il est possible, sur de très jeunes plants (âgés de
3 semaines), d'utiliser la méthode d'inoculation par contact ; l'incubation à
25'C est maintenue pendant 48 heures.
Enfin, nous signalerons ici la méthode usitée par SAKAMOTO pour ino-
culer les gaines foliaires : le matériel végétal est découpé en fragments de
7 à 10 cm ; il est ensuite plongé dans une suspension conidienne maintenue
40 heures entre 24" et 28°C. ; les cellules de la surface interne des gaines sont
examinées au microscope ; la pénétration et le taux de croissance interne du
parasite sont utilisés convie critères d'appréciation du degré de la résistance.
3.2.4 - L'infection
Elle exige comme préalable l'établissement de certaines conditions
de température (exemple 32°C pendant 10 heures ; 28°C pendant 8 heures ; 24°C
pendant; 6 heures selon les expériences de HASHIOKA (1965)) ; d'humidité (exem-
- 14 -
ple 12 heures de rosée à 15,6"C selon BARKSDALE et JONES (1965)) et de lumière
(l'infection serait plus aisee à l'obscurité qu'a la lumière et serait suppri-
mée par la lumière diffuse).
Lorsque les conditions requises sont assurées, l'infection commence
par la germination des conidies qui émettent un tube germinatif ; elle se pour-
suit par la formation d'app&sorium ; la pénétration des cellules de la plante
h6te se fait soit par la cuticule, soit par les stomates ; c'est après cette
invasion que se développe une hyphe infectieuse issue d'une vésicule et dont le
devenir est fonction de la réaction de l'hote :
- l'hbte résistant réagit rapidement en produisant des granules brut& ou
des "RESIN-LIKE-SUBSTANCES" d'où le blocage du développement de la vésicule et
de la croissance de l'hyphe (cf planche no XB).
- chez l'hbte sensible par contre, la vésicule et l'hyphe se développent
librement étant donné la faible réaction de l'hbte (cf planche no XB).
3.3 - Symptbmes de la pyriculariose
Ils peuvent s'exprimer sur les noeuds (pyriculariose nodale), le cou
("ROTTEN NECK ou NECK ROT"), les grains, les feuilles ("LEAF BLAST").
3.3.1 - La pyriculariose foliaire ou "LEAF BLAST" (cf planche no XA)
Les taches foliaires sont typiquement elliptiques à extrémité poin-
tue ; la zone centrale est grise ou blanchâtre, la zone marginale est brune à
brun rougedtre.
Sur variété sensible et sous des conditions d'humidité élevée, les
taches foliaires se développent rapidement ; la coloration grisâtre persiste
pendant un certain temps ; une attaque précoce peut conduire non seulement à
une dessication de la gaine foliaire mais au grillage de tout l'appareil foliai-
re sans, lequel toute récolte se trouve gravement compromise.
La dimension des lésions completement développées peut étre de 1 à
1,5 cm x 0,3 à 0,5 cm.
Chez les variétés hautement résistantes, on observe seulement des
taches de la dimension d'une tête d'épingle.
- 15 -
Les variétés présentant une réaction intermédiaire montrent des lé-
sions rondes ou elliptiques dont la taille est voisine de quelques millimètres
et dont la marge est brune.
Il semble que la couleur brune corresponde soit à une réaction de
résistance varietale, soit aux conditions défavorables (exemple : lumière dif-
fuse.,.) de développement des lésions.
Cependant, la couleur, la forme des lésions, sont elles-mêmes fonc-
tion des conditions et du degré de sensibilité du riz ; on distingue générale-
ment deux types de lésions :
- celles de dimension réduite, de couleur brune appelées lësions chroni-
ques ou "chronic lesions",
-. celles grisatres,
bien développées que l'on désigne par le terme de
"ACUTE LESIONS" (lésions aigües).
Selon OSHII (1937), la lésion elle-méme se compose de trois zones
bien caractéristiques :
-e La zone empoisonnée- (ou zone plesionécrotique) : c'est la bande la plus
externe de la lésion ; caractérisée par la diffusion de substances toxiques sé-
crétées par le champignon.
-8 La zone nécrotique : bande brune, étroite, placëe le long du bord inté-
rieur de la zone empoisonnée. La zone nécrotique se caractérise par des inclu-
sions cellulaires et des parois cellulaires dégénérées et décolorées.
- La zone désintégrée, quant à elle, se définit par des inclusions cellu-
laires et des parois cellulaires complètement rompues et détruites.
3.3.2 - Pyriculariose du cou
Le cou (ou base de la panicule) peut etre attaqué et conduire à
l'apparition de sympt&nes de "Rotten neck" ou "neck rot", c'est--à-dire une pour-
riture au niveau du point de jonction qui se traduit par la chute de la pani-
cule.
Tout se passe comne si l'installation du parasite au niveau du cou
altërait les tissus et vaisseaux conducteurs à l'endroit du site d'infection et
partant empêchait les métabolites (élaborés par la plante ou puisés dans la rhi-
- 16 -
zosphère par son système radiculaire) de parvenir dans l'épi dont la formation
est dès lors qualitativement compromise ; pareilles à dés épis de riz héber-
geant un Borer ou à des epis d'orge altérés par une attaque tardive d’OphioboZus
!3ra;nz:nZs,
les panicules du riz se composent de grains soit complètement vidés
de leur contenu, soit sous-développés et donc dotés d'une fertilité amoindrie
voire nulle.
Le "ROTTEN NECK" revet à nos yeux l'une des formes d'expression les
plus catastrophiques de la pyriculariose.
Notons que ce type d'attaque peut aussi se manifester sur les autres
noeuds de la tige.
3.3.3 - Notations en serre après inoculation artificielle
.-_
- La variété 63-83 : fournie .>.?Y 1'I.R.A.T. est définie comme étant dotée
d'une "très bonne résistance" : ce r;ultivar examiné et noté (par rapport au té-
moin) présente sur les feuilles subterminales, des taches brun-rougeâtre très
fines ; certaines de ces lésions sont nettement brunes.
- La variété SEFA 302 G : semble moins attaquée dans son ensemble ; toute-
fois, eu égard à la teinte vert foncé, à la consistance des feuilles et à une
lumiinosité déficiente à l'époque de ces observations, les symptbmes étaient plus
difficiles à apprécier.
- La variété TKP : les symptômes observés sont nets ; cependant nous signa-
lerons qu'au cours d'une prospection effectuée à 1’I.R.A.T. en septembre 1973,
nous avions observé que ce cultivar, utilisé dans les essais I.R.R.I.
(International Rice Research Institute) comme variété contaminatrice, s'était
révéslé plus résistant que des cultivars réputés résistants ; resterait donc à
éclaircir ce problème.
3 .4 - Dissémination
La production de conidies intervient 6 jours après l'inoculation et
par une humidite relative supérieure ou égale à 93 % (HEMMI et IMURA, 1939) ;
le taux d'émission serait de 2 000 à 6 000 conidies par jour et ce, pendant les
14 premiers jours dans les conditions expérimentales au laboratoire (cf I.R.R.I.,
données non publiées).
- 17 -
Des expériences très récentes (KATO et al., 1970) riivèlent un pic
au bout de 3 à 8 jours après apparition des lésions foliaires et au bout de
10 à 20 jours pour les lésions se manifestant sur les rachis.
La dissémination du champignon serait réalisée par l'eau d'irriga-
Lion (SUZUKI, 1969), le vent (les conidies transportées par le vent sont parfois
---.
- -
recueillies jusqu'à une hauteur de 24 m), les semences infectées-' le chaume in-
fecté.
- - -
Le nombre de spores déposées par feuille est fonction du point d'in-
sertion de la feuille et de son inclinaison par rapport à la tige ; ainsi le
nombre des spores déposées par feuille est plus élevé pour les variétés de riz
à feuilles voisines de l'horizontale que pour celles à feuilles formant un angle
aigu avec la tige.
3 .5 - Longévité
-
-
Dans les régions tempérées, le champignon passe l'hiver sous forme
de mycélium ou de conidies ; lorsque les conditions sont sèches, la survie des
conidies peut &tre de un an et celle du mycélium de trois ans.
Pour passer l'hiver, le champignon peut soit demeurer dans l'embryon
de riz, dans l'endosperme, dans les glumes (SUZUKI, 1930), soit hiverner sur
d'autres céréales jouant le rôle d'hôtes de transition.
- 18 -
C H A P I T R E D E U X I E M E
C A R A C T E R E S DESCRIPTIFS DE
PyrieuZaria oryzae Cavara.
De nombreux auteurs se sont attachés à caractériser et à définir
le genre Pytiwlariiz : SACCARDO (1880) ; CAVARA (1891) fut le premier à décrire
une espèce de PyricuZaria oryzae se manifestant sur le riz en Italie ; les re-
cherches de BRIOS1 et de CAVARA aboutirent en 1892 à l'apparition d'une descrip-
tion identique [dans la littérature courante, l'espèce P. ohyzae est souvent
attribuée à BRIOS1 et CAVARA ; en réalité, seul CAVARA doit être cité comme au-
teur puisqu'il fut le premier à caractériser l'éspèce P, oryzae ; d'où la déno-
mination PyricznZaria oryaae Cavara.] ; HORI (1898) ; KAWAKAMI (1901-1902) ;
SHI:RAI (1905) ; ASSUYAMA (1965), etc....
Conformément à ces travaux, le parasite du riz sera nommé
PyrYim4laria oryzae cav. ; les recherches de BRIOSI et CAVARA (1893), KAWAKAMI
(1901-1902)) NISIKADO (1917, 1927) etc.. . conduisirent à réserver le binome
PykmZaria grCsea (CKE) sacc. au parasite rencontré sur d'autres graminées ou
céréales (Eleusine, Paspuhn, Panicum, Setaria).
1 -G CARACTERES MORPHOLOGIQUES ET CYTOLOGIQUES DE L'AGENT PATHOGENE:
1.1 - Le conidiophore (cf planche no X)
-
P. oryzae est doté de conidiophores naissant groupés à partir d'un
stroma ; la partie basale du conidiophore est renflée, fuligineuse et la région
- 19 -
djp,i ca 7 c s'amincit progressivement.
La Premiere conidie est émise par l'apex du conidiophore, les sui-
vantes etant formées sur les ex,trémités de nouvelles ramifications émergeant
juste au-dessous du point d'émission de la première conidie (radulglspore) ;
plusieurs conidies (de 2 à 20) peuvent naitre d'un méme conidiophore.
1.2 - Les conidies
Les conidies possèdent généralement une base arrondie et un apex ré-
,trelci ; elles sont biseptées, rarement triseptées ou monoseptées ; elles présen-
tent parfois un rétrecissement au niveau des septa ; les conidies sont le plus
souvent hyalines a olive pdle ; leur taille est voisine de 19 a 23 microns x
:7 à 9 microns ;
..------Y
elles portent généralement un petit appendice basa1 mesurant
â 6 à 2,4 microns ;
..-?--
la germination de la conidie se fait le plus souvent au ni-
-
veau de la cellule apicafe ou de la cellule basale, parfois d'une cellule médiane.
Mais les conidies de P. oryzae se caractérisent aussi par une cer-
taine variabilité dans leur forme et dans leur taille ; la dimension des coni-
dies serait fonction de nombreux paramètres, entre autresle type de lésion,
l'h&te, l'humidité relative, la température :
- Ainsi, les conidies des lésions de type "acute lesion" seraient plus pe-
tites et un peu plus rondes que celles issues des "chronic lesions" (ON0 et
NAKAZOTO, 19583.
- De meme le champignon de riz, inoculé sur différents hbtes donne lieu
a l'apparition de conidies différentes d'un hôte à l'autre (cf tableau A) ;
Tableau A : taille des conidies de P. oryzae après infection de divers hotes.
------'---
BARITA, IWATA et YAMANUKI, 1965 ; ASUYAMA, 19651, Extrait de
S.H. OU :"RIDE DISEASES"
----------.----
-
Hbte inocule
Hote inoculé
--l-_-_-"-.l-..---._l-.---_._
E'estuca arwdinu(~ea
k’. elatior
arundinacea
s'. ruhra ( 1)
P. canariensis
(2)
Phcm pratense
fi0 Ze~ns Zana tus
Secbale cerea Ze
Hmiem vu Zgarér ( 1)
(2)
26,4 x 9,7
- .II -.-. ^...--._. .^-----..--s+-
-
-
-
- 20 -
par contre lorsque ces dernières conid"<s, toutes différentes les unes des au-
tres sont inoculées sur le rit, toutes les nouvelles conidies, produites sur
riz sont de même taille (NARITA, IWATA et YAMANUKI, 1956).
- Par ailleurs, des conidies produites sous une humidité élevée suffisante
seraient plus longues que celles produites sous une faible humidité et a fortiori
dans un milieu sec (NISIKADD, 1926 ; SUEDA, 1928).
- La température semble aussi Jouer un rble significatif : les conidies pro-
duites a température élevée (30°C et 27OC respectivement) seraient plus longues
que celles fomées aux basses températures (18 à 20°C et 21 à 22OC) ; par contre
la variation de la largeur sous l'action du facteur thermique ne semble pas si-
gnificative (YAMANAKA et KDBAYASHY, 1962).
- Enfin, les conidies produites dans les milieux de culture présentent une
certaine variabilité, fonction du type de milieu, et elles sont généralement
plus longues que celles produites sur plante h6t.e (NISIKADO, 1926 ; KULKARNI et
PATEL, 1956 ; ON0 et NAKAZATO, 1958) (cf tableau B).
Tableau B : tailles moyennes des conidies de P. oryzae produites sur lesions
- - - - -
de l'hote et sur décoction gélosée de plantes [SAWADA, 1917 ;
ASUYAMA, 19651. Extrait de S.H. OU "RICE DISEASES"
--1----
r
r ---_--
-
Sur milieu gélosé issu d'une décoction de
Sur lésions
--,_~
--1.
de 1'hCrte
----
_l_-.--l_l~
261,O x 8,8
m--m
- - -
-
-
Quant à la germination des conidies, elle est suivie de la forma-
tion d'appressopia émis aux extrémités des tubes germinatifs ; l'appressorium
(que d'aucuns baptiserent
"RECREATING SPORE" ou "RESTING SPORE"ou même "CHLA-
MYDOSPORE") semble jouer un rble très important dans la première phase d'agres-
sion de l'hbte,
If semblerait même (SUZUKI, 1951, 1953) qu'il y ait une relation
entre pathogènie et grosseur de l'appressorium.
- 21 -
1.3 - Caracteres cytologiques (cf planche no XR)
L'observation de conidies au microscope électronique a conduit 8
divers résultats : la membrane cellulaire serait composée de 3 couches selon
certains auteurs (MIZUSAWA, 1959), 2 couches seulement selon d'autres (HORINO
et AKAI, 1965) et enfin 4 couches selon WU et TSAO (1967) ; ces deux derniers
chercheurs mirent en évidence l'existence de noyaux, de nucléoles, de pores
au niveau du septum, ainsi, que la présence de 2 types de particules denses dont
l'une serait le lysome.
Le nombre de noyaux par cellule mycélienne ou conidienne est encore
incertain eu égard aux résultats certes nombreux mais souvent controversés :
les cellules seraient plurinucléées selon SUZUKI (1965, 1967), uninucléées se-
lon HORINO et AKAI (1965), WU et TSAO (1967). YAMASAKI et NIIZEKI (1965)
pensent au contraire que, de façon générale, les cellules seraient uninucléées
mais qu'il existerait un faible pourcentage de cellules contenant 2 a 6 noyaux
pmour certaines souches seulement du champignon.
HASHIOKA et INAGAKI (1968) établirent que les 7 espèces de
PyricuZarYia étaient uninucléées mais qu'fl y avait possibilité d'anastomose en-
tre P. orpae et P. zizaniae ; ce qui conduirait a la formation d'un noyau mix-
te générateur de différents types de conidies.
Enfin, récemment encore, GIATGONG et FREDERIKSEN (1967, 1968, 1969),
établirent que de façon générale, les cellules conidiennes ou mycéliennes étaient
uninucléées mais qu'un nombre réduit de cellules, reconnaissables par leur forme
(forme en tonneau), avaient 4 noyaux ou plus.
Cette étude cytologique révèle, entre autres, toute la difficulté
de caractérisation de l'agent pathogene ; si nous ajoutons par ailleurs que des
études tres récentes révèlent une très grande variabilité dans la pathogénie du
parasite, nous conviendrons alors une fois de plus de la nécessité de mieux
appréhender les caractéristiques biologiques du pathogt?ne, autrement dit des re-
lations entre ces caractéristiques et la variabilité de la pathogénie ; pourquoi
la quantité de mycéliun parasite varte-t-elle d'une masse cotonneuse épaisse a
un ,tres mince film ? Pourquoi observe-t-on de si fortes variations de la couleur
du mycélium ? Quelle relation existe-t-il entre ces variations et la pathogenie ?
Autant de problèmes a definir et 11 résoudre pour une meilleure approche des rela-
tions h6te-parasite et partant pour l'édification d'une méthode efficace de lutte.
- 22 -
II - CARACTERES CULTURAUX EN FONCTION DU MILIEU
Seuls seront examinés dans ce paragraphe les caractéres descriptifs
afférents a la morphologie des cultures et a celle du mycélium ; les conidies,
quant à elles, seront examinées dans la partie traitant de la conidiogénèse.
Les milieux utilisés : PCA, PDA, MISAT0 6.5, ORGEOSE dont les com-
posantes sont definies dans l'annexe technique no 1 ont été incubés après ino-
culation ; les notations ont été journalières jusqu'au L15e jour-d'incubation-
% 2 5 °.C
2.1 - Morphologie de la culture
-- La forme de.la colonie est régulière par rapport au site d'inoculation
quel que soit le milieu solide util4sé ; cependant, alors que l'épaisseur du
mycélium est tr&s fine sur PCA, nous observons sur PDA, ORGEOSE, une masse my-
célienne relativement plus abondante quoique moins importante que sur MISAT0 6.5.
-. La couleur :
-
la teinte "brun cendre" est tres nette quel que soit le mi-
lieu ; cependant, alors qu'elle est homogène et régulière sur toute l'étendue de
la C!olonie observée sur PCA, ORGEOSE ou MISAT0 6.5, nous notons au lQ,e jour
sur :PDA une gamme de nuances ainsi réparties' de l'intérieur vers l'extérieur :
. autour du site d'inoculation (c'est la zone la plus dgée), un an-
neau d'environ 3 mm d'épaisseur, d'aspect poudreux très fin et de teinte gris-
rosâtre,
. une zone de 8 mn d'épaisseur, de teinte beige à gris clair, légë-
rement plus épaisse que la précédente,
. une bande annulaire d'environ 8 mn d'épaisseur caractérisée par
un mycélium floconneux lache (telles les particules peu denses d'un velours),
. une zone d'environ 10 mm dont la masse mycélienne relativement
plus épaisse que toutes les précédentes est nettement plus claire,de teinte
"huileuse",
" enfin, une marge externe claire.
- 23 -
2.2 - Le myctElium
La croissance mycélienne semble bloquée au contact des parois des
boTtes de Petri ; ce qui suggère la présence d'un mycélium du type rampant.
Au microscope, le mycélium très f in, hyalin, de diamHre moyen avo i-
sinant 3,14 a 4,18 microns ne présente aucune différence significative liée au
substrat nutritif.
La longueur moyenne des cellules mycéliennes est de 26,78 microns
(moyenne de 50 valeurs pbservées sur PCA).?.
2.3 - Le revers de cultures
Nous nous bornerons a signaler la tres forte pignentation observée
sur PDA.
XII - CARACTERES CULTURAUX EN FONCTION DE LA TEMPERATURE
Les cultures décrites ici sont issues d'un inoculum isolé de la
variété 302 G ; le substrat nutritif choisi est le PCA, l'observation s'est
faite à 25*C pendant 9 jours.
Nous avons réalisé cet essai aux températures de 10,5",
- - w,x,
20", 25", 30" ; chacune de ces valeurs étant entachée d'une marge d'erreur de
-- e -
f 0,5*c.
-
-
- La masse mycélienne formée à 30' et 25*C est d'une teinte brune réguliè-
r e ; cette coloration, nous le verrons ultérieurement, traduit une bonne sporu-
lation de façon générale ; les cultures placées à ces deux températures sont
aussi caractérisées par un revers très pigmenté.
- A 20*, se développe une masse mycélienne d'aspect poudreux très homogène.
- Pour les températures de 17", 15*, 10,5*', le mycélium, parfois flocon-
neux, devient blanchdtre et on constate l'absence de pigmentation du revers des
cultures.
- 24 -
IV - CARACTERES CULTURAUX EN FONCTION DU pH (Tampon Mc Ilvaine, ann. tech. no 7)
Les caractères ci-dessous ont eté établis sur la base de culture
en milieu liquide a base de carotte-pomme de terre ; dès les premières perio-
des d'incubation a 25"C, nous observions dans les erlenmeyers des masses mycé-
liennes cotonneuses a duveteuses, blanchatres, isolees les unes des autres, de
dimension variable en fonction du pH ; trk tbt cependant, des différences se
révèlent et se concretisent avec l'age.
- Pour les pH bas de 2,95 et 2,35, la teinte initiale persiste hormis une
tégere augmentation dans la taille ou la confirmation de l'aspect blanc laiteux.
- Pour les pH 3,95 et 4,60, les flocons deviennent plus solidaires et a la
periphérie se développent dès les 5e et 6e jours, un anneau continu brun verdS-
tre au contact de la paroi de l'erlenmeyer.
- A pH 5,3D, s'est développee, des les 5e et 6e jours, une assise mycélien-
ne porteuse par endroit de "touffes" brun clair.
- Au cours des essais réalises, le pH 5,95 est celui qui a révélé la plus
grande homogenéité tant du point de vue régularité dans l'épaisseur du mycélium
que rëpartition de la teinte brune.
_ Aux pH 6,45, 7,00, 7,55 se développent, par endroit, des touffes duve-
-
-
-
teuses.
- 25 -
CHAPITRE TROISIEME
BIOLOGIE ET PHYSIOLOGIE DE
PyricuZatia oryzae
I- PARAMETRES DE LA CROISSANCE DE P. oruzae
1.1 - PrGliminaire
L'établissement d'une méthode de lutte contre le P. oryzae impose
a priori une définition m&ne partielle des relations hbte-parasite, ce qui sup-
pose entre autres la connaissance de la biologie et de la physiologie du para-
site au travers de ses exigences nutritives, thermiques, lumineuses, etc... ;
l'importance de cet aspect du problème n'est plus a démontrer et, s'il en était
besoin, nous pourrions très bien la matérialiser à la lumiere des expériences
de TANAKA et KATSUKI (1956) qui ré@lèrent que de nombreux composés du cycle de
KREES présents dans les feuilles de riz jouaient un r8le stimulant dans la crois-
sance du parasite impliqué ; cette "réceptivité", sur le plan trophique tout au
moins, liée a la présence d'acides succinique, malique, citrique, joue donc un
rble important dans la nature des relations établies entre le parasite et l'hbte
cons'idéré.
Dans l'étude qui va suivre, nous nous efforcerons de cerner l'action
du milieu, de la température et celle du pH sur la croissance de P. oryzae.
Il convient cependant de signaler l'existence de certaines souches
utilisatrices de sorbose, de sorbitol, de mannitol, d'inuline,
ce qui révele
une variation dans l'utilisation des métabolites ; resterait donc a établir la
corrélation -si corrélation il y a- entre cette variation de type trophique et
la variabilité du pathogène.
- 26 -
TANAKA et KATSUKI (1956) postulèrent par la suite que les amino-
acides libres tels par exemple le glutamate, l'aspartate ainsi que des traces
de Mn, de Zn, de Mo pouvaient jouer un rble de cofacteurs de croissance.
1.2 - Paramètres trophiques
De façon générale, la croissance de P. oryzue est relativement ai-
sée sur milieux naturels, autrement dit de milieux composes soit de tissus de
plante, soit de décoction de plante ; de méme l'addition dans un milieu de cul-
ture d'extraits de chaume de riz dans l'eau chaude stimule considérablement la
croïssance et la sporulation de P. oryz~e, ce qui ttsmoigne en faveur de l'exis-
tence d'une substance initiatrice de croissance ou "GROWTH-PROMOTING-SUBSTANCE"
dans l'extrait de chaume de riz.
Par contre la croissance de P. oryzae s'avère difficile sur milieu
synthétique.
De nombreuses expériences ont été réalisées dans le but de mieux
cerner la nutrition carbonee ; il semble bien établi de nos Jours, que les meil-
leures sources de carbone soient le sucrose, le glucose, le maltose, le fructose,
le lactose, le xylose et que de façon générale les acides organiques ne soient
pas des sources convenables (OTSUKA et al., 1965).
Quant à la nutrition azotée, l'état actuel de nos connaissances met
en évidence l'intervention convenable de l'histidine L ; de l'acide L-glutami-
nique, L-proline, L-serine ; de la L-glycine, L-arginine, L-asparagine, L-alanine.
Pour quantifier la croissance mycélienne, nous nous limiterons a
deux méthodes :
.- La méthode radiale : fondée sur la mesure du diamètre moyen des colonies ;
dans tous les cas, la valeur moyenne indiquée représente la moyenne établie à
partir de 5 boTtes de Petri ; pour chaque boite, la valeur affectée est une
moyenne entre 2 mesures effectuées le long de 2 diamètres perpendiculaires.
L'unité de mesure sera le millimètre (mn).
- La méthode pondérale : dont le principe est de suivre l'évolution pondé-
rale (en mg} de la masse mycélienne préalablement filtrée (papier filtre DURIEUX
no 111) et séchée à l'étuve à 105°C.
- 27 -
Dans tous les cas, la valeur mo,yenne mentionn(5e a eté établie à
partir de 3 mesures correspondant à 3 erlenmeyers.
1.2.1 - Nature des milieux utilisés
cf annexe no 1.
1.2.2 - Définition de l'inoculum
Il est, de façon g&&-ale, issu d'une culture présentant une bonne
croissance dont l'age est de 5 à 12 jours.
1.2.3 - Résultats
1.2.3.1 - Croissance en milieu solide
----------------_----------
Experience no 1
- -
Tableau 1 - PyricuZaria oryzae : croissance radiale (exprimée en mn) en fonc-
-
-
tion du milieu de culture ; température d'incubation = 28'C/obs-
curité continue.
- 28 -
Expérience no 2
PCA
6
33,6
3 6
31,l
30,4
I 8
I
45,2
42,0
I
I 12
I
7 7
l 14
1 84
87,2
I
l
68,4
Tableau 2 - P. oryzae : croissance radiale en fonction du milieu ; incubation
à 28°C/obscurité continue.
1.2.3.2 - Croissance en miilieu liquide
---------------_-------
--me
--
Age des
\\
cultures
7
16
211
28
4 1
(jours)
Nature
des
\\
milieux
--
I
Tableau 3 - P. oryzae : croissance ponderale (exprimée en mg en fonction du
-
-
milieu de culture ; temperature d'incubation = 2B oC/obscurite
continue.
Remar ue : Quant aux milieux a base de pomme de terre-glucose, Paddy, orge, ils
rp tent
+- tr& mal a ce genre de manipulation ; nous avons dQ les éliminer au
- 29 -
2le jour eu égard a la quantité de mi1ie.u qui, au cours de la filtration ve-
nait fausser l'apprkiation ponderale de la croissance mycélienne ; en effet
l'emploi de papier filtre rapide ne permet pas une séparation correcte mycélium/
milieu ; par contre la filtration est extremement lente voire impossible lorsque
l e papier filtre utilisé est du type lent.
1.2.4 - Expression des résultats : discussion
Les résultats obtenus sur les tableaux 1 et 2 sont respectivement
exprimes par les figures 1 et 2 ; on peut conclure au regard de ces repr&en-
tations graphiques que ORGE/AGAR, PADDY/AGAR, PCA, PDA, MISAT0 6.5 confèrent au
parasite une bonne croissance , relativement equivalente pour tous ces milieux.
Par contre, le milieu a base d'orgéose manifeste une inferiorité
sur le plan stimulation de la croissance.
L'ORGEOSE, le PDA (qui induit une stérilité très prkoce), le
PADDY/A, l'ORGE/A ne présentent pas de supériorité particulière par rapport aux
deux autres milieux et, du fait qu'en outre, leur usage s'avère très difficile
pour les cultures en milieu liquide, nous avons choisi de poursuivre notre étu-
de alvec seulement le PCA et le MISAT0 6.5.
Pour cette raison, l'appréciation de la croissance pondérale expri-
mée par la figure 2 ne fait intervenir que les 2 milieux retenus '; sur cette
figure, nous détectons un maximum de croissance situe entre 2 ou.3' semaines ;
le MISAT0 6.5 manifeste une tres nette supériorité sur le PC (pomme de terre-
caroltte).
Le fait que le maximum de croissance observé sur PC soit atteint
environ 5 jours avant celui sur MISAT0 6.5 ne devrait pas étre étranger a la
précocité de la décroissance pondérale présentée par PC ; autrement dit, il
nous semble que plus la croissance est active au départ, plus précoce sera le
phénomène de lyse mycélienne expliquant la décroissance pondérale.
Remam : à notre avis, l'évaluation de la croissance pondéra le devra t etre
G précise que celle de la croissance radiale ; à y regarder de plus près,
l'appréciation de la croissance radiale donne un aperçu sur la vitesse d'éta-
lement de .la colonie, aucune information n'ëtant fournie quant au déve oppement
aérien du mycélium.
Fig. 1 - P . orgzae : croissance radiale (mm) en fonction du milieu et
du délai d'incubation ; 28"C/obscurité. A = orge/agar ;
B = paddy/agar ; C = PDA ; D = PCA ; C = Misato 6.5
Fig. 1 bis - Il, orzzzae : croissance radiale (mm en fonction du
milieu et du délai d'incubation ; 1 8'C/obscurité.
A = PDA ; B = PCA ; C = Misato 6.5 ; D = Orgéose.
60
/
---c-W, ‘Z-U”““““““““”
6
I
b
16
21
218 '
3'6
411 J
Fig. 2 - P . oryzac3 : croissance pondérale (mg) en fonction du
milieu et du délai d'incubation ; 28"C/obscurité ;
A = Misato 6.5 ; B = PC.
i q
a I d “- .nct~ion Iv: ia température
-.- ....^.l.-.l - .-. ^<-_-_ ,--_
y‘ , 1;
‘:.t..L!“‘x,
‘SI,, t, Id crobssance mycelienne de I:. orys.32 a 7 ieu entre
8-9" et 37°C ; 1'6rP imtE se situanT à 28OC. les températures expe4mEntales
choIsies ~ppa~t~~~~~~~~t 4 la fourchelte ainsi definie : 10,5"C, 15'C, ;T:'C,
-.
":‘ 13i'
c:. 'li!
. -, -.. ?5"C, 2?"C acat 3J"c. *
.rl-l -- .."-.--' -... _~_,_'
35OC et 37OC sont en effet les températures qut
.--.
I"I_
nous avons retenues.
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---
2 5
35
3?
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-
-
890
18,8
26 ,o
28,0
29,0-
23,5
-
- --t-
-t-
18,5
0,O
27,5
38 $4
41,O
42,4
34:,7
41 ,o
56,8
50,4
Tableau 4~ -2 P. oryzae
I_I--
: croissance radiale (mn) en fonction de la temperature/
PCA/obscurité continue.
1.3,2 - Expression graphique : interptitation
Si aux températures experimentales extrémes (10,5", 15" et 35') la
croissance demeure possible, elle reste faible voire nulle (cf fig. 3 pour la
duree d."incubation de 36 heures).
Pour les 3 premiers délais d'incubation, le parasite manifeste une
meilleure croissance a 30°C (qui est la température optimale observée) qu'à
27'6 ; cependant, au bout de 9 jours, l'a vitesse de croissance à 27°C augmente
au point de surpasser la croissance observée à 30°C ; il n'est pas impossible
que ce phénomène puisse s'expliquer par le fait que la valeur de 27" est rela-
tivement proche de l'optimum théorique Iqui est de 28OC.
!
A
3
20
.y-+----
l
? 0
\\ \\
A
/
/
t
,/
Fig. 13 a'. Ij. oryzae : croissance radiale (mm11 en fonction de la tempé-
rature ; PCA/obscurité ; A = âge de 36 h ; B = 4 j ; C = 6 j ;
D = 9 j.
- 35 -
A 37'C, la croissance observée est nulle au bout des 9 jours d'in-
cubation ; nous avons alors transporté le matériel conservé de 37% 25" pour
situer le seuil de létalité ; les valeurs observées après cette transplantation
sont représentées dans le tableau 4B/25"C/obscurité continue.
Diamëtre
moyen colonies
090
090
15,0
>> 90,o
-(fM
Tableau 4Bis - P. myzae : culture préalablement incubée 9 jours à 37"/obscu-
-
-
-
rité et transplantée à 25°/obscurité.
1.4 - Action de 1 'héméropériode
1.4.1 -. Résultats
Tableau 4' - P . oryzae: croissance radiale en fonction de l'héméropériode et du
délai d'incubation/PCA/25'.
1) = lumiëre,continue
t 2) = obscurité continue
(3) = 8 heures lumière + 16 heures obscurité
I.l~“UUI-lll-----.-“-,---l
----_.--
-
--.-----l---<CI-lllm
Fig. 3' - P. 9ryzae : croissance radiale (mm) en
fonction de l'hémëropériode et du dëlai
d'incubation ; 25'C/PCA.
A = 8 heures LUM + 16 heures OBS
B = Lumière
C = Obscurité
- 37 -
1.4.2 - Expression graphique :: discussion
-
Quoique la croissance mycélienne fût très satisfaisante quelle que
soit 1 'héméropériode, l'alternance LUMIERE:-OBSCURITE semble plus bénéfique que
la lumière ou 1"obscurité continue ; il aurait probablement été intéressant de
pouvoir affiner les durées respectives dans l'association lumiére-obscurité
afin de détecter la combinaison optimale pour la croissance mycélienne.
Par ailleurs, l'obscurité continue serait préférable à la lumière
continue.
Dans la suite de nos expériences, nous travaillerons -sauf indica-
tion contraire- à l'obscurité,d'abord
parce qu'elle correspond à la courbe
moyenne (cf fig. 3'), ensuite en raison de contraintes matérielles.
1.5 - Action du pH1 sur la croissance de P. oryzae
-
62,73
55,06
58,60
48,66
53,06
46,00
41,oo
34,66
28,26
29,30
31,53
30,56
30,50
30,85
30,73
25,30
21,06
24,50
25,85
26,00
21,55
31,20
/
60,70
41
(
42,53
1
37,95
31,lO
37,80
27,45
30,05
30,80
Tableau 5 - P. oryzae :
-
croissance pondérale (exprimée en mg) en fonction du pH/PC/
25'C/obscurité continue.
- 38 -
2,35
2,95 3,95
4,60
-
-
2,75
3,75 6,90
5,,95
7,20
7,50
7,60
7,50
7,85
- - -
2,85
5,85 7,85
8,lO
l 26
1 2,70 1 8,051 8,05
8,15
-
-
37
) 2,65 1 8,251 8,25
8.,20
/I 41
) 2,70 1 8,201 8,20
8!,20
8,20 1 8,20 j 8,20 1 8,20 1 8,30
-
-
Tableau 6 - P. oryzae : évolution du pH au cours du vieillissement des cultures/
-
PC/25°/obscurité continue.
3,95
4,60
5,3C
- -
2
11,50 13
13,7
- -
4
21,50 23
23,51
- - -
9
51,0
52,75
54,51
Tableau 7 - F. oryzae : croissance radiale (mm) en fonction du pH/PCA/25'/
-
obscurité continue.
1.5.2 - Expression graphique des résultats : discussion
1.5.2.1 - Préliminaire
------------
La croissance en milieu liquide implique une interaction entre l'i-
noculum et le substrat nutritif :
- Le substrat, par ses composantes (glucides, lipides, protides et ici pH)
induit une certaine croissance du parasite ; à telle enseigne qu'à la limite il
peut en modifier quelque peu la physiologie.
- Le parasite consomme certains métabolites issus du milieu, y rejette des
composés résultant de son métabolisme et partant modifie qualitativement le mi-
lieu sur lequel il pousse.
En l'occurence, cette interaction, très remarquable pour ce qui est
du pH en milieu liquide {ce qui serait moins important pour les milieux gélosés
en raison des echanges très limités), suggère qu'au fil du temps, le parasite
n'est jamais confronté au même milieu de base ; connaissant les relations parfois
étroites entre la nature du milieu et certaines caractéristiques du parasite,
l'on saisit alors la nécessité.de tenir compte de l'évolution du pH du milieu.
En d'autres termes, l'appréciation de la croissance pondérale en
fonction du pH devra, sous peine d'erreur, tenir compte du role joué par le pa-
rasite dans l'évolution du pH au cours du vieillissement des cultures. Cette
'régularisation"
du pH dans le temps vers une valeur optimum est un fait cons-
tant observé dans la plupart des cultures.
Pour ce faire, les représentations graphiques de la croissance pon-
dérale et de l'évolution du pH devront être a,;Ca;:ysées de façon concomitante ou
du aoins, la figure 4 sera analysée en ayant tnzjours présente a l'esprit la
figure 5.
1.5.2.2 - An$]xse des courbes traduisant la croissance gond&
----------_--_-------------------------- .w---
rale en fonction du EH
--.--s.---w--I-v------ -
La figure 4 comporte 5 courbes qui n'ont pas toutes la même impor-
tance ; les courbes A et B étant surtout les plus représentat;Jes de la crois-
sance (encore que des évaluations plus précoces auraient certainement été plus
significatives)
; les autres traduisent plutdt une croissance interférant avec
le vieillissement des cultures.
En nous fiant plus-à' la courbe obtenue après 7 jw-~ (A), nous es-
timons que la bande des pH optimums comporterait toutes les valeurs situees
entre 3,95 et 5,95. Il est vrai qu'à cette date déja, les pH limites correspon-
P
-
dant à ces deux valeurs sont de 6,90 et 7,20 ; autrement dit, meme à cet dge re-
6C
,
\\ I
,
7,
,/ \\
50
b(
\\0
4c
B i !I1.II\\
30
C 31
20
6 1 ’
,l1
F-ig. 4 - P. 0zy.m.e : croissance pondérale (mg) en fonction du
pH/PC/E"C/obscurité ; A = âge de 7 j ; B = 18 j ;
C =26j;D=37j;E=41j.
A
I
‘\\1,
*
-t*/
1 8
2 6
3 7
41J
Fig. 5 -- 1'. oryzae : croissance pondérale (mg) au cours du vieillissement
des cultures ; PC/25"C/obscurité.
PH0 : A = 2,35 ; 0 = 2,95 ; C = 3,95 ; D = 4,60 ; E = 5,30 ;
F = 5,95 ; G = 6,45 ; H = 7,0
; 1 = 7,50
PH
I
/
Fig. 6 a- P. oryzae : Régularisation du pH au cours du vieillissement des
cultures ; PC/Z"C/obscurité ; pH0 : cf fig. no 5.
(W
c
II/
4
:
I/I
//
/f
/I/
:
2
/
,/’
/
/
/
,
I
/
<
0,
3995
!5,30
a;45
*
7,50
pH
Fig. 7 - F’. oryzae : Croissanlce radiale (mm) en fonction
du pH ; PCA/25"C/obscuritë ; A = tige de 2 jours ;
B=4j;C=9j.
- 44 -
lativement jeune, les poids observés tiennent bien entendu aux pH de base
(3,95 ; 4,6 et 5,30) mais aussi aux effets certainement bénëfiques induits par
--
-
-
les pH intermédiaires (aux 3e, 4e, 5e et 6e jours par exemple) ; par là nous
voulions dire que l'accroissement pondéra1 observé n'était pas dû au SEUL effet
du pH de base ; l'idéal serait d'avoir un tampon suffisamment STABLE pour TOU-
JOURS NEUTRALISER les variations éventuelles induites par le parasite.
Cette contrainte n'étant pas rëalisée, il faudrait alors effectuer
des mesures au moment ou 1es"modifications du milieu sont les moins percepti-
bles, c'est-à-dire au 3e jour, peut être m&ne après 48 ou 24 heures ; mais
alors les valeurs observées sont tellement faibles que la marge d'erreur risque-
rait de conduire à des conclusions aberrantes.
La courbe (B) correspondant à une durée d'incubation de 18 jours
tralduit naturellement de manière plus prononcée les fluctuations du milieu ;
néanmoins, son allure genérale est conforme à la courbe précédente.
Nous observons qu'au 18e jour, l'accroissement pondéra1 au point
pH :z 2,95 est presque le double (57,7 mg) de celui observé à la méme abscisse
au '7e jour (24,l mg) ; cela signifie que le! pH 2,95 est hors de la bande opti-
male des pH puisqu'il faut au champignon un certain délai pour, qu'au terme
d'une activité m&e faible, le pH de base soit REHAUSSE à une valeur compati-
ble avec un meilleur épanouissement de son métabolisme.
Quant aux autres courbes traduisant la croissance en milieux liqui-
des (C, D, E), elles ne sauraient à notre avis, représen,ter VALABLEMENT la dynami-
que du phénomène étudié.
En effet, au-delà d'un certain dge, en l'occurence à l'dge 26, 37
et 41 jours il y aurait tellement de modifications (notamment du pH) que nous
ne sommes plus assurés que toutes les manifestations observées dépendent seule-
ment du pH.
Il faut 41 jours au parasite pour fabriquer 60,70 mg à partir du
pH de base 2,35 alors qu'en 7 jours, il synthétise 60,13 et 62,73 mg pour les
pH de base 3,95 et 4,60 respectivement, ce qui signifie en clair que le pH de
-
-
2,35 ne répond pas aux exigences du germe étudié.
- -
L
su....-UI
--I”“I-
--
..-
I-m
- 45 -
1.5.2.3 - Analyse des courbes traduisant le phénomène d'autolxse
-w-m --_11-_-1,--_-_-----_------"--
"mlmm-"-l..---"wl --
La figure 5, établie à partir du tableau 5 traduit le phénomène
d'autolyse ; ce phénomene serait d'autant plus précoce que le pH de base est
voisin de la valeur optimale. Par exemple : à pH = 2,95 le phénomène de lyse my-
célienne ne se manifeste qu'à partir du lt3e jour (environ) ; par contre, ce phé-
nomene est déclenché dës le 7e jour par les pH favorables de 3,95, 4,60, 5,30.
De même, l'autolyse mycélienne ne se manifeste qu'au delà du
41e jour pour pH 2,35.
Ces courbes traduisent parfaitement la dynamique des cultures du
parasite en fonction des délais d'incubation ; elles extériorisent 3 phases
continues et successives :
-. Première phase : la croissance mycelienne est supérieure à l'autolyse
mycélienne ; la croissance mycélienne du parasite est alors très active au tout
début de l'expérience :; le phénomène d'autolyse appara?t progressivement et
tend à neutraliser l'accroissement pondéra1 dont la vitesse s'amenuise ; cette
première phase correspond aux branches ascendantes des courbes.
-e Deuxieme phase :: la croissance myclilienne égale l'autolyse mycélienne ;
à mesure qu'augmente la durée d'incubation, le phénomène d'autolyse s'intensi-
file et parvient à équilibrer exactement lUaccroissement pondéra1 ; la conjugai-
son de ces deux phénomenes se traduit par un maximum qui, très certainement,
aurait correspondu à un plateau si nous avions pris le soin d'affiner autour
du délai optimum d'incubation.
- Troisième phase : la croissance mycélienne devient inférieure (en valeur
absolue) à l'autolyse mycélienne ; au fur et à mesure du vieillissement des cul-
tures, l'autolyse augmente au point de devenir prééminente par rapport à l'ac-
crloissement pondéra1 ; la résultante décro9t progressivement, ce qui correspond
aux branches descendantes des courbes.
Toutes ces données confirment parfaitement les conclusions tirées
de la figure 4.
1.5.2.4 - Régulation du pH-
La figure 6, matérialisant l'iwolution du pH au cours du vieillisse-
- 46 -
ment révèle, qu'excepté pour le pH de 2,35, tous les autres tendent vers 8,20
à 8,30 au bout de 41 jours.
-.
Cette évolution s'expliquerait par l'activité du champignon, la
preuve nous en est fournie par le fait que pour un pH très bas (2,35) où l'ac-
tivité du parasite est tres réduite, nous observons corrélativement une tres fai-
ble variation du pH. Cette hypothèse est conforme aux conclusions établies par
LILLY et BARNETT (1951) qui expliquerent le phénomene consideré à partir du mé-
tabolisme du champignon : le parasite utiliserait des anions et cations pour fa-
briquer et excréter dans le milieu des composes acides ou basiques (édifiés res-
pectivement par utilisation de glucides et d'amino-acides). Ainsi au-delà d'une
certaine date, le tampon ne parvient plus à s'opposer aux variations de pH im-
posées par le parasite.
C'est pourquoi, et en dépit de ce que nous avons soutenu par ailleurs,
la plus grande fiabilité de la méthode pondérale, il nous semble que pour le fac-
teur pli, la méthode radiale devrait fournir des résultats bien plus représenta-
tifs à la condition que les mesures soient réalisees très précocement ; encore
qu'on puisse nous opposer l'argument somme toute logique de l'accumulation des
produits excrétés par le parasite faute de migration possible sur un substrat
gélosé.
1.5.2.5 - Croissance radiale du parasite en fonction du EH
------------------,----
-_-----_-_--I__-------- -
S'agissant de la croissance radiale en fonction du pH (cf figure 7),
la prkocité des mesures suppose par exemple qu'au bout de 48 heures, le pH du
milieu soit tri% peu différent de ce qu'il était le jour de l'inoculation ; si
cette hypothèse est vraie, le pH 5,95 serait le meilleur pour la croissance my-
célienne ; la bande des pH observés en liquide s'expliquant par l'activité du
champignon qui rehausse tres t8t les valeurs de 3,95, 5,30, vers cette valeur
-
-
optimale.
II - PARAMETRES DE LA CONIDIOGENESE DE P. oryzae
-
De nombreux facteurs (température, humidité relative, lumière, pé-
riode d'incubation, nombre de repiquages, nature des substrats nutritifs, etc...)
influent sur la production d'organes de reproduction.
- 47 -
Ainsi par exemple, la production de conidies à partir de lésions
foliaires n'a lieu que par une humidité relative de 93 % ou plus ; on observe
par ailleurs une corrélation positive entre vitesse de sporulation et éléva-
tion de l'humidite relative (tout au moins dans certaines limites bien préci-
ses de l'humidité relative).
De m&ne, des feuilles sur pied porteuses de lésions placées à 100 %
d'humidité relative émettent des conidies pendant la seule période nocturne ;
l'émission débute peu de temps aprk la chute du jour, atteint un maximum en
quelques heures et décroft lentement pour s'arreter a l'aube.
Il semble que l'alternance obscurité-lumière soit nécessaire.
Dans ce paragraphe, nous nous proposons de tenter une approche de
la conidiogénèse en relation avec le milieu nutritif, la température, le pH.
C'est en considérant conjointement les aspects trophiques et ceux ayant trait
a la conidiogénèse que nous parviendrons a appréhender les criteres de choix
des conditions des cultures.
Le principe d'appréciation de la conidiogénèse sera le suivant :
- pour les cultures en milieu liquide-, nous ajoutons a la culture (en
erlenmeyer) une vingtaine de billes de verre, le bouchon de coton cardé est
recouvert de papier d'aluminium ; l'homogénéisation est obtenue après 2 minu-
tes d'agitation vigoureuse ; l'évaluation de la concentration conidienne se
faJt alors a l'aide de l'hématimètre de MALASSEZ,
- pour les cultures en milieu solide, 4 rondelles Sont prélevées par
bolke de Petri a 1"aide d'un emporte-piece de diametre intérieur égal a13mm.
Pour un essaidonné (un pH par exemple), 4 x 5 échantillons sont ainsi prUe-
vés et placés dans un erlenmeyer renfermant une vingtaine de billes de verre
ainsi que 10 ml d'eau distillée. La determination de la concentration conidien-
ne est réalisée comne précédemment.
Remarque : en raison des méthodes différentes de mise en suspension des coni-
dies, aucune comparaison directe n'est valable entre les chiffres obtenus pour
les milieux solide et ljquide.
On devrait cependant, en interprétant isolément chacun de ces résultats, abou-
tir a une m&me conclusion pour un paramètre donne.
- 48 -
2.1 - Influence du milieu sur la conidiogénese
2.1.1 - Précocité de la sporulation
On sait depuis longtemps (cf KREBS cité par BERDUCOU : thèse, 1957)
que, de façon générale, les conditions favorables a une woissance luxuriante
sont quelque peu défavorables à la prolifération d'organes de fructification ;
par contre la dessication des cultures, les variations subites de température,
l'appauvrissement du substrat sont autant de conditions favorisant le phénomène
de sporulation.
Certains milieux, par leur composition meme, sont plus favorables
8 la conidiogénèse que d'autres ; ainsi, le milieu modifie de GOTO (20 g de
grains d'orge lavés ; 1 g de feuilles de riz hachées ; 20 ml d'eau distillée
stérile dans un erlen de 250 ml) induirait une très bonne sporulation en 3 ou
4 jours.
Le choix des milieux pour les essais concernés a porté sur le PCA,
le PDA, le MISAT0 6.5/AGAR, l'ORGEOSE/A.
- La sporulation sur PCA et MISAT0 6.5 a été excellente dès le 5e jour
d'incubation à 25°C.
- Sur ORGEOSE, la croissance est luxuriante et parallèlement les organes
de fructification ne se manifestent que très tardivement vers le 12e jour.
- Sur PDA, 4 zones concentriques ont été examinées :
. les deux zones centrales et la région marginale (déjà décrite
au 2e chapitre) sont toutes trois exemptes de conidies,
. seule la 3e zone (bordant intérieurement la bande externe) révèle
des conidies vers le 12e jour.
2.1.2 - Caractéristiques des conidies en fonction du milieu
Les résultats suivants ont été observés sur PCA, MISAT0 6.5,
QRGEOSE.
- 49 -
PCA
ORGEOSE
Longueur moyenne
des conidies
24,39 (+ 0,48)
23,19 (+ 0,42)
21,40 (+- 0,37)
(Imicron)
Largeur moyenne
des conidies
8,96 (’ 0,19)
9,07 (’ 0,17)
8,71 (k 0,17)
(Imicron)
Nb de conidies
unicellulaires
Nb de conidies
bi'cellulaires
Nb de conidies
ai 3 cellules
9 6
Nb de conidies a
plus de 3 cellules
Nombre total de
conidies examinées
Taibleau 8 - P. oryzae : dimensions moyennes et cloisonnement des conidies en
-
fonction du milieu ; 25"/obscurité continue ; les valeurs entre pa-
renthèses désignent les intervalles de confiance.
2.2 - Influence de la température sur la conidiogénèse
La gamne des temperatures compatibles avec la conidiogénèse serait
comprise entre 10-l!i” et 35°C ; l'optimum thermique étant de 28OC. Cependant,
le rythme de la conidiogenese est fonction de la temperature ; ainsi à 28'C,
13émission des conidies est tres rapide jusqu'au 9e jour seulement ; par contre,
iI 16', 20" et 24' cette émission se poursuit m&ne au-dela du 15e jour (HENRY
et ANDERSON, 1948). La temperature letale des conidies est de 50°C en 13 a
15 mn dans l'eau ; cependant, certaines conidies survivent 30 heures a 60°C
lorsque l'environnement est sec (SUEDA, 1928).
Les températures expérimentales choisies sont : 10,5', 15", 17",
-v-
2Ei0 et 30" .
--, -
- 50 -
Le diamètre interieur de l'emporte-piece utilisé est de 6 mn.
L'inoculum utilise provient de la variété 302 G, il est dgé de
1.5 jours a 25°C sur PCA.
Les essais ont fourni les résultats suivants après 9 jours d'incu-
bation.
17"
20"
25"
30"
Précocitê de la
6e jour
6e jour
5e jour
5e jour
Concentration
17 333 1 89 000 1 156 333 1 206 666 i
Tableau 9 - P. oryzae : Précocité et intensité de la sporulation en fonction
de la température ; PCA/obscurité continue.
L'expression graphique de ces resultats (cf.fig,. 8) permet de situer
l'optimum thermique autour de 30'.
Nous nous posons ici la question de savoir quelle serait l'influen-
ce -si influence il y a- du transfert subit de l'inoculum de 25" vers les au-
tres températures ?
N'y a-t-il pas eu au cours de ce transfert un choc thermique qui
s'ajoute a l'effet direct de la température de 10,5O; 15"; 17"; 20" et 30' ?
2.3 y Influence du pH sur la conidiogénèse
2.3.1 - Sur la précocité de la conidiogénèse
Lableau 10 - P. oryzae : .précocitè de la sporulation en fonction du pH/PCA/
25O/obscurité continue.
SO
(“Cl
Fig. 8 - P . oryzae : Intensité de la conidiogénhe (milliers
de conidies/ml) en fonction de la température ;
PCA/âge = 9 j/obscurité.
- 52 -
2.3.2 - Intensité de la conidiogenese en fonction du pH
60 666 157 666 1
432 333 389 333 3:
Tableau II - P. OPyzat? : intensité de la conidiogénèse (exprimée en nombre de
- - - -
conidies/ml) en fonction du pH a 25OC après 16 jours d'incubation
En milieu solide, les valeurs adéquates de pH se situent entre
4 60 et 5,95 (cf'flg. '9, courbe.A). Par contre,
-L-.
les résultats obtenus en milieu
-e,-
liquide (cf fig. 9, courbe B) situent cette bande entre 3,95 et 5,30. Enfin,
- -
compte-tenu de l'évolution des pH de base que nous avons évoquée au début de
ce chapitre et que nous retrouvons naturel'lement ici (cf devenir du pH après
16 jours : tableau 11), il serait normal que nous décalions la bande jugée conve-
nable vers les pH rétilés par l'essai sur PCA ; en effet, nous devrions pour in-
terpréter,
tenir compte du fait que la valeur de 432 333 conidies (pour le pH
de base 3,951. serait partiellement imputable à une action du parasite qui élève
ce pH pour les raisons déjà évoquées.
2.3.3 - Caractères des conidies en fonction du pH
-
Nous nous proposons de voir si les divers pH induisaient une varia-
tioln significative dans les dimensions des conidies.
\\l
\\\\\\I\\
Fig. 9 - i). oryzae
: Intensité de la conidiogénèse (milliers de
conidies/ml) en fonction du pH ; 25"C/dge = 16 j/obscurité ;
A = PCA ; B = PC.
- 54 -
-
Nb de conidies
unicellulaires
Nb de conidies
bicellulaires
Nb de conidies
tricellulaires
Nb de conidies
a plus de 3
cellules
Total conidies
examinees
Tableau 12 - P. oryzae : dimensions moyennes et cloisonnement des conidies en fonc-
-
tion du pH ; culture sur PCA tamponné, dgée de 8 jours, a 25"C/
obscurité continue.
NB - Les valeurs entre parenthèses désignent les intervales de confiance
Afin de cerner le type de liaison établi entre dimensions des coni-
dies de P. oryzae et pH initial du milieu de culture (PCA), nous avons évalué les
paramètres de la régression considérée ; les valeurs observées sont les suivan-
tes :
- par rapport à la longueur des conidies :
. le coefficient de régression observé est r = -0,73
. la pente de la droite de régression
m = -0,60
. l'ordonnée à l'origine
b = +26,23
- 55 -
Ces résultats révèlent une regression négative très significative
C/r/ = 0,731 voulant exprimer que la longueur des conidies de P. oqzae est in-
versement proportionnelle à la valeur des ~HO (tampon Mc Ilvaine).
Conformément aux travaux de ALBERTINI et al. (1972) sur CoGtiewn
bekjerinckii, C. cardinate, Hetmintihosporim teres, H. sati,vwn et dans la 1 imi -
te des pH compatibles avec une bonne croissance et une bonne sporulation, les co-
nidies de P. ozyzae sont d'autant plus longues que le pH0 est bas etinversement.
- quant à la régression éventuelle entre largeur des conidies et ~HO, elle
est à nos yeux peu significative puisque les valeurs observées sont :
r = -0,lO
m= -0,lO
b = +9,02
- enfin, nous avons comparé par test statistique les longueurs moyennes
des conidies à pHo 3,95 et pHo 7,50 (cf les valeurs extremes du tableau no 12) ;
- -
nous trouvons :
t= 8,33 pour un t,,,5 = L! au seuil de 5 %
La différence étant tres hautement significative tant au seuil de 5 % qu'à ce-
lui de 1 X, nous pouvons rejeter l'hypothèse nulle et postuler que le pH ini-
tial exerce une action significative sur la longueur des conidies de P. oryzae.
2.3.4 - Cinétique de la sporulation
Cette expérience réalisée en milieu liquide vise à déterminer la pé-
riode optimale d'incubation pour une sporulation maximwn.
Le milieu de base a été tamponné à pH = 5,30 ; l'incubation a eu
lieu à 25°C.
I --
Périodes d'incubation (j)
5
7
14
18
2 6
Nombre de conidies ml
par
13 333
124 DO0
471 666
227 333
253 000
-
-
Devenir du pH de base
5,95
6,70
7,60
8,00
8,20
A
Tableau 13 - P . oryzae
-
: cinétique de la conidiogénese ; PCA/25"C/pH, 5,30.
- 56 -
La période optimale d'incubation â 25°C pour un pH de base a 5,30
serait de 14 jours environ.
III - PROBLEMES RELATIFS A LA GERMINATION DES CONIDIES
-
-
Les spores sont des structure3 r microscopiques spécialisées, autono-
mes et pouvant initier une croissance nouvelle ; toute intervention écologique
ou visant à cerner le spectre de répartition de germes économiquement importants
devra, sous peine d'inefficacité, tenir compte de la germination des spores.
La germination quant â elle sera définie comme un processus dans le-
quel partie ou totalité des métabolites nécessaires sont présents ab initia
dans l'organe considéré ; c'est dans la nature qualitative et quantitative de
ces réserves que réside le degré de dépendance de la spore en germination vis-
â-vis des titabolites exogènes.
Outre cet aspect trophique, ce phénomène physiolog ique*est fonct ion
de parametres divers tels par exemple la température, le pH, 1 'oxygène, la
concentration conidienne, etc....
La turgescence des spores par exemple (donc la présence d'eau) pa-
raTt ëtre une règle générale ; elle a été observée et décrite pour les sporan-
giophores (BULLER, 1934), les ascospores (GWYNNE-VAUGHAN et WILLIAMSON, 1927),
les basidiospores (HESSE, 1876 ; BRODIE, 1936) et les conidies (BONNER, 1948 ;
GOTTLIEB, 1953 ; HAINES, 1930 ; MANDELS et DARBY, 1953 ; SORGEL, 1956 ;
YARWDOD, 1932 ; etc... ). Il faudrait remarquer que les conidies des o'ïdium ne
s'hydratent pas avant germination et constituent l'exception â la règle généra-
le universellement admise ("Water and germination" par V.W,, COCHRANE in
"Physiology of Fungi", 1958). De plus, il arrive que des spores morphologique-
ment normales ne germent qu'après une certaine période ; de telles spores se-
raient en phase soit de maturation (ladite période est alors relativement brè-
ve), soit de dormante (plusieurs semaines â plusieurs mois) ; le taux de germi-
nation pouvant varier en conséquence, chaque expérience réalisée ici sera analysée
par rapport â un témoin fraichement établi â partir de la même suspension coni-
dienne.
Enfin, le phénomène physiologique qu'est la germination révèle
trois manifestations successives :
- 57 -
- la turgescence,
- la division nucléaire (BAKER, 1945 ; BELLINGER, 1956),
- l'émission du tube germinatif.
Sous peine de demeurer partielle, notre interpretation devra tenir
compte du taux global de germination et de la dimension du tube mycélien qui,
d'une certaine façon, visualise la cinétique du phénoméne.
Nous nous limiterons dans ce qui suit a l'étude de la germination
des conidies de P. oryztze en fonction de la concentration conidienne, de la
température,
de la lumière et du pH.
N.B. : "BAIN D'ARRET" : au bout du délai fixe d'incubation (5 heures),
nous stoppons l'évolution de la germination ainsi que le développement des tu-
bes mycéliens par addition de 2 gouttes d'acide acétique concentre ou de formol.
3.1 - Germination en relation avec la concentration conidienne :
-
-
Résultats. exoression. discussion
--
--
Nombre conidies
490 000
245 080
122 500
61 250
30 125
observés
-
-
%
45
61,66
75,77
66
76
Germination
- - -
Nombre de
conidies
300
300
300
300
300
-
--
-
t
- - -
Longueur tube mycélien
(microns)
66,64
80,08
86,38
83,15
85,68
- - -
-
-
Nombre de tubes mesurés
79
75
75
75
75
--
-
-
Tableau 14 - Influence de la concentration conidienne sur la germination des
conidies de P. oryzae ; expérience réalisée à 25"/obscurité
totale/durée d 'incubation de 5 heures.
NB - Chaque pourcentage ind iqué est une moyenne entre 3 mesures isolées effec-
tuées à partir de 3 lames a concavité différentes.
- 58 -
Nous constatons (tif tabléau 14) qué le taux de germination ainsi que
la longueur du tube germinatif sont plus élevés (75,77 % et 80,OB microns res-
pectivement) pour la concentration moyenne de 122 500 conidies/ml que pour celle
tres forte de 490 000 conidies/ml [les valeurs obtenues sont de 45 % et 66,64
microns respectivement] ; cette réduction, notée pour les concentrations coni-
diennes élevées tiendrait au phénomène d'auto-inhibition ou “SELF-INHIBITION”
qui a été très étudiée chez Urornyces phaseo2i (YARWOOD, 1954-1956), chez
Puccinia graminis tritici (ALLEN, 1955) et P. helianthi (YARWOOD, 1956).
L'auto-inhibition, dont l'existence a éte établae in uiuo et in vitro
tiendrait, par exemple chez P. gruminis tritki, à l'intervention d'une subs-
tance thermostable, plus efficace à pH élevé et qui serait relativement inacti-
vable par les surfaces de verre.
,?yricuZaria oryzae serait lui-même générateur d'une toxine appelée
pyricularine et toxique vis-à-vis des conidies du parasite dont elle interdit
la germination ; lorsqu'il infeste un halte sensible, le parasite produit et
accunule parallèlement de la pyricularine dont il se prémunit par la synthèse
d'une "PYRICULARIN-BINDING PROTEIN" formant avec la toxine un complexe non toxi-
que pour le champignon mais toxique pour le riz.
Au-delà de ce problème expérimental, l'auto-inhibition joue un rble
écologique essentiel en ce qu'elle réduit la germination des spores au niveau
des fructifications ; les spores non germées sont plus résistantes aux agres-
sions du milieu que ne le sont celles germées ; ce qui en fait les agents de
dispersion par excellence.
3.2 - Germination des conidies en fonction de la température : résultats,
expression, discussion
Evs
5
11
15
2 0
2 5
T
3 0
4 0 ’
4
5,33
31,7O
8 8
90,66
8 5
0
3 0 0
3 0 0
3 0 0
3 0 0
3 0 0
3 0 0
3 0 0
3,14
4,49
40,69
56,58
66,14
47,22
0
5 0
5 0
5 0
5 0
5 0
5 0
5 0
Tableau 15 - P. oryzae : germination des conidies en fonction de la température.
- 59 -
Ree : les conidies ont été mises en suspension dans l'eau distillée à
concentration de 47 600 conidies/ml ; la période d'incubation, égale pour tou-
tes les températures, est de 5 heures.
Manifestement les très basses températures sont inadéquates pour
la germination des conidies ; nous pouvons aussi postuler que les conidies pla-
cées à 40°C ont été tuées puisqu'en les reprenant pour les incuber à 25°C (qui
semble proche de l'optimum thermique), il n'y a aucune modification, aucune évo-
lution, méme après 48 heures.
De plus nous observons une corrélation positive entre pourcentage
de germination et longueur du tube mycélien ce qui paraft normal puisque le
tube mycélien serait d'autant plus allongé que son émission est plus précoce.
3.3 - Germination des conidies en fonction du pH : résultats, expression
discussion
-
-
-
-w-e--
4
2,40
6,75
8,lO
-
Nombre conidies
5 4
germées
0
79
--~
Nombre conidies
non germées
100
21
4 6
Total
100
--
% germination
92
96
5 4
/
I
--
Longueur tube
germinatif
43,4
43,86
39,5
20,06
(30 conidies)
('t 23)
P 63)
(' 5,72)
(-: 2,63)
-
-
Nb tubes germi-
natifs avec
appresorium pour
0/5Q
x/50
3150
0/50
0/50
t
50 conidies
---I-l---L
Tabileau 16 -
-
-
-
Germination des conidies de P.. oryztze en fonction du pH ; mélange
volume à volume de la suspension conidienne et du tampon Mc Ilvaine
dans la lame à concavité ; incubation de 5 heures/25'C/obscurité.
- 60 -
De façon genêrale, les spores germent au sein d'une fourchette de
pH plus restreinte que celle qui est caractéristique de la croqssance mycé-
lienne ; cela pourrait s'expliquer par le fait que les spores ne disposent pas
d'un délai suffisant pour modifier par leurs dérivés métaboliques un milieu à
pH de base peu favorable.
La plupart des germes cryptogamiques, dont P. a.~@&, germent mieux
entre pH 4,5 et pH 6,5 et présentent une réduction notable à pH 3 et pH 8.
3.4 - Germination des conidies en fonction de l'heméroperiode : resultats,,
expression, discussion
Nb conidies germées
8
90
50
Nb conidies non
germées
92
10
50
Total
100
100
100
% germination
8
90
50
Longueur tube my-
célien (micron)
16,80
,32,20
40,13
Moyenne pour
P W)
(* 3,6)
(+ 493)
30 conidies
p.20 conidies
Tableau 17 - Germination des conidies de P. ~wyzae en fonction de l'héméro-
période : L = 5 heures lumière ; L t 0 = 2 heures lumière +
3 heures obscur ité ; 0 = 5 heures obscuri té ; incubation a 25".
La lumière continue semble peu favorable à la germination ; par
contre, l'alternance lumineuse et l'obscurité continue induisent une bonne ger-
mination.
- 61 -
Discussion
Il est évident que des chapitres aussi importants que complexes
tels les mécanismes agressifs (toxines, enzymes), les mecanismes de variation...
du parasite meriteraient d'(5tre abordés ou approfondis ; cependant, nous avons
voulu nous en tenir a ce PREALABLE PROSPECTIF sur la base duquel nous en arri-
vons au probleme crucial de la lutte contre le parasite.
De par son essence méme (et à fortiori de par l'esprit qui le guide
de nos jours), l'art qu'est l'agriculture est source de rupture des équilibres
naturels ; ainsi, les modifications physico-chimiques du milieu, l'introduction
de cultivars élaborés au point de ne.persister qu'avec le secours de l'homme,
le maintien des memes génotypes dans une meme aire géographique, le retour d'une
culture sur elle-meme pendant plusieurs annees l'usage abusif de pesticides,
etc..., s'ils assurent une meilleure production à court terme, n'en engendrent
pas moins de graves problèmes si l'on en juge par l'équilibre instable des rela-
tions hote-parasite nouvellement établies apres intervention de l'homme : l'exem-
ple du riz et du Pyticulatia oryzae est à ce propos édifiant ; dans la suite de
cet ouvrage , nous voudrions aborder le problème de l'eradication du parasite ou
mieux, celui du maintien de ce dernier en-dessous d'un seuil économiquement to-
lérable par le biais d'auxiliaires naturels.
2ÈME
P A R T 1 E
C O N T R I B U T I O N A L ’ E T A B L I S S E M E N T D ’ U N E
M E T H O D E D E L U T T E B I O L O G I Q U E C O N T R E
Fymhilaria ozyzae Cav.
- 63 -
;
Les systèmes foliaire et radiculaire; ainsi que les milieux associes
(phyllosphere et rhizosphère respectivement) sont le siege d'une population bal>-
tisée spermoflore et dont le r61e et la nature sont des plus variables.
Certains de ces germes sont parasites actifs, d'autres saprophytes
vrais, d'autres encore sont dits sy/biotiques.
Quant a la composition qualitative et quantitative de la microflore
saprophyte, elle varie suivant l'espèce de végetal (KERLING, 1964), l'$ge des
feuilles (DICKINSON, 1967), la température, l'h&n&op~riode et l'humidité rela-
tive qui est particulierement importante.
La microflore caractéristique de la rhizosphère serait relativement
plus stable que celle de la phyllosphère soumise a de fréquentes fluctuations
du milieu.
La population microbienne foliaire serait en outre liée au stade
phys iologique de la plante h8te ; ainsi, l'activité maximale serait observée
pendant la période de floraison en raison d'un apport de grains de pollen
(FOKKEMA, 1968, 1971 ; DIEM, 1970).
La connaissance de la biologie, du rble et des potentialités des
germes foliaires exige comme.préalable l'isolement et l'établissement de cultu-
res pures et monosporees des germes considérés (cf annexe technique no 4).
Nous .savons qu'au cours de la phase infectieuse (ou après une blessu-
re), le végétal peut manifester une réaction de rkistance par le biais d'inhi-
biteurs préexistants et connus sous le terme de phytoncides.
Nous savons également que suite à l'infection, l'hbte peut fabriquer
"de TU)VO" des substances (phytoalexines) inhibitrices à l'end.roit du germe exo-
gene.
Au-delà de ces observations, force nous est de constater que dans
la diversité de la flore fongique, il existe des espèces souvent banales qui,
de par leur comportement (hyperparasites de germes phytopathogenes ou produc-
teurs de toxines antifongiques), permettent d'envisager une forme de lutte bio-
logique.
D'un autre cote, l'implication de la mycoflore dans la technologie
alimentaire (fromages et fermentations diverses), le large spectre d'utilisation
- 64 -
des antibiotiques tels la pénicilline, la streptomycine, la tyrothricine (éla-
borés par Penicilliwn notatum, Streptomyces griseus et BaciZZus brevis respec-
tivement), la blasticidine S (produite par Streptomyces griseo-chromogenes
FUKUNAGA), témoignent de l'intétit considéwble porté aux genérateurs de tels
produits).
L'utilisation d'auxiliaires microbiens dans la lutte contre les ma-
ladies est des plus diverses :
- activités antibacteriennes des champignons,
- action antifongique de certains champignons,
- effets des batteries et actinomycètes sur les champignons,
- champignons entomophages,
- particules virales destructrices de certains champignons,
- bactériophages, etc....
Nous nous bornerons ici a examiner quelques exemples permettant de
cerner l'état actuel des recherches traitant des champignons mycoparasites :
- Des feuilles de riz préalablement inoculées par une race avirulente de
CochlioboZus miyabeanus (forme parfaite de He&inthosporiwn oryzae) sont moins
sujettes a l'infection par une race phytopathogène du germe (SINHA et TRIVEDI,
1969).
- Selon les travaux de Mc LEAN (1967), DEVERALL et al. (1968), l'infection
des feuilles de melon ou de feve par des races virulentes de CoZZetotrichum
orbicuZare et C. Zindemthianurn respectivement est moins grave si elle est pré-
cédée par l'inoculation par une race avirulente des germes correspondants.
- De m&w, on observe une réduction notable des urédospores de MeZampsora
occidentalis par Trichodeyma, E8’picoccum,
AspergiZZus spp qui sont autant de ger-
mes communément présents sur les feuilles de peuplier ; la germination des uré-
dospores semble très affectée in vitro (BIER, 1965).
a- Enfin, les plants de riz développés a partir de semences trempées dans
un extrait de culture d’HeZminthosporiwn oryzae BREDA de HAAN, manifestent une
meilleure résistance que ceux issus de semences non traitées (GANGLY et
PADMANABHAN, 1962).
De nombreuses recherches permettent désormais d'affirmer que la pré-
sence d'une microflore naturelle, notamment sur les parties aériennes telles que
-
- 65 -
les fleurs, les fruits, les feuilles, les tiges, engendrerait un milieu fon-
gistatique vis-a-vis de certains agents phytopathogènes.
Des études approfondies expliquent l'antagonisme in uitro soit par
un phenomène de mycoparasitisme,
soit enfin par l'implication de substances
antibiotiques inhibitrices : FAWCETT (1931), PORTER et CARTER (1938), WAKSMAN
(1945), WEINDING et a1 . (1950)) WOOD et TVEIT (195!i), DARPOUX (1960)) BARNETT
(1963, 1964)) BOOSALIS (1964) et TOUZE-SOULET (1967).
'
Dès lors, toute intervention pouvant altérer qualitativement et/ou
quantitativement la population microbienne du biotope (traitement pesticide no-
tarwnent) devra etre soigneusement dosée :
- NOUS savons par exemple que, lorsqu'un sol prealablement sterilisé est
recontaminé par certains parasites telluriques (germes occasionnant la fonte
des semis en l'occure'nce), les symptbmes morbides observes sont plus prononcés
que sur un sol non sterilisé au niveau duquel le parasite se trouve neutralisé
par les microorganismes antagonistes (LILIAN E. HAWKER, 1950).
- Des feuilles de seigle porteuses de densites variables de germes sapro-
phytes (pulvérisation soit par l'eau , soit par une solution de bénomyl) sont
soumises a une infection par C. miyabeanus juste avant floraison ; on remarque
que les échantillons préalablement pulvérisés par l'eau présentaient une quan-
tité de necroses inférieure de 60 % a ceux prétrajtés par le bénomyl ; dans cet
essai, réalisé en 1972-1973 en parcelle expérimentale, le fongicide avait dé-
truit la microflore saprophyte normalement antagoniste du parasite (FOKKEMA,
VAN DE LAAR, NELIS-BLOMBERG et SCHIPPER, 1975).
La présente étude vise a révéler in vitro les aptitudes des micro-
organismes épiphytes à s'opposer à l'infection du riz par Pyricularia oqpae
et a en dégager le mécanisme ; l'isolement et la caractérisation des produits
impliqués ainsi que les expérimentations in vivo retiendront notre attention au-
dela de notre cadre actuel de travail.
Du reste, avant d'expérimenter in vivo (sur l'hbte ou les organes
de l'h6te maintenus en survie) , il n'est pas inutile d'opérer ,in vitro où les
conditions de croissance sont a priori plus favorables que celles offertes par
l'hbte dans son milieu naturel.
Les investigations actuelles distinguent le parasitisme (par exemple
- 66 -
le mycélium de Trichodem s'enroule autour des h.yphes de Rhizoctonia solani),
de l'antagonisme (où l'agent auxiliaire intervient a distance par le biais de
substances inhibitrices diffusibles) et du phénomene conjugant les deux prédé-
de!lt!j .
Nous parlerons d'ANTAGONISME pour désigner indifféremment l'un
quelconque de cestrois aspects ; souvent d'aillews, les phénomènes que nous
avons observés traduisent l'interférence entre parasitjsme de contact et anta-
gonisme avec predominance de l'un ou de l'autre selon les conditions expéri-
mentales.
Les composantes de cette deuxième partie seront abordées dans l'or-
dre qui suit :
- Définition du matériel biologique et criblage sélectif des germes sapro-
phytes.
a- Mise en évidence du phénomène d'antagonisme in vitro.
- Essai d'interprétation du phénomène d'antagonisme.
- Action de quelques fongicides comparée à celle des germes antagonistes.
- 67 -
CHAPITRE PREMIER
DEFINITION DU MATERIEL BIOLOGIQUE ET
CRIBLAGE SELECTIF DES GERMES SAPROPHYTES
I- GERMES
CRYPTOGAMIQUES
1.1 - 3@+&4Zaria oryzae Cav.
Nous pouvons le caracteriser par la formule globale
Sel 3ü2 G (N)H2OUS exprimant qu'il s'agit de la souche no 1 de P. oryzae isolée
à, partir de fragments infectés du cou (N = NECK) de la varieté Sefa 302 G et
incubés sur papier filtre stérile inhibé d'eau distillée stërile (H2ODS).
1.2 - Germes saprophytes isolés à partir du riz
-
-
La microflore concernée est isolée à partir des 4 hôtes suivants :
- BOUAKE P11
- variété Se 302 G
- variété IKONG PAQ ou IKP
- variété TTW
Pour chacun des organes (graine, cou, feuille) des variétés préci-
tées, les méthodes d'isolement utilisées (lavage, impression, observation direc-
te avec ou sans désinfection) sont consignées dans l'annexe technique no 4 figu-
rant à la fin de cet ouvrage.
Afin de matérialiser la variété hote d'origine ainsi que la réparti-
- 68 -
tion des germes isolés selon les organes de l'h8te et.en fonction des techni+
ques d'isolement, nous formulons les résultats sous forme de tableau à triple
entree (cf tableau 18).
1.3 - Germes fournis par BAARN
- Alternuria dauci
(KÜHN) GROVES et SKOLKO
- Aureobasidiwn pullulans (DE BARY) ARNAUD
- Chaetomiwn gz0b08m ~(UN~E ex FR.
- Epicoccwn purpwuzscens EHRENB. e.x SCHLECHT. (Extra)
- Epicocczun purptcmscens EHRENB. e.x SCHLECHT. (E. oryzae souche ITO)
- GZioeZadiwn roseum (LINK) BAIN
- Gonatobrotys simplex CORDA
- Gonatobotyywn maculicolum (WINT.) SACC.
- Myrotheciwn verrucatia (ALB . et SCHW. )
- Penieillium f’requentans WESLING
- Pyrieulatia oryzae CAVARA
,- Ttichoderma viride PERS. ex S.F. GRAY
TOUS ces germes cryptogamiques ainsi que Coniothyrium minitans sont
reproduits sur PCA/25"/obscurité continue,
II - CRIBLAGE SELECTIF EN VUE DU CHOIX DES GERM_ES UTILISABLES DANS UNE PERSPEC-
TIVE DE LUTTE BIOLOGIQUE (Planche no 1)
Disposant ainsi d'une série de germes, nous nous proposons d'en ré-
véler l'activite antagoniste éventuelle sur la base du degrP d'inhibition de la
croissance mycélienne radiale du parasite. Ne sont retenus au travers de ce cri-
blage sélectif que les germes exerçant une inhibition jugée significative et qui
serviront de base pour une étude mieux approfondie.
Dans cette première étape , seul le parasite est issu d'une culture
monoconidienne.
Au moment du criblage sélectif, tous les germes y compris P. oryzae
avaient évolué pendant 7 jours a 25"C, sur PCA et a l'obscurité continue.
La confrontation se fait par inoculation simultanée d'un disque
- 69 ..
~ I I
”
. < - - - - - _ -
-
C O U
Organes /
T
Feuille
Grain
Technique!
isolement
:; tmptomyces sp
1 = Impression
l Streptomyces sp
CurvuZaria lunata
I. I _^“._---
-L ---
-
-
0.1). = Observatior
,?.,,;ur~iuYrl
Aspeqillus niger
directe :: 1 heure
AspergiIlus niger Botrytis
agitation dans
Rspergillus flavus VerticilZium
H2QDS + séchage
BOUAKE
I-~--I
.-
-l---
O.D.D. = observat
?Il
directe après dé-
Curvularia lunata sinfection par hy,
Helminthosporiwn
pochlorite de so-
dium, 10 % pdt7mr
L = lavage dans
H20DS
4
Streptomyces sp
Streptomyces sp
CurvuZaria luna ta
1
GZiocladiwn X4
Aspergilk4s flavus
AXI l?.,
I Y
Curvularia
AX2 ('?I
L34sar4um rosewn
O.D.
Fusarium
:KONG-
Penici lliwn
Streptomyces
PAO
Stu~eptomyces
Curvuluria lunata
Fusarium
Pusariwn roseum
Pyricu laria oryzae
Helminthusporium
O.D.D.
RamuZaria
Pyricularia oryzag
uQCl2)
L
1
---
--
Botrytis
Fusariurn
SEFA
DrechsZanz rostratz
0-D.
302 G
---
O.D.D. -
-
-
--
L
1
Rhizopus nigricans
O.D.
TTW
O.D.D.
L
.----
1
--
-
ableau 1.8 -
-
Germes cryptogamiques isolés à partir de 4 variétés de riz.
- 70 -
inoculum du parasite à 30 mm du disque reptisentant le germe teste ; les deux
rondelles étant disposées symétriquement par rapport au centre de la bofte de
Petri (cf annexe technique no 5).
Enfin, l'appréciation du pourcentage d'inhibition de la croissance
radiale du parasite par le microorganisme testé est basée sur la relation
(VAN DEN HEUVEL, 1970) :
Mo = croissance normale exprimée en mm ; Mo reprësente le rayon opposé à la co-
lonie du germe testé.
M = croissance mycélienne influencée (mn)
Mi = pourcentage d'inhibition de la croissance mycélienne du parasite par le
germe testé.
L'ensemble des résultats figure dans le tableau 19.
Au terme des confrontations, nous obser-
vons diverses conformations qu'illustre
le schéma théorique ci-contre :
P = colonie du parasite
A - colonie du germe dont on recherche
le caracterë antagoniste
Mo = croissance radiale (mn) distale de
la colonie parasite (Mo = R)
MZ croissance radiale à proximale de
la colonie parasite (M = r)
(C) - action par contact
(D) = action à distance
= action a distance et par
(D) + (') contact
0
ff!!3clA
P
+D
- 71 -
Germes confrontés
Remarques
avec PJ. oryzae
Chaetomiwn globoswn
1 208 1 8,0 1 60,O 1 Action nette à distance
Epic~ccwn purpurascens ITO /
21,O j 15 ,O j 28,5
/
GZiocladiwn rosewn
-
Alternaria dauci
E2;tioccwnpurpu~~scens Extra
-
Aureobasidium puZZuZans
Gonatobotrywn macuZicoZum 1 22,0 1- 18,O 1
18-,0
Idem
&potheciwn verruearia
21 ,o 1 13,O 1 38,0 1 Action nette à distance
-
Trichoderma vitide
Gonatobotrys simplex
FmiciZlium frequen tans
1 19,O 1 . 17,0 1
:10,5
ILimitat. mut. par contact
Aspergillus fZavus
18,0
13,0
27,8
-
AspergiZZus niger
20,o
12 ,o
-40 ,o
- -
Cuxvularia elavata
19,0
10,o
47,4
Action inverse de 46 %
Cztmularia Zuna ta
20,o
10,o
750 ,o
Action inverse de 50 %
Dr*echsZera .rostrata
--
Fusartwn. roseum
invirse de 50 %
Coniothyrium minitans
19,0
Action inverse de 11,l %
II
GZiocZadiwn X4
--
Starkeyomyces
koorchalomo&les
Contrôle = Sel X 0
1 24,0 1 24,0 1 0,O 1
Tableau 19 - P. oryzae : croissance radiale et inhibition de la croissance
radiale par les germes cryptogamiques. Observations réalisees
après incubation de 5 jours sur PCA/25'/12 heures lumière +
12 heures obscurité. Chaque valeur moyenne est établie à partir
de 5 bortes de Petri,
_ - , _ _ -
-
_...
.‘““~rall>““~““*“----~------~~
- - - . - - ~
-.-
-....
^.-
-..-
- 72 -
III - GERMES SELECTIONNES
A la lumiere des résultats ci-dessus, nous nous sommes arr@tes aux
trois germes suivants pour l'etude de ce type d'interaction :
- Ttidwdem~ titi& en raison du taux d'inhibition relativement important
(59 %) exerce sur le parasite.
- Chaetomiwn gZohosm qui exerce un taux d'inhibition de 60 % est de plus
responsable d'une action a distance et d'une action par contact.
- Enfin, Myrotheciwn verruearia retiendra notre attention en raison d'une
très nette action a distance.
Ces résultats appellent cependant quelques remarques, voire quel-
ques restrictions : les trois germes sélectionnés l'ont éte sur la base d'une
expérience in vitro ; cela signifie que dans les conditions expérimentales
(confrontation sur PCA, température de 25"C, cycle lumineux homophasique),les
germes retenus paraissent les plus intéressants ; rien ne laisse supposer que
lesdits microorganismes manifestent une activité inhibitrice supérieure a celle
des germes non sélectionnés au cours d'expériences in &VO, pr&ues ultérieu-
rement et ce, en raison m&ne de la nature 'complexe des interactions possibles
entre la plante et le germe saprophyte ; interactionsdont la nature peut engen-
drer des effets tout a fait différents de ceux observés in vitro.
- 73 -
CHAPITRE DEUXI,EME
MISE EN EVIDENCE DU PHENOMENE
D'ANTAGONISME
in vitro
I- PRELIMINAIRE
Les cultures pures établies peuvent, en fait, Rre chacune un mélan-
ge de plusieurs souches possédant chacune des caracteres propres ; nous expéri-
menterons pour tous les germes sélectionnés (P. oryzae, T. viride, C. gzobosm,
et M. verrucaz4a) à partir de cultures monospores afin de limiter au mieux les
aleasinhérents au matériel biologique lorsqu'il est soumis à l'action des di-
vers paramètres.
L'Établissement des cultures monoconidiennes se fait par examen mi-
croscopique en chambre de VAN TIEGHEM selon la technique utilisée dans la pre-
mière partie pour P. oryzae (paragraphe intitulé "Méthode de la dilution amelio-
réel' ) .
Ainsi, nous avons pu disposer de :
- 7 cultures monoconidiennes de T. virick,
- 12 cultures monospores de C. g’loboswn,
- 9 cultures monoconidiennes de M. verruearia,
- le nombre de cultures monoconidiennes de P. oryzae étant de 18 dont
11 obtenues a partir de la variéte Se 302 G et 7 de la varieté IKP,
Dans la suite des travaux, nous utiliserons strictement :
- la souche no 5 de Trichodema viride no,tée T5. viride,
- la souche no 1 de Chaetomiwn
globosum notee C,. viride,
- 74 -
- la souche no 1 de Myrotheciwn uerrucaria notee Ml. verrucaria,
- le parasite étant représenté par la souche 1 utilisée des le debut de
cet ouvrage et notée Sel ou PJ. oryzae.
Par ailleurs, la largeur de la zone d'inhibition de Sel ou le pour-
centage d'inhibition de Sel par le germe testé est fonction de la vigueur du
germe et de celle du parasite ; cela veut dire qu'en fonction du substrat nutri-
tif gélosé, de la température, de l'h&néropériode, du pH, etc..., le parasite
aura plus ou moins le temps de se développer avant que "l'antagoniste" ne le
contrarie soit à distance, soit par contact.
E:n bref, la largeur de la zone d'inhibition peut etre affectée par
un retard de la croissance de lJisolat "antagoniste" par rapport à P. oryzae et
inversement ; d'où la nécessité d'étudier le comportement intrinsèque propre à
chacun des microorganismes sélectionnés.
Il importe aussi de cerner quelque peu la biologie des germes choi-
sis sur les plans trophique, thermique, lumineux, ainsi que l'influence du pH.
Nous avons simultanément réalisé l'éitude du comportement des germes
en fonction des paramètres précités.
1.1 - Comportement des germes en fonction Ge la température
Les températures retenues sont de 15, 20, 25, 28 et 37°C ; les cul-
tures sont suivies jusqu'au 10e jour ; les résultats sont consignés dans le
tableau 20.
Remarques : - pour une température et un délai d'incubation donnés, x désigne
une moyenne de'3 valeurs moyennes ; chacune étant obtenue à partir de 2 mesures
effectuées le long de 2 diamètres perpendiculaires pour la bofte de Petri consi-
déde,
- tous les germes incubés à 37°C sont transférés a 25"/obscurité
au bout de 7 jours ; le but de ce transfert est de savoir si la température de
37°C est létale ou provoque simplement une inhibition réversible ; les résultats
sont représentés par le tableau 21.
-_
I-_-I______-<_
_I_ -.-.-..--. -- -.--
.“,_~“u----“-.....-~--II-
e.--m-
--.
m-v
I-
A!ile
Germe
PJ. ozyzae
Tg. viride
Cl. g lobosum
MI. verrucar&z
0)
(“Cl
_I_--
15
-
$0
25,5
13 ,Q
40
2 0
10,o
25,0
15,0
10 ,o
2
2 5
12,0
38,0
19,5
ll,o
2 8
15 ,o
12,0
21,0
14,3
3 7
00
$0
$0
-
-
- -
$0
15
-
00
42,0
18,0
990
2 0
16,O
43 ,o
24,0
13,0
3
25
17.0
61,3
27,7
14 ,o
2 8
21,0
16 ,O
29,3
18,7
3 7
$0
7,O
$0
$0
-
15
990
5 4 , 0 - -
22,3
11 ,o
2 0
19 ,o
60,0
30,o
17,0
4
2 5
26,0
84,0
35 ,o
18,O
2 8
28,0
19 ,o
35 ,o
25 ,O
3 7
790
00
@O
$0
- - -
- -
15
-
17,o
33 ,o
16,O
2 0
32,0
51,0
26,0
7
2 5
36,0
> 90
53,7
27,7
2 8
49,0
50,o
40,5
3 7
$0
15,0
990
_--
-
- -
-
-
15
23,0
40 ,o
20 ,o
2 0
41,0
63 ,O
32,0
9
2 5
48,0
> 90
62,0
36,0
2 8
64,0
58,0
53,0
3 7
Transfert
Transfert
Transfert
Transfert
à 25OC
à 25°C
à 25OC
à 25°C
_--
-
15
-
26,0
42,0
22,0
2 0
48,0
35 ,o
1 0
2 5
55 ,o
> 90
64,0
40,3
2 8
72,0
63,0
58,0
3 7
Transfert
Transfert
Transfert
Transfert
à 25°C
à 25°C
à 25°C
à 25°C
- - -
Tableau 20 - Croissance radiale (mm) de PI. oryzae, T5. viril, c
gtobomn
et Ml. verruearia en fonction de la température ; PC&obscurite
continue.
A/
I
I
I
3c
Fig. 10 - Pl. oryzue (D) ; TA. viride (A) ; Cl. ghboszun (B) ;
Ml. verrucatia (C) : croissance radiale (mm) en
fonction de la température ; PCA/4 j/obscurité.
- 77 -
Cl. gZoboswn
Ml. vewucaria
20,o
12,o
27,0
16,O
45,0
27,0
Arret de la lumière au 4e jour et permanence
dans obscurité continue du 4e au 18e jour
-1
18
> 90,o
> 90,o
> 90,o
> 90,o
Blocage
puissant mais
Reversibilité Réversibilité
réversible
très précoce
tres précoce
Tableau 21 - Croissance radiale (mm) de PJ. ort/zae, 1”s. viride, Cl. globosum,
Ml. verrucatia prealablement incubes 7 jours a 37"C/obscurité
continue et transféres a 25"C/PCA.
La représentation graphique du comportement des germes en fonction
de la température après 4 jours d'incubation est matérialisée par la figure 10.
1.2 - Comportement des germes en fonction de l'héméropériode,
Nous soumettons les germes implantés sur PCA à 3 éclairements :
- lumiere continue = LUM soit 24 h/24 lumiere
- alternance lumineuse = LUM + OBS soit 8 h lumiere + 16 h obscurité
- obscurité continue - OBS soit 24 h/24 obscurité.
L'ensemble des resultats est représenté dans le tableau 22..,
1.2.1 - Résultats
Cl. gzoboswn
T5. viride-
--
LUPl
LUM i
LUM
LUM i
OBS
LUM LUM -
-UM + OBS
OBS
OBS
DBS
OBS
OBS
LUM
IBS
-
-
Conidiogenese
- Précocité
4e j
4e j
4e j
4e j
4e j
zko
zéro
6e j
4e j
4e j .4e j
i
- Intensité
t+t
ttt
ttt
t
ttt
tt
6Fj
1
relative
6?j
t
tt+
+-t-i- " tt+
..--
-
-
i
-
-
Age incubation
2j
13 ,o
-T-
14,0
23,3
24,0
23,0
17,7
16,3
13,0
12,5 12,5
-
-
3j
18,3
21,0 20,5
38,7
46,7
36,3
27,7
26,0
32,3
18,O
17,0 16,0
-
-
-
- -
-
23,7
27,0
26,0
57,3
65,0
55,0
38,0
34,7
39,0
23,2
21,5 20,O
-
-
75,0
> 90
74,0
46,0
I 29 ,o 34,0 32,0
42,0 47,0
28,0
26,0 25,0
- - -
6j
35,0
40,o
39,0
> 90
> 90
> 90
56,0
47,0
52,7
33,0
-
-
-
-
-+
7j
40,0
47,0
45,0
> 90 > 90
> 90
65,0
55,0
59,7
39,0
35,0 33,0
-
-
-
- -
-
/
1
46,7
53,0
50,o
> 90
> 90 > 90
72,0
62,0
65,0
43,0
39,0 37,0
-
-
-
-
/
Ci
52,0
56,0
54,0
> 90
> 90 > 90
> 90 > 90
> 90 47,5
44,3 41,0
-
-
I
10 j
58,7
63,0 60,O
> 90
> 90 > 90 > 90
> 90 > 90
52,0
49,0 44,3
-
-
11 j
69,0 67,0
> 90 > 90
> 90 > 90
> 90 > 90
56,0
53,0 48,0
-
-
Tableau 22 - Croissance radiale (mn) de Pl. oryzae, T5. virile, Cl. globosum et
verruearia sur PCA/25' en fonction de l'héméropériode et du délai
d'incubation .
- /Y -
Remarques : - Chaque valeur du présent tableau désigne une moyenne entre 3 me-
sures issues chacune d'une moyenne entre 2 evaluations determinées selon 2 di-
mensions perpendiculaires de ?a colonie.
- S'agissant de la conidiogBnèse,excepté
Cl. gtobosm pour lequel
les fructifications sont apparues vers le 6e jour, le phénomene s'est manifesté
dès le 4e jour pour les autres germes. L'intensité de la conidiogénèse est appré-
ciée visuellement et matérialisée par des croix :
+++ = excellente conidiogénèse
++ = conidiogénèse bonne
+ = conidiogénèse moyenne.
1.2.2 - Caracteres descriptifs en fonction de l'héméropériode
- 1’5. vitick : colonie poudreuse ; l'intensité de la teinte verdatre est
liée à la conidiogénèse ; la croissance se fait par "bonds" ; on distingue sur
la colonie, des bandes de coloration et de complacité variables : plus la bande
considérée est dgée (bordant extérieurement le disque inoculum), plus dense est
le rrlycélium.
- Cl. gZoboswn : nous observons une colonie régulière qui, au 4e jour est
morphologiquement identique quelle que soit l'héméropériode.
- Ml. Vermcaria : colonie d'un blanc laiteux ; les anneaux observables
sont liés a la conidiogénèse et sont d'autant plus compacts, continus et pig-
mentés que celle-ci est plus prononcée.
1.2.3 - Expression graphique
Figures 11, 12, 13 et 14.
1.3 - Comportement des qermes en fonction du pH
Nous avons opéré avec le PCA tamponné à 20 % par le tampon de
Mc Ilvaine, d 25°C et à l'obscurité ; nous avons arbitrairement choisi 3 va-
leurs : faible, moyenne et forte de pH autorisées par l'échelle Mc Ilvaine.
b'inoculum effectivement utilisé est âgé de 4 jours sur PCA ; les
disques inoculum sont prélevés à la périphérie Ides colonies.
bd
7
6
Fig. 11 - P. oryzae
: Croissance radiale (mm) en fonction de l'hémé-
ropériode et du délai d'incubation ; PCA/25"C ;
A = Lum + Obs ; B = Lumière ; C = Obscurite.
*.,““..-mm,.q’--“-*-~-~--
. . ~
__<_
--.
-.-
---_-_-__-_
-----..-
-11
_.. --.-.--
_*---
Fig. 12 - TA. virile : croissance radiale (mm) en fonction
de l'héméropériode et du délai d'incubation ;
PCA/25'C
; A = Lum + Obs ; B = Lumière ;
C = Obscurité.
1
w
2
1
b
t
&
0
J
Fig. 13 : Cl. gtobosm : Croissance radiale (mm} en fonction de
1 héméropériode et du délai d'incubation ; PCA/X"C ;
A = Lum t Obs ; B = Lumiere ; C = Obscurité.
s
3
b-
I
I
1
8
8
11 J
Fig. 14 - MI. verrucaria
: croissance radiale (mm) en fonction de l'hé-
meropériode et du délai d'incubation ; PCA/E"C ;
A = Lum + Obs ; B = Lumière ; C = Obscurité.
- 84 -
1.3.1 - Formulation des résultats
--
--
---
---
--
---
---
---
'Tableau 23
m--- - Croissance radiale (mm) de Pl. orpre, :Vs. mX&, Cl. g'lobosum et
Ml. zwrrwaria en fonction du pH. PCA/25'C/obscurité continue. Chaque
valeur est une moyenne établie à partir de 3 mesures moyennes.
1.3.2 - Caracteres descriptifs en fonction du pH apres 3 jours
d'incubation
- PJ. oryzae : cf première partie.
- PS. viride
. A pH 3,50 : la croissance est tres rapide ; autour du site d'ino-
culation, nous avons une zone annulaire large de 20 mm caractérisée par un my-
célium très fin, se confondant presque avec le milieu gélosé ; bordant extérieu-
- 85 -
rement cette zone, nous découvrons une bande large de 10 mn dont le mycelium
est plus "aérien", cotonneux ; c'est le site de P?US intense conidiogénèse ;
enfîn, a la périphérie, une plage de 5 mn d'un lmycélium très diffus.
. A pH 5,75 : wcélium enchevetré lkhement ; teinte d'un blanc
cendré.
. A pH 7,50 : rn&nes caractères qu'a pH 5,75 ; cependant la conidio-
génèse est absente jusqu'au Ile jour compris.
- Cl* g:lobosum
: le mycélium est dense, "levuriforme", d'un blanc laiteux ;
à pH 3,50 le contour des colonies ne se régularise qu'au 9e jour alors que
cette irrégularité persiste au-delà du Ile jour pour les colonies développees
à pH 7,50.
- Ml. verrumria : le disque inoculum est cerclé par de tr& fins anneaux
noirs ; le reste est d'un "blanc-hyalin" ; on observe la formation d'un anneau
caractérisé par un mycélium floconneux dense, relativement aérien par rapport
au reste et qui correspond à la zone de conidiolgénèse légèrement pigmentée.
1.3.3 - Expression graphique
Figure 15 (établie après 3 jours d'incubation).
1.4 - Synthèse
L'approche de la biologie et de la physiologie des germes concernés
nous autorise à expérimenter dans les conditions suivantes :
- Substrat nutritif : milieu à base de pomne de terre-carotte, soit sous
forme solide (PCA), soit sous forme liquide (PC) ; ce milieu facile à préparer
donne des résultats satisfaisants pour tous les microorganismes.
- Température : nous opérerons à 25°C eu élgard au fait qu'une température
-
donnée est toujours plus ou moins favorable à l'un ou à l'autre germe ; en au-
cun cas nous ne pouvons satisfaire simultanément les exigences thermiques opti-
males de tous les germes.
- Héméropériode : nous travaillerons à l'obscurité continue (hémérop&iode
nulle) compte tenu du fait que nous ne sommes pas toujours assutis de pouvoir
disposer d'un équipement adéquat (muni d'une rampe d'éclairage).
7c
(mn>
6l
!5(
40
3f
mm
---
2c
- - - - - - - - - - O I - - - . - - -
D-
-I--t+ %z
I
)
!5,75
7950 pH
Fig. 15 - Pl. oryzae (A) ; 85.z>itide (B) ; Cl. gZobosum (C) ;
Ml. verruearia (D) : croissance radiale (mm) en
fonction du pH ; PCA/25OC/3 j/obscurité.
- 87 -
- EH : deux valeurs de pH sont retenues ; l'une basse (3,O à 4,lO)et ï'au-
tre élevée (5,55 à 6,0).
La définition des paramètres expCri:mentaux parait Ctre liée à la
nature de l'équipement du laboratoire, ce qui est tout a fait logique ; mais
il nous faut dire que ce choix répond dans une certaine mesure aux exigence:;
des germes étudies ; de toute façon, nous ne pouvons retenir que des VALEURS
MOYENNES puisqu'une valeur spécifique tres favorable a un microorganisme donne
(pH de 3,50 pour Tg. uitidts) peut se montrer moins favorable pour un autre
(pH de 3,50 pour PJ. oryzae).
Ces précisions étant apportées, nous allons aborder le problème de
la mise en évidence du phénomène d'antagonisme dans les conditions expérimen-
tales préalablement définies.
II - EXPERIENCE DE MISE EN EVIDENCE DU PHENOMENIE D'ANTAGONISME in vitro :
CONFRONTATION SIMULTANEE (C.S.) DU PARASITIE AVEC LES GERMES "'ANTAGONISTES"
2.i. - Appréciation de l'inhibition (%) exe,rcee par les germes antagonis-
tes sur la croissance radiale (mm) de Pl. orgzae
-
-
-
-
Nous faisons appel a la méthode de confrontation simultanée (décri-
te dans l'annexe technique no 5 et usitée dans le criblage sélectif réalisé au
chapitre 1 de la présente partie) sous les conditions expérimentales définies ;
le tableau 24 matérialise les résultats observés après 5 et 7 jours d'incuba-
tion et pour deux valeurs de pH.
--
---.-..--.
- - -
_-_-_~
l*il,(LII,)-<l,.-.-.-l-.----.--^---.---
- 88 -
Age
(j9
----
5
Tableau 24 - Pl. oryzae : croissance (en mm9 et inhibition de la croissance
- -
(%9 radiale au cours d'une confrontation simultanée ; PCA/25"C/
obscurité continue.
2.1.1 - Caracteres descriptifs
2.1.1.1 - --_------------
Examen macroscopiqug (Planche no II 9
2.1.1.1.1. - Pl. orgzae x Fg. v-bide
- pH 3,50 : le développement de la colonie parasite est bloqué dès les
premières 48 heures en raison notamment du pH particulierement favorable au
Tgs viKde et peu favorable au PJ. orpae (cf comportement des germes vis-a-
vis du pH9 ; la zone proximale (par rapport au site d'inoculation de "l'antago-
niste") de la colonie parasite est souvent le siège d'une auréole en forme de
croissant de couleur brun jaunâtre à jaune et dont l'intensité va décroissant
jusqu'à s'annuler sur le côté distal de la colonie.
TA. vitide qui exerce principalement ici une action par contact par-
vient, dès le 7e jour, à englober la colonie parasite corwne pour "l'étouffer" ;
dès lors, le développement de Pl. oryzae est définitivement stoppé ; la colonie
du parasite envahie par "l'antagoniste" est également inapte à produire des or-
ganes de fructification.
--_-_--I___-
-_-_. ----.-.-
- --_-.- --,.
- 89 -
m. pH 5,59/: le phénomène est moins prononcé en raison du pH relativement
elevé qui "contrarie" la croissance de T5. uimk!e alors qu'il exerce sûrement
une action bénéfique sur PJ. oryzae ; ce qui impose donc au Tg. vitide un dglai
plus important pour bloquer le parasite ; ce dernier, exploitant ce sursis,
s'étale lateralement et du côte oppose au Tg. ~iz%zk.
J?emar*es : Dans les deux cas, nous observons que la pigmentation ("brun cara-
n1") est d'autant plus intense que la zone considérée de la colonie du parasi-
te est lplus soumise a l'effet inhibiteur de TA. viride.
De plus, une intense inhibition de la croissance radiale du parasite
se traduit par une croissance aérienne de celui-ci, lui conférant une épaisseur
croissante ainsi qu'une densité plus élevée a mesure que l'on se rapproche du
site d'inoculation de "l'antagoniste".
2.1.1.1.2 - Pl. oryzae x CI. ggloboswn
- pH 3,50 : en raison de la croissance rad,iale relativement faible de
CI ,. gldxwum, le contact entre les 2 colonies n)'est pas établi au 3e jour ;
pourtant, nous observons une très nette "régression" de la colonie parasite met-
tant en valeur l'intervention précoce d'une action à distance ; le contact est
bien établi au 7e jour ; nous remarquons que la zone de la colonie de Q. oryzae
contigu8 à l'antagoniste se caractérise par un très bon développement aérien,
témoignant de ce que cette zone subit une actioln inhibitrice plus intense que
celle exercée sur la zone distale. Il y a donc ici superposition d'une action
à distance et d'une action par contact.
'- pH 5 ,!55 : l'action (de Cl. gZobosm est ici très nette et la gravité de
1 'inhibition se manifeste {comme précédemment
; corrélativement à la densité
mycélienne du parasite, il se développe une pigmentation brune répartie dans la
zone épaisse en forme de woissant à la limite commune des 2 colonies.
2.1.1.1.3 - PI. oryzae x MI. verrucaria
a* pli 3 ,50 : la vitesse de croissance relativement élevée de PJ. oryzae
(par rapport à "l'antagoniste") lui permet de sle développer notamment du coté
distal et latéralement ; sa croissance n'est donc que partiellement limitée en
dépit d'une action à distance très nette dës les 3e et 4e jours.
Nous observons également le phénomeme d'épaississement dont nous
- 90 -
avons pr@cédemment fait état ainsi qu'une pigmentation (brun cendré) qui lui
est liée.
a- pH 5 ,!j5 : en dehors de la taille plus grande de la colonie parasite, nous
n'observons aucune différence particulière par rapport au pH 3,50 ; le cbté
dista'l de la colonie parasite semble nettement moins affecté par la présence de
Ml* verruca2-iia.
2.1.1.1.4 - Remarque
En aucun cas, nous n'avons remarqué une odeur particulier'? émanant
des milieux de confrontation.
2.1.1.2 - Examen microscoeigue (Planche no III)
--------w--m--- - - -
Pour tous les types de confrontation, nous avons, au 3e jour, réali-
sé des préparations microscopiques à partir des régions proximale et distale de
la co'lonie du parasite et les avons examinées par rapport au témoin.
2.1.1.2.1 - PJ. oryzae x T5. vitide
a- pH 3 ,!jO : lorsque nous examinons le mycélium parasite prélevé du coté
proximal par rapport à la colonie "antagoniste" (par souci de briéveté nous
l'appelerons "mycélium proximal" par opposition au "mycélium distal"), il se
montre contourné, pelotonne, épaissi, fortement branché et intensément colorable
par le bleu coton ; souvent, nous voyons apparaStre des morphoses rappelant un
"bala,i de sorcière".
Hormis l'épaississement observable sur certains filaments mycéliens,
tous les autres caractères se trouvent plus ou moins dilués au niveau du "my-
célium distal".
'-'< piH 5 1 55 : le "mycelium proximal" présente souvent un ensemble de filaments
fortement entrelacés longitudinalement ; nous trouvons parfois des cellules my-
céliennes isolées hypertrojphiées et situées sur le trajet mycélien à la manière
de chlamIydospores (remarquer qu'ici les cultures sont dgées de 3 jours) ; nous
observons ég,alement un épaississement mycélien,
de légères ramifications courtes
ains-i que des torsades et pelotes terminales.
- 91 -
Tous ces caractères semblent moins prononcés lorsque l'examen porte
sur le "mycélium distal".
2.I.I.2.2 - Pl. oryzae x cl. g Zoboswn
Le "mycélium proximal" issu des cultures à pH 3,510 est souvent
vrillé ou fortement torsade ; aucune déformation notable n'a été observée pour
le "mycelium distal" ou pour le mycélium obtenu à pH 5,55.
2.1.1.2.3. - PI. oryzae x Ml. verrucaria
lia seule observation positive porte sur le "mycélium proximal" issu
du pH 5,55 ; les filaments mycéliens sont vrillés deux à deux rappelant étran-
-
gement les 2 torons du DNA.
2.1.2 - Expression graphique des résultats (fig. 16 A et C) :
Interprétation
-
-
L'intensité de l'inhibition exercée sur le développement de la colo-
nie du parasite relève de 2 facteurs :
- L'effet d'inhibition relative ("relative inhibitory effect" ou RIE) étant
quantifié par la relation
Mi
= RIE = !kJ x 100
R
toute augmentation du rapport R - r élève le pourcentage d'inhibition correspon-
R
dant ; à mesure qu'augmente le délai d'incubation (passage de 5 à 7 jours), l'ac-
croissement de r s'amenuise voire s'annule du fait de la proximité du germe
"antagonjiste" ; à la limite, r devient constant puisque dans notre cas, le para-
site ne croît pas par-dessus la colonie antagon,iste ; parallelement, la croissan-
ce de R se poursuit même faiblement du côté distal ; la résultante de ces deux
phénomenes explique -partiellement du moins- l'accroissement de l'inhibition
lorsqu'on passe de 5 à 7 jours.
Dans le cas particulier du T5. uiride
à pH 3,50, nous observons une
RIE constante (55,8) du fait que le Trichodermç: enveloppe entièrement la colonie
parasite et empêche toute possibilité d'épanouissement.
- 92 -
- Le pH intervient fondamentalement ; ainsi, à pH 5,55, le Pl. oryzae se
trouvant relativement avantagé se développe rapidement, notamnent le long du
rayon distal ; parallèlement, le développement du cbté proximal de la colonie
du parasite se trouve limité par la présence de T5. virile, d'où l'augmentation
du pourcentage d'inhibition observée lorsqu'à 7' jours, nous passons de pH 3,50
(55,8 X) à pH 5,55 (73,7 X) ; il est évident que cet accroissement est forte-
ment influencé par le développement de la colonie parasite le long du rayon
distal.
Or, nous avons déjà établi que le 1'5. uitide se complait mieux à
pH bas (3,50) qu'à pH élevé (5,55) ; d'où lui viendrait donc cette subite capa-
cité d'inhiber plus intensément le parasite à pH élevé (5,55) qu'à pH bas (3,50)?
Le seul fait de poser la question pose le problème de la représen-
tativit@ de la relation
Mi
= RIE = Mo - M x 100
telle qu'elle a été jusqu'ici définie et utilisée.
D'un autre coté, lorsque le parasite est confronté avec l'un quel-
conque des germes antagonistes, nous avons observé que dans TOUS LES CAS, le
rayon de la colonie de Pl. oryzae opposé au site d'inoculation du germe antago-
niste était INFERIEUR à celui de Pl. oryzae sur "TEMOIN FRANC" ; cela signifie
que sur la bofte de confrontation, la colonie de PI. oryzae dans sa GLOBALITE
est PLUS ou MOINS affectée par le voisinage de l'antagoniste et qu'il serait
erroné de considérer le rayon distal de la colonie parasite (par rapport au
site d'inoculation de l'antagoniste) comme représentatif de la croissance norma-
le de P1. oryzae.
La c.roissance NORMALE doit être éva.luée sur la seule bofte de Petri
"TEMOIN FRANC".
De plus, en raison de la déformation de la colonie du parasite, le
phénomène sera certainement mieux apprécié sur la base de la colonie de
Pl. oxyzae confronté ou non ("TEMOIN FRANC") avec le ou les germes antagonistes.
Les surfaces sont évaluées au planimètre.
- 93 -
2.2 '- &wéciation de ll'lnhibition (%) exercée par les gens "antagonis-
u---
te~~'~~ur lis croissance en surface (cm2) de PI~ wwe
.I. II I ---_--
Le tableau 25 rëcapitule l'ensemble des résultats afférents a cette
etude.
2.,2.1 - Résultats
3,50
5,55
-.--
Signifi-
Mo et M
Signifi-
cation
(cm21
cation
--.-
4,63
s (U,, = 0)
46,9
3,94
s (U, = 10:
s (U, - 0)
17,4
4,78
NS
s (U, = 0)
15,1
5,58
NS
-
-
s (U, = 0)
4,29
s (U, = 0)
s tu,, = 0)
5,76
NS(U,=37,5;
s (U, = 0)
5,30
NS
-
-
9,58
s VJO = 0)
71,7
7906
s (U, = 0)
s (U, = 0)
20,6
8,14
S (U, = 6,5
NS
839
6,79
S
-
-
s tu,, = 0)
81,7
9,85
s (U, = 0)
s UJ,, = 0)
22,8
11,79
S
VS(Uo=26,5)
13,7
10,03
S
-
-
29,62
s (U, = 0)
85,8
13,25
s (U, = 0)
s UJ,, = 0)
28,l
15,89
S
s (U, = 0)
17,0
13,40
S
Tableau 25 - PJ, cîrgacte : inhibition (% par rapport au 'témoin franc") exercée par les
-w-----v
germes antagonistes sur la croissance en surface (cm2) pour 2 valeurs de
pli et en fonction du delai d'incubation ; PCA/25"/obscurité.
- 94 -
Remarpesl : - Chaque mesure de surface est une mloyenne calculee a partir de
mbortes de Petri.
-T= Sel x 0 désigne le “TEMOIN FRANC" et correspond au parasite
développés isolément.
2.2.2 - Expression numérique des résultats
Le pourcentage d'inhibition est évalué sur la base de la relation
Mi = Mo - M x 100
où
MO
MO = croissance mycélienne du parasite en surface (cm2) sur “TEMOIN FRANC"
M = croissance mycélienne du parasite en surface (cm2) sur bo9te de Petri
essai
Mi - pourcentage d'inhibition exercé par les germes "antagonistes" sur la crois-
sance du parasite.
Pour chaque pH, pour chaque délai d'incubation de chaque type de
confrontation, le pourcentage d'inhibition est calculé et consigné à la place
qui lui correspond dans le tableau 25.
2.2.3 - Signification
*
Le problème est de savoir si les pourcentages d'inhibition observés
nous autorisent à conclure a une action significative des germes "antagonistes"
sur le parasite ; en clair, nous devons voir si les différences observées entre
le développement du parasite seul ("TEMOIN FRANC")et celui du parasite confronté
à un "antagoniste" donné (ESSAI) ne sont pas duesaux seules fluctuations d'échan-
tillonnage.
Pour un pH (ex : 5,55) et un délai d'incubation (ex : 3 jours) donnés,
chaque valeur (ex : 3,94 cm2 pour la confrontati'on Sel x ITg. vitide) est compa-
rée au témoin qui lui correspond (en l'occurence 4,63 cm2) non pas sur la base
des moyennes mais des 10 composantes de chaque moyenne ; ainsi, pour juger du
degré de signification de 3,94 par rapport à 4,6.3, nous comparerons les 2 séries
statistiques :
- 95 -
x (,témoi II) -+ 4,1/5,0/4,8/~4,9/4,3/5,0/5,0/4,9/4,3/4,0
- x = 4,63
y (essai) -+ 3,9/3,9/3,5/4,1/4,4/3,4/4,0/3,9/4,4/3,9 - jJ = 3,94
Appliquant le Test U de MANN et WHITNEY à ces deux series statisti-
ques, nous trouvons :
U0 = 10 (valeur inférieure)
ddll = 10
La table nOUS donne Uo,o5 = 23 avec { ddl2 = 0
Nous avons bien U. < Uo,o5 -4 nous pouvons affirmer avec un ris-
que de 5 'Z que les deux séries x et y sont significativement différentes au
seuil de 5 % ; en d'autres termes, le pourcentage d'inhibition 14,9 % exprimé
sur la base des valeurs 4,63 et 3,94 traduit concretement une action significa-
-
-
-
ti ve de T,5. virile sur Pl. opgzae.
Il est évident, par ailleurs, que DE PAR LA STRUCTURE MEME DU TEST
utilisé, le fait d'avoir chacun des caractères de la série (y) inférieur à
chacun des caractères de la série (x) nous autorise d'emblée à conclure a une
différence significative entre les séries (x) et (y) puisque U. = 0 < Uo,05
qui vaut, soit 23 (pour un effectif de 10) soit 2 (pour un effectif de 5).
Dans cette expérience et celles qui suivent, nous exprimons la
différence significative par (S) et celle non significative par (NS) sur le ta-
bleau des résultats.
2.3 -- Expression graphique des résultats : discussion
2.3.1 - Analyse comparative des pourcentages d'inhibition relative
des croissances radiale et e!n surface de a. oryzae confronté durant 5 et 7
-11_--
-
-
jours aux-germes
"antagonistes" (cf fig. 16 :
-
diagrammes A-C et 8-D respecti-
vement)
- Cl. ghboswn et MI. vermtcatia : lorsque nous considérons le pourcentage
d'inhibition de Pl. oryzae calculé sur la base de la croissance radiale du pa-
rasite confronité avec les 'antagonistes" precédents (de m&ne que TA. vitide pour
le seul pH 5,515), nous attribuons de fait aux germes concernés un pouvoir inhi-
biteur supérieur a celui établi sur la base de croissance en surface du parasi-
te confronté avec ces mknes microorganismes ; ce qui serait absolument erroné
I *‘s-*CC.-.-*“...m
---m-
_~_.-----
__-_.-.-_----~~~~~--_~
-_~---
------
_-”
m.2
l
11.
-
M
A
-
,
II-A
D
31
Fig. 16 - Diagrammes comparatifs des pourcentages d'inhibition relative de la croissance radiale (mm ; cf A et C) et de Ia
croissance en surface (cm2 ; cf B et D) de PJ. oryzae confronté pendant 5 jours (A et B) et 7 jours (C et D) aux
T5. viride 0 ; Cl. gtoboswn m ; Ml. verruearia m et pour 2 pH/PCA/E"C/obscurité.
- 97 -
puis+:lti"a nos yeux la deuxième méthode reflète plus fidèlement le comportement
du oarasiite dans sa globalité (contrairement a l(a Premiere qui ne rend compte
du phénoml5ne que le long d'une dimension).
- Deux comportements se dessinent lorsque le parasite est confronté avec
T5. uitick
. pH bas (3,58) : le pourcentage d'inhibition exercée par l'antago-
niste est constant au-delà (d'un certain délai d'incubation lorsque l'evaluation
se ,fait sur la base de la croissance radiale (le pourcentage observe est ainsi
de 55,84 % aussi bien au bout de 5 que 7 jours d'incubation) ; par contre, le
pourcentage d'inhibition est CROISSANT avec le temps lorsque l'évaluation se
fai,t sur la base de la croissance en surface ET PAR RAPPORT à un "TEMOIN FRANC"
(le pourcentage observé varie de 71,88 à 85,80 % lorsque le délai d'incubation
passe de 5 à 7 jours).
Dans le premier cas, le 95. uitide favorisé par les conditions expé-
rimentales (pH notamnent, cf à ce propos les tableau 23 et fig. 15) parvient
très précocement à englober totalement la colonie du parasite dont les 2 dimen-
sions R s(= Mo) et r (= M) dseviennent fixes ; d'ou la constance du pourcentage
d'inhibition.
Dans le second cas, la surface de la colonie du parasite en boite
de Petri essai est constante comme précédemment a partir d'un certain délai
d'incuba,tion tandis que se poursuit le développement de la col
sur boite de Petri "TEMOIN FRANC" ; la différence Mo - M
Mo-M
--. - I ce qui explique que Mo - M x 100 augmente et à la limite tende
MO
MO
vers 100 % si la surface offerte au parasite était infinie.
Ce qui permet également d'expliquer que, pour un m&me delai d'incu-
bation (5 ou 7 jours), le pourcentage d'inhibition soit plus élevé dans le deu-
xième cas (croissance en cmf2) que dans le premier cas (croissance en mn).
. pH 5,55 : cette valeur peu Convena&ble pour T5. ur:tide est favora-
ble au parasite,qui se développe bien ' avant de subir l'action inhibitrice de
% viride ; à aucun moment donc, la croissance de la zone distale de la colonie
du parasite n'est définitivement bloquée, d'où l'augmentation moins prononcée du
pourcentage di'inhibition observé dans les deux cas lorsque nous passons de 5 à
7 jours d'incubation.
” sn-,*1IMI<I1-------I
-
--m
.__ -_.. -...
..-----
.
--____~,
- 98 -
2.3.2 - Evolution du pourcentaae d'inhibition de la croissance
en surface (cm2) de Pl. oxyzag exercée par les germes "antagonistes" en fonction
e-.--m-
du temps, PCA/25"/pour 2 valeurs de pH/obscurité continue
M - - e - -
L'expression graphique (fig. 17 et 18) des résultats figurant au
tableau 25 permet pour ce type de confrontation, de visualiser l'efficacité re-
Native des germes "antagonistes" ; T5. vitide manifeste une nette supériorité
sur les, autres germes à pH 3,50 notamment ; l'interprétation de ces courbes im-
pose que 1'~ tienne compte de 2 facteurs :
- d'une part, l'activité intrinseque du germe "antagoniste" à l'encontre
du parasite,
- d’autre part, le caractère plus ou moins favorable des conditions expéri-
mentales (substrat nutrifiif, pH, etc...) vis-à-vis des germes confrontés.
En réalité, ces 2 facteurs sont indissolublement liés tant il est
vrai que le comportement physiologique de l'un quelconque des 2 champignons est
dépendant des conditions expérimentales.
2.3.3 - Représentativitë de chacune des méthodes
L'appréciation du pourcentage d'inhibition du parasite par le germe
"antagoniste"
sur la base d'une évolution de la surface qui tient compte de l'é-
volution GLOBALE de la colonie du parasite nous paraIt plus valable que celle
fondëe sur l'évaluation de la croissance radiale.
C'est à la lumiere de ce CONSTAT que dans la suite de nos expérien-
ces, toute confrontation donnant lieu à une collonie du parasite déformee sous
quelque influence que ce soit, nous conduira a apprécier ladite influence sur
la base d'une mesure de surface ; l'évaluation fondée sur la croissance radiale
sera cependant retenue toutes les fois que la colonie mesurée croft de façon
réguliere.
2.4 - Remarques
- Repiquant sur PCA frais des disques inoculum prélevés à l'intérieur des
limites définissant la colonie de PI. oryzae âgée de 10 jours et englobée par
Tg. z'zk& à, pH 3,50, nous, observons le seul developpement de BS. vitide ; cela
Fig. 17 - Evolution du pourcentage d'inhibition de la croissance en
surface (cm2) de PJ. ozyzae par Tg. viride (A) ;
Cl. gtoboswn (B) ; Ml. verruearia (C) au cours d'une
confrontatiom simultanée et en fonction du temps ; PCA/
25"/pHo 3,50/obscurite,
Fig. 18 - Evolution du pourcentage d'inhibition de la croissance en
surface (cmz) de Pl. oryzae par TA. vitide (A) ; CI. gZoboszun
(B) ; MI. verruearia (C) au cours d'une confrontation simulta-
née et en fonction du temps ;; PCA/25"C/pHo 5,55/obscurité.
- 101 -
signifie qu'à pH 3,50, le parasite a été très précocement bloqué et envahi par
Tg. virile tiotilt :a vitesse de croissance, la précocité et Y'intensite de coni-
dîogen&se sont peu ou pas m'odifiées par le vo,isinage parasite 1) T5. virile
exerce en retour une action radicale sur.&. oryzae.
.I
A ce même pH 3,50, l'inoculum suppose de FI~ i>2?2""! se développe
--.
normalement s'il est issu d'une confrontation avec .V2. v~~rtl~a~4a cependant que,
dans le cas de L 5+ gk&osza on voit se developper une colonie dont un secteur
correspond au parasite et un autre au cI. globosum.
- A pH 5,55, l'inoculum engendre un développement normal de ?:#. o~yzae
sauf dans le cas d'une confrontation avec ~2. gl&ostGr: ot2 nous observons une
évolution sectorielle comme à pH 3,50.
- Evaluation de l'intensité de la conidiogénese de FI. cjrgzae confronté
simultanément avec les germes "antagonistes".
Nous prélevons 7 disques inoculum de daamètre standard (6 mm) que
nous introduisons dans 4 ml d'eau distillee sterile ; nous ajoutons une quinzai-
ne de billes de verre et agitons vigoureusement ; l'appréciation de l'intensité
de ?a conidiogénèse se fait à 1'hématJmetre de MALASSEZ tant du côté proximal de
la colonie de PIa opyzae que du côté dlsta 1 par rapport à la colonie "antago-
niste".
Chaque valeur du tableau 26 ch iffrant les récultatst observés est
une moyenne de 3 mesures.
----_-
_-----_
._I.
---“-3^--.-.
.---
. - - _
-.-111
---
Souches croisé
avec Pl.
. verrucaria
oryzae
-.---------
Tableau 26 - PJ. o~yzae
~
: intensité de la conidiogenèse au cours d'une confrontation
simultanée avec les germes "antagonistes" ; PCA/25"/16 jours/obscurité
continue.
- 102 -
L'absence de conidies de PI. oqrzae englobe par T5. vitide a
pH 3,50 traduit la destruction précoce du parasiite ou la perte definitive de
sa capacité de se reproduire apr& invasion par le germe "antagoniste".
- 103 -
CHAPITRE TROISIEME
ESSAI D'INTERPRETATION DU PHENOMENE
D'ANTAGONISME
in vitro
I- REMARQUE PRELIMINAIRE
A la lumière des expériences de base, nous avons établi une RESTRIC-
TION imposée a la croissance du parasite par les germes que désormais, nous appe-
lerons ANTAGONISTES (suppression des guillemets) puisque s'opposant 3 la crois-
sance du parasite ; les observations réalisées nous permettent a priori, d'affir-
mer que l'inhibition exercée par les germes antagonistes implique au moins deux
mécanismes :
- une action à distance intervenant très pri-cocement dans le cas de condi-
--
tions expérimentales favorables au MI. verrucatitz ou au Cl. gZobosum et qui serait
due à la production par les germes pr&cités, de substances tr& diffusibles pou-
vant migrer depuis leur site de production pour aller agir à distance sur la co-
lonie du parasite avant m&ne que le contact ne soit établi entre les 2 inoculats,
- une action par contact due a une barrière physique édifice par deux germes
-
-
dont les mycelia ne sont pas miscibles ; ce type d'action qui prédomine chez
-4
TA. viride s'expliquerait partiellement aussi par la production de composes inhi-
biteurs peu ou pas diffusibles, ne se manifestant donc que tr& tardivement,
- enfin, une action régie par la conjugaison des 2 modes d'actions précé-
dents ; les substances produites ayant chacune ses caract&es et son pouvoir
"migrateur" propres.
- 104 -
Dans ce qui suit, nous nous proposons d'établir l'existence de tel-
les substances sur la base d'expériences réalisées en milieux solide et liquide.
II - CONFRONTATION DU PARASITE ET DES GERMES ANTAGONISTES SUR MILIEU SOLIDE
-
-
2.1 - Confrontation différée du parasite avec les germes antagonistes
Le principe repose sur le fait que l'inhibition exercée par les ger-
mes antagonistes est régie par la production de facteurs inhibiteurs de la crois-
sance du parasite ; ainsi, lorsque le germe antagoniste se développe sur un
substrat nutritif gélosé préalablement tapissé d'une feuille de cellophane (cf
annexe technique no 5), lesdits facteurs sont sensés diffuser à travers cette
paroi "selective" et migrer dans le milieu nutritif ; l'élimination de la feuille
de cellophane ainsi que celle de la colonie antagoniste après 48 heures d'incuba-
tion et l'inoculation immédiate du parasite permet de révéler, par mesure de la
croissance radiale mycélienne du parasite, l'implication ou la non implication
de facteurs inhibiteurs vis-à-vis du parasite et ce, par rapport à un témoin.
Dans cette expérience, les inoculats sont issus de cultures sur PCA
âgées de 3 à 4 jours/25"C/obscurité continue ; les 2 valeurs de pH sont de 3,65
e
t
6,20.
2.1.1 - Résultats
--
Traitements T = Sel x C
T5’ viride
7
-4pH 3,65F 6,20
Age (j)
-
-
3
20,5 20,2
4
1 27,9 / 27,6
22,9 (s) /24,3 (S)I 14,8 (S) 1 2038 6)
a,9 (s)
30,7
(s) 21,5 (S)
2734 (S)
6
1 41,J ( 40,3
36,7 (S)
37,l (NS) 26,7 (S)
3397 (S)
44,o (s) 144,8 (M)I 33,6 (S) 1 4196 6)
Précocité
4e et
4e et
conidiogénèse
5e j
5e j
Tableau 27 - ~II. o.ryzae : croissance radiale (mm) au terme d'une confrontation dif-
férée avec les germas antagonistes ; PCA/25"C/obscurité continue ;
moyennes établies à partir de 5 boftes de Petri.
- 105 -
La signification relative de ces résultats est matérialisée par
(S) ou (MS) conformément à la convention établie ; afin de ne pas surcharger ce
tableau, nous avons volontairement omis d'inscrire chacune des valeurs de U ob-
servée et comparée à U,,,5 : 2.
??
2.1.2 - Observations
2.1.2.1 - E:xamen macroscopique :: (Planche no IV)
-*------------s- - -m
Après élimination de la cellophane et de la colonie antagoniste,
nous observons que le substrat est coloré en fonction du germe antagoniste et
du pH ; ainsi :
- le substrat est teinté en brun rbsatre pdle à ocre jaune sur PCA (a pH
6,20 notamment) pour Tg. viride,
- Cl. globoswn engendre une teinte jaunâtre à pH 3,65 et d'un blanc crémeux
à pH 6,20,
- Ml. uermtcar2a laisse une teinte d'un blanc cendré plus ou moins verddtre
pour les deux valeurs de pH.
En dehors des différences de vitesses, de croissance des colonies du
parasite en fonction de la nature du "précédent" nous n'observons aucun carac-
tère particulier concernant la colonie de PJ. oryzae.
2.1.2.2 - Examen microscopique (apres 6 jours d'incubation)
--------------- - --
(Planche no V)
- PI” ozyzae x Tg. viKde : à pH bas, nous observons un épaississement my-
célien ainsi que des filaments mycéliens fortement entrelacés donnant par en-
droit des "pelotes isolées" formées par l'enchevétrement plus ou moins globo'lde
du filapnent.
- PJ" oryzae x Cl. globoswn : certains filaments mycéliens sont fortement
épaissis :; d'autres le sont Imoins mais sont soit agglomérés longitudinalement,
soit contournés.
- PJ. oryzae x MI. vermcaria
: filaments mycéliens fortement entrelacés
longitudinalement ou contourmés sur eux-m&nes ; parfois, nous observons des
cellules m,ycéliennes fortement épaissies se désarticulant facilement et inten-
sément colorables par le bleu coton ; nous avons enfin observe des torsades.
2.1.3 - Expression numérique des resultats
Sur la base du tableau 27, nous avons évalué les pourcentages d'inhi-
bition correspondants exercés par les germes antagonistes sur le parasite en
fonction du temps et par rapport au témoin ; les rkultats sont consign& dans
le tableau 28.
Traitements
Tableau 28 - PI. oryzae : pourcentage d'inhibition exercee par les germes anta-
gonistes au cours d'une confrontation diffetie, par rapport au
témoin et en fonction du délai d'incubation ; PCA/25"/obscurité
continue.
2.1.& Expression graphique : discussion
Il nous faut préciser que la compréhension de ces rkultats exige
que nous tenions compte de la nature du substrat nutritif : le production d'an-
tibiotiques serait plus importante sur milieu riche que sur milieu pauvre
(WRIGHT, 1952) ; de plus, il y aurait une correlation entre action restrictive
des antibiotiques et competition trophique ; cela signifierait qu'une inhibition
partielle de la croissance du parasite serait imputable a un épuisement de nu-
triments du milieu ; il semble que l'implication d'une compétition trophique
soit peu probable en raison d'abord de la richesse relative du milieu (PCA),
ensuite des périodes d'incubation relativement courtes (48 heures) du germe an-
- 107 -
tagoniste. Cette hypothèse serait à fortiori à écarter quand on sait que la
stimulation de la croissance du parasite a été observée dans certains cas.
L'inhibition de la croissance du parasite serait donc le fait des
seuls facteurs diffusibles produits par les antagonistes et ayant migré au tra-
vers de la "paroi sélective" qu'est la feuille de cellophane (facteurs de crois-
sance dans le cas d'une stimulation).
Cela dit, nous allons tenter d'interpréter le tableau 28 et les
courbes (fig. 19) matérialisant les résultats établis expérimentalement :
Dans tous les cas, nous observons une décroissance du pourcentage
d'inhibition en fonction du temps ; cela signifie que le parasite, fortement blo-
qué au diipart finit avec le temps par acquérir une croissance meilleure, quasi
normale :; la différence de croissance observée par rapport au tismoin relevant à
la limite du seul retard de croissance imposé par les facteurs antagonistes dif-
fusibles impregnant le substrat trophique.
Nous pensons que cette réduction du pourcentage d'inhibition est en
relation avec le délai d'incubation (48 heures) du germe antagoniste : les fac-
teurs diffusibles produits par les germes antagonistes au bout Ide 48 heures
n'imprégnant le substrat nutritif que dans une aire définie et ,fonction de la
vitesse de migration propre aux substances impliquées à condition par ailleurs,
que chacun de ces facteurs soit doté d'une stabilité satisfaisante ; autrement
dit, des délais d'incubation progressivement plus importants des germes antago-
nistes auraient probablement eu pour corollaire, une répartition plus importante
des facteurs diffusibles sur le milieu nutritif et partant, aur'aient engendré
une décroissance moins prononcée du pourcentage d'inhibition de la croissance
du parasite :
MI. verrucar4a manifeste une très nette supériorite sur les autres
germes ; ce germe qui nous est apparu secondaire (probablement en raison de sa
vitesse (de croissance faible) au cours d'une confrontation simultanée, se révè-
le ici des plus efficace et partant serait celui qui produit la ou les substan-
ces les plus actives contre le parasite qui nous préoccupe ; à moins toutefois
que les facteurs diffusibles engendrés par Ml. verrmcatia ne soient relativement
plus stables (donc plus viables) que ceux liés à T5. triride ou cz. ~ZO~OSUVI.
f/
I
+----
/<-.
4
3
4
5
6
7
J*
Fig. 19 - Evolution du pourcentage d'inhibition exercée
par TA. uiti&. (1 et 4) ; C . globosm (2 et
5) ; MI. verrucaria (3 et 63 au cours d'une
confrontation différée par rapport au témoin
et eh fonction du temps ; PCA/25"C/obscuritë.
- 3,65 pour (1) i2)-et (3) ; PH, = 6,20
p!:,-(4), (5) et (6j..
- 109 -
2.2 - @njugaison des confrontations simultanée et différée (CS x CD) du
parasite avec les germes antagonistes (Planches no VI et VII)
A la lumière des expériences précédenwnent rapportées, nous nous
proposons d'étudier le cas d'une association entre les 2 techniques de confron-
tations ; ainsi Pl. oryzae est confronté en différé à Ml. vermcaria et en Si-
multané a CI. gZob0sm et/ou T5. viride (cf annexe technique no 5) ; l'apprécia-
tion des résultats se fait par rapport à 2 témoins, l'un (Tl) correspond au dé-
veloppement de PJ. oryzae seul ; l'autre (T2) représente le développement de
PI- oryzae en différé avec Ml. verrucaria.
2.2.1 - Résultats
-
Tl=SelxO='FRANC"
T2=(3)XSel (3)X[Selx(l.)] (3)X[Selx(Z),
-
-
4,101
6,0
4,lO
6,0
4,lO
6,O
4,lO
6,0
-
-
-
-
2,lO
2,14 0,O 0,O 0,O
0,o
0,o
0,o
090 1 090 1
- - -
m-
3,38
3,44
0,O
0,64
0,O
0,o
0,o
0,6O
5,32
5,46
0,54
1,42
0,O
0,o
0,o
0,90
- -
7,44
7,82
1,06 2,44
0,O
0,78
0,2
1,06
090 0,76
- - -
- -
10,413
10,62
1,45
3,76
0,O
1,58
0,21
1,lO -4-i
0 ,o
0,94
- -
Tableau 29 - Pl. oryzae
-
: croissance en surface (cm') au cours de la conjugaison des
confrontations différée (=X) [par rapport à Ml. verruearia (3)] et si-
multanée (=x) bar rapport à Ta. viride (l,> et/ou Cl. g2oboswn (Z)] ;
PCA/25"C/obscurité continue.
Chacune de ces valeurs moyennes est calculée sur la base de 5 boites
de Petri.
L'expression numérique des résultats, ayant été faite par rapport à
T1 et par rapport à T2, la signification statistique des résultats ci-dessus
est rattachée aux tableaux 30 et 31.
- 110 -
2.2.2 - Expression numérique des résultats
292.2.1 - Relativement au témoin : TI = Pl. oryzae x 0
--.--------------------
.----
1
I
Trai,tements
1 (3)A[SeIx(l)] 1 (3)X[Seix(2)1 ) W3elxW(2)1 I
4,lO
6,O
4,lO
6,O
4,lO
630
1 0 0 ,O
100,o
100 ,o
100 ,o
1 0 0 ,o
100 ,o
1 0 0 ,o
100 ,o
100 ,o
82,5
1 0 0 ,o
86 ,o
-
-
-
-
1 0 0 ,o
100 ,o
100 ,o
83,5
1 0 0 ,o
88,6
1 0 0 ,o
90 ,o
97,3
86,4
1 0 0 ,o
90,3
--SP
1 0 0 ,o
85,l
98,0
89,6
1 0 0 ,o
91,l
Tableau 30 - 1'1. oryzae
I-
: éyolution du pourcentage d'inhibition de la croissance
en surface (cmd-) par les germes antagonistes au cours d'une conju-
gaison des confrontations différée (=X) [par rapport à Ml. verruearia
(3)] et simultanée (=x) [par rapport à 95. uiz&& (1) et/ou
Cl. gZoboswn (2)] et par rapport au temoin T1 (PJ. oryzae X 0) ;
PCA/25'/obscurité continue.
Toutes les valeurs de U, calculées d'après le test U de MANN et
WITHNEY sont nulles ; Uo,05 étant égale à 2 --, toutes les différences observées
par rapport à TI sont significatives et traduisent une action significative des
germes antagonistes dans ce type de confrontation.
- Relativement à T2 = !Sel X (31
2.2-2-2.
- - - - - - - - - - - -
- - - m
---<_-
---
(3)0 :1x(2)1
1 (3N%x(W)J
4,lO
630 l 4Jo / 6yo
-
I
-
I
-
-
632 (NS) 1
-
1258 (NS)
I
5
~lOO,O (:S)I 100,O (SI 100,O (5) 36,6 ( S ) 1100,O (S) 156,3 ( S)
81,l (!G 56,5 ( S ) IlOO,o (s) 168~4 ( s)
85,5 (Ij) 70,7 ( S) IlOO,O (S) 175,O ( S)
Tableau 31 - Z'1. oryzae : Evolution du pourcentage d'inhibition de la croissance
en surface (cm') par les germes antagonistes au cours d'une conju-
gaison de confrontations différée (:=A) [par rapport à Ml. verruearia
(1311 et simultanée (=x) 1 par rapport à T5. uitick (1) et/ou
C?l. gZoboswn (2)] et relativement au témoin T2 [PJ. oryzae A (3)] ;
PCA/25'/obscurité continue.
-
---_------..-
“wmrm9111,~-“IIIIL1--3-
- 111 -
T-=: - Les cases matérialisées par des tirets (-) correspondent a des
va eurs indéterminées puisque ni T2 ni l'essai ne se développent ; ce qui donne
le rapport i .
- Seuls deux pourcentages d'inhibition ne correspondent pas a des
valeurs significativement différentes ; le pourcentage de 6,2 % correspond à un
= 9,5 et celui 25,0 à*= 9 ; d'où la non siglnificatio- se rattache à
UO
cesGIëüX valeurs.
- Partout ailleurs, U. = 0.
2.2.3 - Expression graphique (fig. 20) : discussion
2.2.3.1 - Par rapport à il
--e--m -w-----
Les diagrammes A, B et C comparés au témoin T1 révèlent l'action
globale des germes antagonistes ; cette action est plus vigoureuse à pH 4,lO
qu'à 6,0.
Relativement à pH 4,10, le diagramme (A) montre qu'aucune croissan-
ce du parasite n'est perceptible pendant toute la durée de l'expérience (100 %
d'inhibition)
; cela tient à la conjugaison de deux facteurs :
- une action retardatrice de la croissance du parasite exercée par les subs-
tances inhibitrices Produite:s par Ml. verruearia,
- une action régie par TA. viride qui, agissant avant démarrage de la crois-
sance du parasite intervient très précocement (en raison de sa vitesse de crois-
sance notamment) pour annihiler complètement toute velléité de développement de
la colonie du parasite.
Ceci est à fortiori valable dans le cas du diagramme (C) puisqu'à
celle de Z'(5. viride, semble s'ajouter l'action de Cl. gLoboswn ; ce diagramme
comparé à (A) et (9) révèle une action de Cl. gZoboswn plus faible que celle de
3. vitick intervenant seul (A) ou en association simultanée avec Cl. glubosm
w.
En toute rigueur, nous devrions parler de l'action exercée sur
PI. oryzas par la RESULTANTE des interactions de tous les germes associés (aussi
bien en différé qu'en simultané) y compris le parasite.
F
Fig. 20 - F. oryzae : Inhibition (%) de la croissance en surface (cm2) par les
germes antagonistes intervenant en confrontations différée (=X) bar
rapport à MI. verrucaria (3)] et simultanée (=x) [par rapport à
15. v7:ride (1) et/ou Cl. globosum (Z)] ;
A et D = (3) X pl.o~yaae x (111
A, B, C exprimés par rapport au
témoin Franc Tl = Sel X0
D, E, F exprimés par rapport au
témoin T2 = Sel X (3)
-.
-4 ~HO = 4,lO.
I-------I pH0 = 6,0
- 113 -
2.2.3.2 - Par raeeort a T2
----Mm --m--w-
- En raison des valeurs indéterminées du pourcentage d'inhibition en-
deça d'un certain délai d'incubation (4 et 5 jours pour pH 6,0 et pH 4,lO res-
pectivement), nous n'avons pu figurer les points correspondants aux abscisses
3 et 4 jours sur les diagromnes D, E et F.
- L'inhibition constante de 100 % observée en (D) et (F) pour pH 4,lO té-
moigne de la supériorité de l'action conjuguée des germes correspondants sur
l'action isolée exercée par MI. uermtccwk en T;! sur le parasite : & dernier
poussant en T2 alors qu'il demeure bloqué a 100 % dans les cas précités.
Quant Zi la chute de pourcentage d'inhibition manifestée en (E) pour
le pH 4,l.O en présence de Cl. gtoboswn , nous pensons qu'elle traduit soit un
phénomène d'accoutumance du parasite, soit plus probablement, qu'au-dela d'un
certain délai d'incubation, la synergie préalablement établie s'estompe en rai-
son du caractère relativement fugace des métabollites propres a MI. verruearia ;
CI. globmum,, agissant alors seul, devient relativement moins efficace ; cette
hypothèse nous para'it la plus probable puisque déja nous avons observé une telle
tendance sur le diagramme B.
- pH 6,D : le diagramme (D) montre une décroissance du pouvoir inhibiteur
des germes antagonistes associés ; mieux que nulle autre, cette observation
prouve encore une fois la supériorité de Ml. verruearia sur les autres pour ce
type de confrontation : au 5e jour, l'action des métabolites caractéristiques de
MI. verruearia s'estompant, Tg. viride ne parvient pas à maintenir l'action an-
tagoniste au seuil de 100 X.
Par contre, les diagrammes (E) et (f-) correspondent a un pouvoir
inhibiteur initialement faible mais qui va croissant ; cela tient à plusieurs
éléments :
. d'abord du fait que Pl. oryzae possède ici une croissance plus vi-
goureuse qu'à pH 4,10,
. ensuite en raison du pH élevé qui exclut pratiquement toute inter-
vention efficace de T5. virile,
I enfin, nous observons que la conjugaison de tous ces facteurs par-
vient à dmposer une restriction de la croissance du parasite.
- 114 -
Remarqu- : la comparaison Ides diagrammes établis par rapport a T1 et ceux éta-
blis par rapport a T2 devrait nous permettre d'apprécier l'action conjuguée
des germes Cl. gtobosm et Tu. uiride au cours d'une confrontation simultanée ;
nous aborderons ce problème par le biais de l'action du tilange des filtrats
de culture des germes antagonistes sur le parasite en milieu gélosé ; encore
qu'on puisse nous objecter qu'intervient ici non pas la somme arithmétique des
actions des germes antagonistes mais l'action résultant des germes prkités
agissant en conjonction avec Ml. verrucaria.
2.3 - Essai de mise en évidence de la production d'antibiotiques en milieu
:liquide
croissance radia'le (mm) mycélienne du parasite confronté au filtrat
ou mélange de filtrats de cultures liquides des germes antagonistes
Le principe consiste pour chaque pH à confronter, en milieu solide,
le parasite avec le filtrat brut ou autoclave et au mélange de filtrats de cul-
tures des germes antagonistes ; la méthode est décrite dans l'annexe technique
no 5.
Les cultures liquides des germes antagonistes sont ptialablement in-
cubées à. 25"/obscurité continue pendant 13 jours sur PC tamponné à pH 3,65 et
5,90.
Les cultures sont alors préfiltrées et filMes stérilement avant
de servir aux diverses préparations.
La croissance radiale (mm)du parasite est évaluée en fonction du
temps à 25"/PCA tamponné à pH 3,65 et 5,90 au bout de 4, 6 et 10 jours à l'obs-
curité continue.
2.3.1 - Résultats
Tableaux 32 et 33.
1,
i
IC
I
a.
I-+z--
-
115
-
- 116 -
Traitements
Zéro = T
(l)+(2)
(W(3)
(W3)
(l)+W+W
PHO
cuit. antagon. 3,65
5,90
3,65
5,90
3,65
5,90
3,65
5,90
3,65
5,90
4,lO
6,0
4,lO
6,0
4,lO
6,0
4,lO
6,O
4,lO
6,0
I-- 4
27,8
28,4
2Q,O
25,2
20,o
25,5
20,O
23-,8
20,8
25,0
- - 6 -
48,6
48,8
39,O
44,8
38,4
45,0
38,6
43,4
39,O
43,6
-- 10
-
71,2
70,6
60,O
68,4
58,8
69,0
59,O
65',0 , 60,O
66,l
Iableau 33 - 131. oryzae : croissance radiale (mm) au cours d'une confrontation avec
Te melange (volume iti volume) des filtrats de culture autoclaves des
germes antagonistes préalablement incubés sur milieu liquide a 25°C
pendant 13 j/pH 3,6!5 et 5,90/obscurité continue : (1) =: T5. virile ;
(2) = c . gZoboswn ; (3) = Ml. uermcatia.
L e subs Irat de confrontation est le PCA ajusté a pH 4,lQ et 6,0 et placé
2i 25'C/obscurité continue.
Chaque valeur est urne moyenne établie a partir de 5 boStes de Petri.
2.3.2 - Discussion
- L'examen direct des résultats ne révèle à priori aucune différence mani-
feste au cours de l'action Ides filtrats de culture simples par rapport au té-
moin ; nous n'avons pas, pour cette raison, jugé utile d'évaluer les pourcenta-
ges d'inhibition et la signification correspondants.
Cependant, étant donné l'action tres nette précédemment établie des
germes antagonistes sur le parasite (CS ; CD ; CD A CS) nous nous posons la ques-
tion de l'adéquation de la technique utilisée pour le type de matériel biologi-
que dont nous sommes partis ; expérimentant en milieu solide, nous ne pouvions
déposer qu'un volume limité de filtrats de cultures antagonistes dans la cavité
aknagée au milieu du substrat de confrontation ; ce volume étant fiixé de maniè-
re à ce que le disque inoculum du parasite, une fois déposé dans cette cavité,
le liquide préalablement introduit ne déborde que très lég&ement de son site,
d'où un Iretard de croissance très bref ou nul qui explique que des différences
notables ne soient pas observables par rapport au témoin.
- Quant aux mélanges de filtrats autoclavés (mélange après autoclavage),
ilssemblent induire une inhibition appréciable mais leur action est difficile
- 117 -
a interpréter ; nous ignorons en effet tout des 'actions et interactions pouvant
exister entre les composantes d'un type de filtrat et à fortiori du mélange
de filtrats.
Outre l'action inhibitrice qui devrait se manifester dans les fil-
trats de cultures,nous devrions, pour la compréhension du phénomc?ne, tenir
compte des modifications,notamment de pH, imposées au milieu par les germes ino-
culés : nous avons déteminis les pH apri% 13 jours d'incubation dans les condi-
tions expérimentales et avons observé une notable évolution (cf tableau 34).
pH0 = 3,65
Gt?lTlleS
antagonistes
4,20
Zéro = T
6,20
T5* viride
3,80
Cl. gtoboswn
6,50
Ml- vermcar&z
Tableau 34 - Devenir des pH initiaux du milieu de culture (PC) inoculé par
% viride , Cl, globoswn, Ml. verrucatia et incubé 13 jours à
25"/obscurité continue.
Le faible taux d'inhibition apparaissant sur le tableau 32 relève-
rait donc simultanément du pH0 et de la nature qualitative et quantitative
(concentration) des produits dérivés du métabolisme des germes concernés.
Dans l'expérience qu'à présent nous envisageons, nous allons inocu-
ler directement le parasite sur le filtrat ou mélange de filtrats de cultures
liquides des germes antagonistes.
I I I - CONFRONTATION DU PARASITE ET DES GERMES ANTAGONISTES SUR MILIEU LIQUIDE :
- -
croissance pondérale (Img) du parasite incubé sur filtrat ou mélange de
filtrats de cultures des germes antagonistes
Par l'expérience précédente, nous voulions expliquer le mode d'ac-
- 118 -
tion des antagonistes par la production de principes actifs inhibiteurs de
?* ozyzae et juger de l'efficacité relative des différents traitements ; au
vu des résultats, la technique ne nous a pas palrue adéquate ; nous allons tenter
dans le m&ne esprit, d'aborder le m&ne problème par une autre voie.
L'idéal aurait probablement été de réaliser une culture liquide si-
multanée des germes à confronter par l'usage d'un système d'erlenmeyer jumelés
communiquant par une tubulure latérale comportant une paroi sélective perméable
aux seuls métabolites produits par l'un quelconque des microorganismes (cf
annexe t#echnique no 6) ; en raison de contraintes matérielles, nous avons réali-
sé la culture du parasite sur le filtrat ou mélange de filtrats de cultures des
germes aintagonistes (méthode décrite dans l'annexe technique no 6) ; afin de dé-
terminer l'age optimum des cultures antagonistes induisant l'jnhibjtion maximum,
nous avons expérimenté à partir de filtrats de cultures àgëes de 5, 9 et 29 jours.
Le tableau 35 <rend compte des résultats observés.
3 * 1, - Résultats
~4,lO
6,0
4,lO
6,0
42,000
30,300
43,300
14,366
40,400
21,600
Tableau 35 - Pj. oryzae
--
: croissance mycélienne pondérale (mg) en fonction de
1 age et du type de filtrat ou mélange de filtrats de culturesli-
quidesde Tg. z;~itide (l), cl. ~ZO~OS~ (2) et MI. vexwzark (3) ;
les cultures antagonistes sont dgees de 5, 9 et 29 jours, â 25Y/
obscurité continue ; le milieu de culture est le PC dont le pH0
après autoclavage est de 4,lO et 6:,0 ; PI. oryzae inocule sur les
diverses prepairations est incubé 10 jours â 25"fJobscurité continue.
- 119 -
Chaque valeur de ce tableau est une moyenne établie à partir de
3 erlenmeyer renfermant chauzun environ 30 ml de préparation (mélange volume à
volume).
3.2 - Expression numérique des résultats
Age (ii)
Cult. liq. antago.
Traitements
- - -
Tableau 36 - Pl. oryzae
-
: pourcentage d'inhibition de la croissance mycélienne
pondérale en fonction de l'âge et du type de filtrat ou *lange de
filtrats de cultures liquides de Tg. uitide (l), Cl. gi!obosm (2)
et Mi. Vermca.ria ( 3) .
Les caractéristiques et valeurs ayant servi à la confection des pré-
sents résultats, sont consi'gnés dans le tableau 35.
3 . 3 - Expression graphique (fig. 21 et 22) : discussion
3.3.1 - Relativement au pHqo 4,lO : (fig. 21)
- De façon générale, les préparations issues de cultures antagonis-
tes âgées de 9 jours manifestent une remarquable inhibition (supérieure à 60 %
quel que soit le traitement) ; cet dge correspond donc dans notre expérience,
à 1" optimum pour lequel les germes antagonistes ont élaboré et rejeté dans le
Légende des fig. 21 (pH, = 4,lO) et 22 (pHo = 6,OJ
Pyricu Zaria orpae : pourcentage d'inhibition de la croissance ponde-
rale en fonction de 1 ',age et du type de filtrat ou mélange de
filtrats de cultures liquides de T5. uitide (1) ; CI* g2obosu.m
(2) ; Ml. vermtcatia (13).
cl
. . .
El
.
. . .
(2)
(3)
Fig. 21 - P . oryzau : pourcentage d'inhibition de la croissance
pondérale
(mg
en fonction de l'âge et du t pe de
i
filtrat ou mé ange de filtrats de cultures Y iquides
de T,+ v7~r7Xe ( 1 ) j Cl. g Iobosm ( 2 ) ; Ml y vermcaricl ;
pH0 = 4,lO ; cf legende ci-contre.
Fig. 22 - P. oryzae : Pourcentage d'inhibition de la croissance
pondérale (mg) en fonction de l'âge et du type de filtrat
ou mélange de filtrats de cul tuires liquides de T5. uiride
(1) ; Cl. gZoboswn (2) ; MI. uerrucaria (3) ; pHo = 6,0.
Prière de se reporter à la légende de la figure 21.
- 122 -
milieu des produits qui, qualitativement et quantitativement,i'rrduisent le maxi-
mum de restriction de la croissance du parasite.,
Ici également, Ml. verrucatia manifeste sa supériorité par rapport
à tous les autres traitements.
- A l'dge de 5 jours, nous observons une action faible mais positive
des germes intervenant isolément ; cependant, une légère synergie se manifeste
lorsque nous opérons avec le mélange T5. tiride + cl. gZoboswn ; par contre,
une baisse notable d'efficaicité se révèle dans tous les mélanges impliquant
Ml- ve rrucatia ; nous pensons expliquer cette neutralisation mutuelle du pouvoir
-
inhibiteur de substances individuellement actives (phénomène d'antagonisme en-
tre les produits considérés) soit par la formatlon de complexe inactif constitué
au terme des interactions des produits mélangés!, soit par une altération partiel-
le résultant de cette coexistance, soit à la limite, par l'app'alrition de nou-
veaux composés métabolisables par le parasite ; de là l'effet bénéfique concré-
tisé par une stimulation de! la croissance du parasite : c'est 'ce que nous obser-
vons dans le cas du traitement (1)+(32 incluant Tge virile et Ml, verruearia
(taux d'inhibition de -31,91 %).
- Quant aux tralitements issus de cultures âgées de 29 jours, nous
.observons une action encore "spectaculaire" de 11~. viti&: (74,1. % d'inhibition)
par rapport aux autres ; cette "remanence" seraït probablement à lier soit au
vieillissement très différe des cultures liquides du T~-Ghuü!efi~~a, soit à une
relative stabilité des substances inhibitrices propres à ce germe ; à moins que
n'intervienne la superposition des deux phénomenes.
Les activités de Ml. verruearia (52,2 %) et du mélange Tg. v&zIde +
Cl. gZ,oboswn (47,l %) demeurent encore très satlsfaisantes tandis que celles
de Cl. ghboswn (-33,3 %) et des melanges 2 à 2 faisant intervenir MI# vermcaria
semblent complètement perdues puisque les préparations correspendantes stimulent
la croissance du parasite.
3.3.2 - Relativement au pH, 6,0
- Pris isolément, les germes antagonistes montrent 2 types de com-
portements :
. le type T5. viride ou CI. globosum dont l'activité, bonne à 5 jours, pré-
- 123 -
sente un optimum à 9 jours pour ensuite decroftre,
. le type Ml. verruearia qui ptisente un maximum d'inhibition pour
29 jours.
- L'association TA. viri& + Cl. gZo2josum induit une inhibition
équivalent a priori a la resultante des actions isolées des composantes Sgées
soit de 5, soit de 9 jours 1, par contre, a 29 jours, cette association détermi-
ne une chute du pouvoir inhiibiteur voire une stimulation de la croissance du
parasite (-19,0 % pour 29 jours).
- Alors qu'il détermine une perte du taux d'inhibition par rapport
à l'action individuelle de 215. uitide et ~1. verruearia à 5 et 9 jours, le
traitement impliquant ces 2 germes manifeste un effet synergique très puissant
à l'dge de 29 jours ; il y aurait là COINW un effet non pas d'addition mais de
"facilitation" mutuelle au S#ein du mélange.
- Quant au binllme Cl. gZobosm + Ml. verrucatia, il extériorise une
synergie ,a l'age de 9 jours et une résultante tres satisfaisante pour les autres
délais d'incubation.
- Enfin, l'action conjuguée de filtrats issus des 3 germes évolue
considérablement puisqu'elle passe de (-16,l %) a (+50,6 %) lorsque nous allons
de 5 à 29 jours.
- Précisons pour terminer, que ces interprétations, comme celles qui
suivent, se fondent sur les seuls &ultats établis par nos experiences, sans
préjuger du comportement des germes pour d'autres délais d'incubation qu'il au-
rait certainement été intéressant de tester (notamment entre 9 et 29 jours).
3.3.3 - Remarques
La seule vue GLOBALE des diagrammes matérialisant ces résultats
suggère le choix du type de ,traitement en fonction de son efficacité relative ;
ainsi, nous dirions par exemIple, qu'à pH0 4,10, l'utilisation de TA. vitide,
Ml- verruc'atia ainsi que de l'association T5. virile + Cl. globosm, assure une
excellente couverture contre le parasite entre 9 et 29 jours notamment ; par
contre, toutes les autres combinaisons ne constituent une garantie contre le
développement du parasite que pour un délai d'incubation peu différent de
9 jours.
- 124 -
A pH, 6,0, cl. ,Y( loboswn et l'association Cl. gZobostm t Ml. verru&u
et a la limite Tg. viride t MI. verrucaria sont efficaces pendant toute la durée
de l'expérience tandis que !Fg. vitide et le mélange T5. vitide + Cl. gZoboswn
joueraient un rble antagoniste remarquable lorsque les cultures sont agées de
moins de 9 jours.
Enfin, l'utilisation du mélange des :3 germes n'est envisageable
qu'a partir du 29e jour.
- A la: lumièie des expikiences préliminaires, toute compréhension de
ces résultats doit tenir compte de l'évolution observée des pH de base ; le
tableau 37 rend compte de cette modification engendrée par les germes antagonis-
tes pour‘les 3 delais d'incubation.
. verrucaria
5,05
6,35
7,50
7,50
- 7,35
7,65
I
?.
4,810
6,0
4,lO
6,0
Tableau 37
- - - Evolution du pH de base du milieu liquide sous l'influence des
germes antagonistes et en fonction du temps ; PC/pHo 4,lO et
6,0/25"C/obscurité continue.
- A l'âge de 29 jours, le vieillissement des cultures antagonistes et
partant le déclenchement du phénomGne d'autolyse mycélienne doivent introduire
des modifications telles qu‘il nous est difficile voire impossible de cerner
l'origine réelle de la restriction observée ; â ce propos donc, les tisultats
correspondant à l'dge de 9 jlours nous paraissent plus fiables que ceux corres-
pondant â 29 jours.
- Après incubation de 10 jours du parasite sur les filtrats. (FC) ou mélan-
ge de filtrats de cultures (MFC) des germes antagonistes, nous avons testé le
- 125 -
pH occasionne par le développement de PJ. oryzae ; le tableau 38 donne les nou-
velles valeurs de pH.
5
9
29
4,65
6,65
4,75
6,90
- 7,35
3,45
4,65
6,80
4,60
6,90
- 6,45
7,25
4,65
6,70
5,15
6,80
- 7,80
7,65
4,90
6,75
4,90
6,80
- 7,55
7,15
4,50
6,65
4,55
6,90
- 5,90
6,65
4,55
6,70
5,15
6,50
- 6,80
7,25
4,80
6,90
5,80
6,80
- 8,00
8,05
_-
4,lO
6,0
4,lO
6,0
4,lO
6,0
Cult. antago.
Tableau 38 - Evolution du pH après 10 jours d'incubation de Pl. oryzae sur les
- -
filtrats ou mélange de filtrats de cultures antagonistes dgées de
5, 9 et 29 jours et donne les pH, sont de 4,lO et 6#,0 ; PC/25'/
obscurité continue.
IV - INFLUENCE DE L'ANTAGONISTE SUR LA GERMINATION DES CONIDIESt DU PARASITE
-
-
Le blocage du developpement du parasite peut également etre occa-
sionné pair une inhibition affectant soit l'émission et/ou le développement du
tube germinatif, soit la différenciation de l'appressorium dont on sait qu'il
joue un role primordial dans le processus infectieux ; c'est Zî ce titre que nous
nous proposons d'examiner l'action des germes antagonistes sur la germination ;
pour ce faire, nous avons procédé a une confrontation des conidies de Pl. oryzae
avec des préparations établies a partir soit de suspensions coniidiennes, soit
de filtrats de cultures des germes antagonistes.
- 126 -
La relation
jq o ù
Go = germination sur témoin (%)
= germination sur essai (X)
= inhibition de la germination (X)
permet d'exprimer les résultats en pourcentages d'inhibition de la germination
des conidies du parasite par les préparations antagonistes et par rapport aux
témoins respectifs.
4.1 - Action de la suspension conidienne (SC) et du mélange de SC (dans
l‘eau distillée) des antagonistes sur la germination du parasite
-
--
4.1.1 - Préliminaire
Les conidies (du parasite ou des antagonistes) mises en suspension
dans l'eau distillée stérile sont ici issues de cultures sur PCA incubées à
25'C/obscurité continue pendant 12 jours.
Avant d'examiner les résultats établis sur la base de ce type de
confrontation, nous voudrions attirer l'attention du lecteur sur ce que nous
avons convenu d'appeler "EFFET DE MASSE" : de façon générale, l'étude de la ger-
mination de conidies en fonction de la concentration montre qu'au-delà d'une
certaine valeur, le pourcentage de germination décroft progressivement jusqu'à
s'annuler ; ainsi donc, des conidies en nombre très élevé seraient auto-inhibi-
trices de leur propre germination ; cela signifie que lorsque nous confrontons
un volume de la suspension conidienne de l'antagoniste Ai avec un volume de la
SC du parasite (la concentration conidienne de chacun de ces germes étant préa-
lablement ajustée à 180 000 conidies/ml), nous aurons 90 000 conidies de
PJ. or'yzcze par ml de ce mélange ; nous testerons le pourcentage de germination
du parasite par rapport à un témoin T1 appelé "FRANC" de concentration égale à
90 OOO/ml ; or, de façon globale (sans distinguer les conidies antagonistes de
celles du parasite), nous avons en réalité un nombre de conidies ou encore une
masse (d'où le terme d'effet de masse que nous avons adopté) gIobale de
180 OOO/ml dont il faut que nous tenions compte pour prouver quel pourcentage de
"non germination" (= pourcentage d'inhibition) est imputable à l'auto-inhibi-
tion ; nous faisons donc un deuxième témoin T2 renfermant 180 000 conidies de
-- 127 -
PJ. oryaae/ml d'eau distillée stérile.
Encore nous faut-il ajouter qu'en toute rigueur, une rkerve s"iw
pose par le fait que l'inhibition endogène engendrêe par 180 000 conidies de
Pl. oryaae/ml n'est pas nkessairement comparable à celle régie par le mélange
90 000 conidies de Pyticuiratia oryzae et 90 000 conidies de l'antagoniste Ai.
Cela dit, les divers essais Ei (i := 1 à 7) et témoins (Tl ; T2 ;
T3 ; TG pour l'effet de masse) sont élaborés à partir de suspensions conidien-
nes ajustées à 180 000 conidies/ml d'eau distillée pour toutes les catégories
de microorganismes et conformément au diagramme suivant ; étant entendu qu'en
cas de mélange ou d'addition d'eau distillée stérile, ces opérations se font
toujours volume à volume.
- Action isolée des germes antagonistes
Essai no 1 = Pl. oryzae t T5. virk?e
Essai no 2 = PJ. oryzae t Cl. gZobosum
Essai no 3 = Pl. oryzae t Ml. verrucatia
Dans ces trois essais et pour chaque type de confrontation, il y a
globalement (= G) 180 000 conidies/ml et individuellement (= 1) 90 000 conidies/
ml pour chaque germe ; nous rëaliserons donc deux témoins :
Tl
= PJ. oryzae de concentration 90 000 conidies/ml
T2
= PJ. oryzae de concentration 180 000 conidies/ml
- Action combinée de 2 germes antagonistes
E4 = Pl. oryzae t (T5. viride t Cl. globosum)
E5 = Pl. oryzae + (T5. virile t Ml. verrucaria)
E6 = Pl. oryzae + (Cl. globosm + .Ml. verruearia)
soit
T2 = ~1. ozyztze de concentration 60 000 conidies/ml
- Action combinée des 3 germes antagonistes
-
E7 = Pl. oryzue t (T5. v+ide t Cl. globoswn t Mj. vermcaria)
soit
T3 = PJ. oryzae de concentration 45 000 conidies/ml
- 128 -
- El!, E2, E3 sont appreciés par rapport à T1
- -
E4?J5&6 par rapport à T2
Q-par rapport à T3
L'implication de l'effet de masse est dosée par intervention du
temoin masse TC.
- -
4.1.2 - Résultats et expression numérique
Tableau no 39.
4.1.3 - Expression graphique (fig, 23 et 24) : discussion
L'analyse des pourcentages de germination ou celle d'inhabation de
la gk%miFlatiCNl du parasite pi3P les antagoniste s et par rapport aux témoins res-
pectifs conduisent à la m&ne compréhension du phénomène ; pour cette raison,
nous avons1 choisi de matérialiser graphiquement les résultats par reférence au
taux de germination, par rapport aux temoins francs.
- L'expression du temoin "MASSE" par rapport aux témoins "F:RANC§" Tl, T2,
T3 révèle un pourcentage de germination relativement plus élevé que les témoins
eux-m&nes (93,7 ; 105,7 et 123,3 % pour Tl, T2 et T3 respectivement d'après le
tableau 39 et les diagranmnes A, B et C de la figure 23) ; ce constat nous auto-
rise à affirmer que le phénomène d'inhibition endogène n'est pas impliqué dans
la réduction éventuelle du taux de germination des conidies du parasite ; sur
cette base, toute réduction du taux de germination des conidies de Pl. ozyzae
doit trouver son explication dans l'intervention du traitement appliqué.
- Ml. vermtcatia (qui inhibe à 36,7 % la germination des conidies du para-
site) est le germe le plus intéressant encore une fois ; de plus, il induit un
léger retard dans la croissance du tube mycélien (30,8 11) par rapport au témoin
~1 (42,~ 1-11~
- Le mélange des conidies des trois germes détermine également une reduc-
tion du taux de germination des conidies du parasite par rapport au témoin T3
(le pourcentage d'inhibition du tube mycélien est supérieur à 30 % (33,4 p pour
T3 et 19,6! p pour E7).
Nb cocidies
germées
7 4
79
7 2
6 4
5 0
’
7 0
5 7
6 5
’
6 4
6 0
’
4 4
Nb conidies
3 6
4 0
non germées
5 6
% germination (1)
par rapport Ti (2)
U = 1, 2, 3) (3) /
93 “’
123,3 7
105,7
/
,:IO
1 9111
1 ,:o,
1
6:0,
1
7:o.
/
8114
/
,:I,
/
91,4
j
60,O
/
73,3
I
I
% inhibition (1) 6,32
par rapport T i (2) STIMULAT.
21,0
899
19 30
3637
30,o
18 96
731
896
40,o
26,7
U = 1, 2, 3) (3) STIMULAT.
% germination
par rapport MASSE
74,0
-
97,3
86,5
6736
-
77,0
87,8
86,5
-
59,4
Tableau 39 - PI. oryzae : action de la suspension conidienne ou du mélange de SC (dans eau distillée) des antagonistes
sur la germination des conidies du parasite.
Incubation pendant 5 heures/25^Cj obscurité continue.
Léaende des. fia. 23 et 24
Pourcentage de germination et longueur moyenne (u) des conidies de
Pj. oryzae soumises à l'action des suspensions ou mélange de suspen-
sions conidiennes des germes antagonistes.
Incubation de 5 h/25'/obscurité continue.
DIAGRAMME A : Intervention isolée des germes antagonistes
II TI ou témoin franc
TG ou témoin masse
I I
000
EI en présence T5. vitide
Il
***
E2 en présence Cl. globoswn
*YY
r I
‘“..‘.”
E3 en présence Ml. vermcaria
DIAGRAMME 6 : Intervention simultanée de 2 germes antagonistes
L-1
T2 ou témoin franc
TG ou témoin masse
1
+o+
E4 en présence (TA. viride + Cl. globoswn)
El
? ????
E5 en présence (TA. viride + NI. vemucaria)
+alj
E6 en présence (Cl. globosum + MI. verruearia)
DIAGRAMME C : Implication combinée des 3 antagonistes
L-J
T3 ou témo in franc
TG O U témoin masse
P
;:#g
ET en présence (Tg. viride f Cl. gZobosm + Ml. verruca;4a)
I a1 t
(1-I)
a(
c
3c
‘0’
m -
20
*
*
*
10
f
*
*x-
Fig. 24 - Longueur moyenne (p) du tube germinatif émis par les
conldies de Pl. oryzae confrontées aux SC (et MSC des
germes antagonistes ; 5 h d'incubation à 25"C/
obscurité ; cf légende de la figure 23.
- Citons enfin les restrictions moyennes induites par Cl. @abosum et par
le mglange Tg. uitide t cl. gtobosum (19,0 et 18,6 % d'inhibition respective-
ment) qui contrarient également le developpement du tube germinatif.
4.2 - .Action des filtrats "naturels" (FCN) et filtrats autoclaves de
m
cultures (FCA) des germes an,tagonistes sur la germination des conidies de
-
21. oryzae
Les germes antagonistes sont inoculés sur PC ajusté a pH 4,lO et
pH 6,0 par le tampon Mc Ilvaine
; l'incubation est faite pendant JO jours a
25"C/obscurite continue ; les filtrats de cultures sont obtenus grace a la mé-
thode décrite dans l'annexe technique no 5.
Dans un souci de synthèse et pour faciliter la comparaison des ré-
sultats ci-dessus et ceux matérialisant l'action des conidies maintenues en sus-
pension dans le liquide de culture (0 4.4), nous avons groupé toute les observa-
tions concernées dans les figures 25 et 26.
4.2.1 - Résultats et expression numérique
Tableau no 40.
4.2.2 - Expression graphique : discussion
- Excepté pour T5. virile, les FCN ou FCA issus des cultures de pHo 4,IO
exercent une action plus efficace que celle observable pour les traitements
issus de cultures de pH, 6,0 ; cette m&ne efficacité relative se retrouve au
niveau de la longueur moyenne du tube germinatif.
L'action des filtrats de Cl. g1obosu.m et de ~1. vemucaria
issus de
cultures de pH, 4,lO semble ici confirmer des résultats analogues établ is par
STEWART et HILL (1965) : ces auteurs avaient alors montré que les filtrats
de culture d'flek-rinthosporim sativwn renfermaient une substance non phytotoxi-
que mais capable d'inhiber l'a germination d'urédospores ou la formation de pus-
tules de rouille à Puccinia.
- Le FCN de Cl. globoswn (exerçant 97,6 % d'inhibition de la germination des
conidies du parasite pour pHo 4,lO) est nettement supérieur au FCN de
Ml. verrucaria (70,7 %) ; les longueurs moyennes correspondantes du tube germi-
Traitements
Nb conidies germées
N b conidies non germées
7
5
11
2 0
100
23
6 7
4 4
G.
u
% germination
Lll
par rapport T
93,0
95,0
95,7
84,2
090
81,O
35,5
58,9
% inhibition
germination
790
590
4*3
15.8
100,o
18,9
64,5
41 ,o
I
i, moyenne tube
3fj,4 1
44,s :
0,o
:
29,4
:
24,5
’
30,l
mycelien (50 conidies)
P7 97)
(25 99)
P4,l)
P5 ,lI
P7,l)
Tableau 40 - PJ. oryzae : germination des conidies sous l'influence des filtrats naturel (FCN) et autoclavé (FCA)de cul-
l
tures des germes antagonistes ; incubation 5 heures/?5°C/obscurité
continue.
w
wI
Fig. 25 - Germination (X) des conidies de Pl. opgaae incubées pendant
5 h/25"C/obscurité en présence des conidies maintenues en
suspension dans le liquide de culture (CMS) ; filtrat naturel
de cultu,res (FCN) ,; filtrat, autoclavé de cultures (FCA) des
germes antagonistes incubés sur PC/25"C/obscurité/lO j.
A- pH, descultures liquides antagonistes = 4,l.O
B- pH0 descultures liquides antagonistes = 6,O
Témoin = 100 %
1
= T5. virile
i---J CMS
II = Cl. g;lobosm
/iFGel
F
C
N
III = Ml. vf?rmcaria
lffzza
FCA
a
- 136 -
natif sont de 14,0 et 21,0 1-1 respectivement.
-
-
- Le FCA de Cl. g Zobosum issu de cultures à pH, 4,lO bloque à 100 % la ger-
mination du parasite ; il convient cependant de préciser à ce propos que, dans
cette action spectaculaire, nous ne saurions attribuer aux métabolites de
Cl. gZoboswn ce pouvoir inhibiteur puisque l'autoclavage aura tres certainement
introduit de nombreuses modifications et altérations des substances de base.
- Dans l'expérience qui suit, nous allons rechercher l'aptitude à la combi-
naison I(synergie) efficace de ces divers types de filtrats.
4.:3 - Influence du mélange de filtrats "naturels" (MFCN)-ou autoclavés
(MFCA) des cultures antagonistes dgées de 10 j/25O/obscurité continue sur la
-
germination des conidies dePI. oqaae
4.3.1 - Resultats et expression numerique
Tableau No 41.
4.3.2 - Expression graphique (fig. 27 et 28) : discussion
-
s- De m&ne que précéderrment, les préparations non autoclavees sont plus effi-
caces lorsqu'elles sont issues de cultures antagonistes liquid,es de pH, 4,lO que
lorsqu'elles proviennent de cultures de pH, 6,0.
a- Nous référant à ce pH, 4,10, nous observons que les mélanges de FCN les
plus inhibiteurs sont ceux impliquant cl. gZobo:;wn (cf diagramrnes X, Z et T de
la figure 27).
L'association E41. verrucaria + Cl. yZobosum manifeste une synergie
décisive (diagramme Z) à l'encontre des conidies du parasite alors que pris iso-
lément, les pourcentages respectifs d'inhibition sont de 70,7 et 97,6 % ; il
n'y a donc pas d'antagonisme entre les métabolites propres aux g'ermes concernés.
L'action très satisfaisante de Ml. verruearia agissant seul (dia-
gramme III, fig. 25) semble masquée voire réduite lorsque ce germe est en combi-
naison avec T5. vitide (diagramme Y de la figure 27), le taux d'inhibition pas-
sant de 70,7 à 15,l %.
Par contre, le taux d'inhibition de la germination des conidies du
Nb conidies non germGes
Nb conidies germées
Tableau 41 - Influence du MFCN et MFCA des germes antagonistes sur la germination des conidies de PJ. oryzae ;
I
(1) = Ts. uitide ; (2) = cl. gtobosm ; (3) = Ml. uemcda ; incubation 5 heures/25"C/obscurité continue.
E
UI
Fig. 27 - Germination (16) des conidies de PJ. oryzae incubé 5 h/25"C/
obscurité en présence de MFCN et MFCA de T
uiride (1) ;
Cl. gZobosum l( 2) ; MI. verrucaria (3) incuks sur PC/25OC/
obcurité/lO j,
X = (l)+(2) ; Y = (l)+(3) ; Z = (2)+(3) ; T = (l)+(2)+(3).
A = pHo cultures liquides antagonistes = 4,lO
B = pH0 cultures liquides antagonistes = 6,0
MFCA
El
te*
FCN
m
-
I-P '--"-L-"-P
- î
m
N
I
- 140 -
parasite passe de 3,6 % pour T5. vitide et 97,6 % pour cl. gtokloswn a 95,9 %
lorsque ces deux germes interviennent en association ; le phén~urn&e de masqua-
ge induit .par T5. titi& sur MI. verruearia n'est donc pas inductible par
T5’ vhide sur Cl. globoswn ; nous serions à priori autorisés Zi conclure que,
dans ce dernier type de combinaison, persiste l'action prépondtirante de
Cl. gioboswn dont les métabolites n'auraient pas une aptitude tilevée a la combi-
naison avec ceux de T5. vir+de ou ne subiraient aucune altératiion grave de la
part de ceux-ci.
L'association de Cl. globosm + !$. verrucaria (100 % d'inhibition,
cf diagramme Z) est lég&ement plus active que celle faisant intervenir les 3
germes (95,5 % conformément au diagratmne T).
- A pH0 6,0, l'autoclavage , outre qu'il semble supprimer toute activite
inhibitrice des pr¶tions,
determine parfois une certaine stimulation (ex.
le tàux de germination passe de 98,9 % a 110,6 % selon que le mélange de filtrats
de cultures de Cl. globoswn + Ml. verruearia est naturel ou autoclavé.
-II Quant a la longueur du tube germinatif (fig. 28) elle est en relation
directe avec 1 'aptitude du type de préparation a s'opposer a son émisséon.
4.4 - Influence des conidies antagonistes maintenues en +pension dans
le liquide de culture (CMS)l sur la germination des conidies du parasite
- - -
-
Les cultures liiquides des antagonistes ont éte realisées dans des
erlenmeyer de 100 renfermant environ 25 ml de PC tamponne (tampon Mc Ilvaine)
à pH, 4,lO et 6,0 ; l'inoculation est constituée par 2 rondelles de diamètre
-
-
-
6 mm i l'ensemble est incube 10 jours a 25O/obscurité continue.
Les conidies du parasite sont issues d'une culture sur PCA incubée
a 25"/obscurité continue pendant 12 jours ; la concentration de base est de
180 000 conidies/ml d'eau distillee stérile.
A la date de confrontation, les concentrations conidiennes des ger-
mes antagonistes (nombre de conidies/ml) étaient les suivantes :
- 141 -
I
PH, 4910
I
Germes
I
pH0 El,0
1
(~1) A la date de confrontation, les cultures de cl. g2obos.m étaient dépour-
vues de conidies dont l'apparition est souvent différ+Se en culture liquide.
4.4.1 - Résultats et exoression numérique
--,-
---
:
,
Traitements
Zéro = T
viride
I Cl. globosm Ml. verruearia
I
I
PH0
4,10 6,0
4,lO
6,O
4,lO 6,0 1
\\
Cult. antago.
4,:tO 6,0
/
EvhluatiMns\\
I
Nb conidies germées
1 86 ) 90
75 1 75 1
2 1 17 j
0 /
0 /
Nb conidies
non germées
25 1~ 25
25 25 98 83
9 8
8 3
100 j 100 /
% germination
par rapport T
0 87,2 1 83,3 1 2,3
2,3 1 18,,9 1
0 j
1
% inhibition
par rapport T
12,8 1 16,7 / 97,7 1 81,.1 1 1 0 0
100 j
Long. tube germinatif
26,6 1 19,6
(r-1)(20 conidies)
(*4,7)) (2393)
(-1
Tableau 42
-- - Influence des conidies des germes antagonistes maintenues en sus-
pension dans le liquide de culture sur la germination des conidies
de PJ. oryzae ; incubation 5 h/25'/obscurité continue.
- 142 -
4.4.2 - Expression graphique : discussion
Dans un but d'analyse comparative, ces résultats sont rassemblés
dans les diagrammes 1, II et III des figures 25 et 26 avec la legende qui leur
est attribuée (CMS).
- Ml. verruearia induit un blocage total (100 % d'inhibition) de la germi-
nation des conidies du parasite et ce, pour les 2 valeurs de pH,,.
- Cl. globoswn, tres efficace à pH0 bas (97,7 % d'inhibition), demeure
très satisfaisant à pH, élevé (81,l %).
- T5. uitide par contre, ne contrariant que très peu (12,8 % et 1#6,7 %
d'inhibition à pH, 4,lO et 6,0 respectivement) la germination du parasite ne
présente pas un intéret particulier pour ce type de contrOle.
- Parallèlement, l'exarnen de la figure 26 finit de nous convaincre de la
supériorité incontestable de Ml. vermLcaria, de l'intéret minime de ing. vim&k
(42,0 et 39,2 1-1 pour la longueur du tube germinatif à pH, 4,lO et 6,0 respecti-
vement) s de la position intermédiaire de C1. ghbosum qui, quoiqu'il réduise
considisrablement le taux de germination , ne limite que moyennement la longueur
du tube germinatif (36,7 et 48,9 % de réduction du tube germinatif par rapport
aux témoins respectifs).
Les travaux réalisés à ce jour, en dépit de la disparité de leurs
conclusions, nous autorisent néanmoins à ne pas sous-estimer lai concentration
conidienne des germes antagonistes impliques dans une methode de lutte biolo-
gique ; ainsi, pour Aureobasiclium pul'lulans agissant contre AZtmwaria zinniae,
le maximum d'inhibition de la formation des lésions a été observé pour les
concentrations les plus élevées ; par contre, la restriction malximale des mani-
festations du parasite est obtenue à partir d'une concentration optimale
(7,5 x l@ spores/ml) lorsque l'auxiliaire utilisé est AZtemau6a tenuissima
(VAN DEN HEUVEL) ; ces observations devraient également, dans le cas particulier
qui nous préoccupe, permettre une meilleure appréciation relati,ve des actions
de T5. vi:&& et de Ml. vermcaria.
4.5 - Remarques
La connaissance des mécanismes impliqués dans la réduction de la
- 143 -
"
croDssance mycélienne ainsi que du taux de germination des conid'ies du parasite
par 'les germes antagonistes est une composante fondamentale dans l'élaboration
d'une mëthode de lutte biologique :
- Des recherches nombreuses permettent désormais d'affirmer que la germina-
tion des s#aprophytes foliaires est un préalable a toute manifestation de proprié-
té antagoniste ; la seule germination ne conférant pas nkessairement
-
cette pro-
-
priété.
- La capacité d'un antagoniste à s'opposer a "l'épanouissement" du parasite
seraft (igalement en étroite relation avec la vitesse de germination ; ainsi,
l'isolat A-133 de Cladosporium, germant plus vite que celui A-55 est corrélati-
-
-
-.
vement ~J~US efficace pour réduire les lésions foliaires inductibles par
A. zinniae sur fève (VAN DEN HEUVEL, 1970).
En outre, le nombre de spores de l'antagoniste en germination (donc
la concentration sporale) jouerait un rble significatif ; les isolats Hwma A-105
et CZadcmporiwn A-55 inhibent aussi bien la germination in vivo que la germina-
tion et la croissance mycélienne de A. zinniae in vitro ; seul cependant le pre-
mier inhibe la formation des lésions foliaires de la feve en raison probablement
de sa concentration 4 fois plius élevée (VAN DEN HEUVEL, 1970).
- Certes, l'état actuel des recherches ne permet pas de cerner le mécanisme
intime de l'inhibitïon de la germination ou de la croissance wcçilienne du para-
site ; l'expérimentation in &Vo, de par les actions et interactions inhérentes
au materie biologique, n'est pas pour faciliter la définition des mécanismes
impliqués ; cependant, de nombreux résultats nous autorisent a diire tout l'inté-
r+t des recherches in vitro : deux exemples suffisent pour nous en convaincre :
* Rhizopus nigmkans, qui réduit in vivo le nombre de lésions foliai-
res provoquées par AZternaria sotani sur pomme de te,rre, inhibe tigalement in
vitro la germination des spores ainsi que la croissance mycélienne du parasite
(DAS et al., 1968).
La formation de lésions foliaires par I?uccinia penniseti sur le
I
millet perlé est tiduite par des saprophytes dont C. globoswn, AspergiZlus
japon.icus, Fusariwn oxyspomm qui inhibent également in vitro, la germination
des urédospores du parasites.
- 144 -
CHAPITRE QUA'TRIEME
ELEMENTS DE REFERENCE : ACTION DE WELQUES
FONGICIDES SUR LA CROISSANCE MYCELIENNE DU PARASITE
Le but de ce chapitre n'est pas l'étude approfondie de l'action des
fongicides sur Pl. oryzae ; de nos jours, la chimiothérapie demeure encore une
arme tri% étudiée et très usitée contre la pyriculariose ; en conséquence, nous
nous proposons de donner seulement un élément de reférence permettant aux uti-
lisateurs des fongicides de se faire une idée sur l'efficacite relative de ces
-
produits par rapport aux auxiliaires naturels.
Nous nous bornerons présentement a examiner l'action de 4 fongici-
des s~ystémiques sur la croissance mycélienne du parasite.
Les produits utilisés sont les suivants :
- BENOMYL = Butyl carbamoyl .l benzimidazole carbamate de méthyle
- CHLORONEBE = Dichloro 1,4 diméthyl 2-5 benzène
- EL.291 = Tricyclazole
- TRIDEMORPHE = N tridécyl 2,6 diméthylmorpholine.
1 - EXAMEN MACROSCOPIQUE (cf planches VIIIA et VIIIB)
- -
1.1 - Bénomyl
Aux concentrations de 10N6 et 10” Mole/l, les cultures prkentent
un aspect semblable a celui sur témoin ; 3 10,s M/l; aucun développement du pa-
- 145 -
rasite n'est observable pendant la durée de l'expérience.
‘J 9
* L.
- Chloronèbe
SI
110-3 M/l : teinte rosktre claire ; colonie recouverte d'une couche cré-
meuse qui s'estompe a mesure que l'on va vers la périphérie.
Nous remarquons la présence de nombreuses conidies relativement
courtes (base arrondie) par rapport au témoin et a celles développées sur
bénomyl.
-- iO-4 M/l : teinte cllaire, colonie moins épaisse que précédemment g conl-
dies comparables à celles formees à 10-3 M/l.
.,a
10-S M/l : aucune diifférence significative n'est perceptible par rapport
au témoin.
3,..3 - EL-291
- iO-5 M/l : la coloraltion observée est nettement plus marquée que celle
décrite pour le chloronèbe ; ici en effet, la zone centrale (la plus dgée) de
la colonie est franchement rosâtre ; celle marginale est plus fine, se confon-
dant pratiquement avec la couleur du PCA.
- 10-G et 10-T M/l :
- -
en dehors de la teinte rosâtre plus diluée, nous n'ob-
servons aucune particularité.
1.4 - Tridémorphe
- ~ID-4 et 5 x 10-5 M/l : autour de la ronde1 le inocul um et à m@me le subs-
-
-
trat, se développe un anneau épais, quasi-levuriforme et de teinte brunatre ;
les conidies sont trés arrondies.
- -3-5 M/l : la colonie parasite se développe avec un retard prononcé par
rapport au témoin ; la conidiogénèse ne semble pas affectée ; les conidies ob-
servées sont plus courtes et plus arrondies a leur base que ce'lles observées
sur témod n .
7
Chloronèbe
EL-291
Tridémorphe
10 -5
10 -6
1 0 -7
10-J 15x!O-51 10-5
20,3
0,o
0,O
19,4
20,o
13,l
14,5
20,o
19,l
18,6
18,8
0,O
0,O
7,2
3
0,5
0,O
0,6
0,O
0,5
0,O
O,O-
098
130
039
0,o
0,o
0,3
27,9
0,o
26,8
27,0
19,3
20,O
27,2
25,5
24,7
25,3
0,o
0,o
16,2
4
I 0.4 1 0'0
0'7
0'0
0.3
0'0
1'5
0,6
0,6
0.6
0,o , 0,o , 0,3
l
l
I
l
I
34,8
0,O
35,2
36,0
24,0
26,2
34,8
33,4
32,0
32,4
0,o
0,o
20,5
5
0,4
0,o
1,2
0,o
0,o
0,5
0,5
036
090
036
0,o
0,o
0,5
38,9
0,O
42,2
42,0
30,O
32,2
39,5
39,8
38,6
6
0,9
0,o
0,9
0,o
0,o
1,5
0,3
13
130
46,2 l 0,O I 49,0 I 50,O I 35,6
38,6
46,7
47,0
46,7
45,8
I
8,0 9,0
26,O
7
0,3
0,O
1,6
0,O
0,6
1,7
0,3
L8
18
095
0,O
o,o
0,6
Tableau 43 - PI. oryzae : croissance radiale (mm) en fonction du type et de la concentration du fongi-
cide incorporé ; chaque valeur est une moyenne étabiie a partir de 8 boftes de Petrij
PCA/25OC/obscurité continue.
I\\ Fnnoicides
Tridemorphe
. ---a
1
Bénomvl
Chloronèbe
EL-291
Zéro
Age (J)
1()'5M/l II+ 1 ' 1G-7 1G-3
I 10-5 1 10-6 iI 10-7
lG-4
l-4
-
3 1 G,G 1100 1 4 f 1 1 35 128 11 / 5 1 8 f 7
100
!
t
4
G,G
100
3
3
30
28
G,7
8
11
9
100 l 100 I 41
5
j G,G j 100 / (-1) 1 (-3) / 31 / 24 j G,G j 4 / 8 j 6
100 l 100 I 41
6
/ G,6 1 100 / (-8) j (-7) / 22 j 17 j (-1) 1 (-2) IW) /(-WI
'
7
/ G,G / 1GG / t-6) j (-8) j 22 / 16 / (-1) j (-1) I(- 1) /(-0~3)
I
Tableau 44 - PJ. orpue : Pourcentage d'inhibition de la croissance radiale en fonction du type et de
la concentration (M/l) du fongicide incorporé et par rapport au Smoin ; 25"C/PCA/
obscurité continue.
- 148 -
Dans le cadre de l'expérimentation in u&ro et compte-tenu de la
formula,tion nutirique des résultats (% d'inhibition de la croissance mycélienne
du parasite par chaque type de traitement
: que ce dernier impllique un fongi-
cide ou un germe antagoniste), l'analyse des données relatives aux fongicides
est réalisee de manière comparative ; cette démarche devrait nous permettre de
juger l'efficacité relative 'des auxiliaires naturels par rapport aux fongicides
utilisés.
- Seuls le Benomyl à la concentration 10m5 mole/1 ainsi que les traitements
(Ml. ve.:rmrcaria) X (PJ. orpae x T5. viride ) et (Ml. verrucarSa 11 X (PJ. oryzae X
T5. virtdtz et Cl. g Zobosum) exprimés par rapport à T1 à pH0 4,10, garantissent
--.
.à 100 % contre le parasite pendant toute la dur&e de l'expérience.
- iLes autres traitements conjugant les confrontations diffikée et simulta-
née, de tirne que celui impliquant le Tridémorphe 10w4 et 5 x 10’15 mole/1 notam-
- -
ment, procurent des tisultats quasi-équivalents puisque le plus faible pourcen-
tage d'inhibition de la croissance du parasite est de 82,5 % (induit par l'asso-
ciation Mi. verruearia, Pl. ozyzae et Cl. gZoboswn après 4 jours d'incubation
à pH0 6,0).
--.
- Le Chloronèbe et EL-291 à toutes les concentrations usiti?es, le Bénomyl
à 10B6 et 10-T mole/l, manifestent une TRES NETTE INFERIORITE vis-à-vis des ger-
- -
mes antagonistes impliqués au cours d'une confrontation simultanée :
. d'abord, en raison de la DECROISSANCE CONTINUE du taux d'inhibi-
tion exerce par les fongicides précités alors que les antagonistes extériori-
sent un ACCROISSEMENT CONTINU de leur pouvoir inhiblteur,
. ensuite, du fait que le taux d'inhibition réel est nettement supé-
rieur pour les antagonistes que pour les fongicides considérk : ainsi par exem-
ple, T5. virile exerce un pourcentage d'inhibition MINIMAL de 46 9 après 3 jours
-A
d'incubation à pH0 3,50 alors que pour tous les traitements fongicides concer-
nés, la valeur MAXIMALE observée est de 35,0 % seulement (induite par le Chloro-
nèbe 10m3
-,- mole/1 au 3e jour).
- La décroissance observtfe du taux d'inhibition exercee par ces traitements
fongicides -comme du reste celle exercée par les germes auxiliaires au cours
d'une confrontation différée- tiendrait soit à un phénomene d'accoutumance du
parasite, soit à une faible rémanente des produits, soit enfin, à la superposi-
tion de ces deux phénomènes.
- 149 -
- L'action inhibitrice exercée par les filtrats ou mélange de filtrats de
cultures liquides des germe s antagonistes âgés de 9 jours a 25*C/obscurité
continue sur la croissance mycélienne pondérale du parasite est également SUPE-
RIEURE Zi celle du Chloronebe (10-S ; 10-4 ; 10-s>, EL-291 (10-S ; 10B6 ; 10’7)
-
-
-
-
- -
-
'et du Elénomyl (10-6 et 10m7)~, a l'exception toutefois du tilange des filtrats
-
-
des 3 germes antagonistes qui exerce un effet dépressif (puisque l'action conju-
guée des 3 filtrats de culturesn'engendre qu'une inhibition de Il,6 % de la crois-
sance mycélienne pondérale du parasite à pH0 6,0).
a
- 150 -
CONCLUS1 ON GENERALE
PyricuZaria oryzae peut infecter pratiquement tous les organes
aériens (du riz :
- Sur variété h8te récepti,ve, la pyriculariose foliaire di?termine souvent
la dessication de la gaine ainsi que le grillage de l'ensemble de l‘appareil
foliaire ; quand on sait le rôle primordial que joue la photosynthèse dans la
vie des végétaux verts, on mesure toute la portée d'une telle manifestatfon.
- &es noeuds de la tige (situés au-dessus de la lame d'eau pour des riziè-
res éventuellement inondées) sont autant de sites d'infection (pyriculariose
nodale) ; lorsque c'est le dernier noeud qui est concerne, nous observons les
symptbmes de "NECK ROT" caractérisés par une profonde altération du systi3me
d'approvisionnement des grains dont la constitution est qualitativement compro-
mise ; de plus, une attaque grave détermine une pourriture du cou, aboutissant
à terme a la chute de la panicule.
- L'altération des graines peut également provenir d'une jnfection directe
--
de la panicule ; comme précédemment, la fertilité du paddy se trouve affectée
-
-
voire annulée.
Dans la première partie de la présente étude, nous avons établi une
culture pure et monoconidienne du parasite à partir de la variigté 302 G ; les
observations microscopiques permettent de caractériser P. oryme par la présence
d'un conidiophore à base renflée, fuligineuse et dont la portion terminale est
généraitrice des conidies ; les conidies (mesurant 19 à 23 x 7 ;3 9 microns) de
Mme qlue les caractères macroscopiques culturaux sont fortement influencés par
les conditions du milieu.
- 151 -
Trois volets importants ont retenu notre attention quant a la bio-
logie et a la physiologie du parasite :
LA CROISSANCE MYCELIENNE DU PARASITE
-
- Q? substrat nutritif
Tous les milieux testés (orge/agar ; paddy/agar ; PCA ; PDA ;
MISAT0 6,,.5) ont donné des résultats satisfaisants.
- .&k température
La fourchette thermique théorique étant bornée par les valeurs
8-9*C et 37°C avec un optimum à 28"C, nous avons expérimenté sur PCA entre
10,5OC et 37°C.
L'optimum thermique expérimental est de 30°C ; a 3T'VZ, nous obser-
vons un Puissant blocage du développement de la colonie du paraisite qui manifes-
te une reprise d'activité apres 4 jours d'incubation à 25°C/obs,curite.
- chémkopériode
L'alternance lumiére-obscurité présente un léger avantage ; la lumie-
re continue est moins favorable que l'obscurité continue.
- Le DH
Excepté pH, 2,3!j et a la limite pH, 2,95, toutes les valeurs de pH
- -
expérimentées (milieu PC tamponné à 20 % par le Mc Ilvaine) pralcurent une bonne
croissance pondérale de PI. ozyzae ; cependant, il est difficile, voire impossi-
ble de dissocier l'action strictement imputable au pH de base (pHo) de celle
matérialisant la régulation du pH sous l'action du parasite ; en effet, hormis
le pHo 2'35, peu favorable au parasite, tous les autres pH0 saint rehaussés vers
une valeur limite voisine de 8,20 a 8,30 ; cette régularisation du pH est d'au-
tant plus intense que le pH,, est voisin de l'optimum qui se situe entre 3,95 et
et 5,95 1; parallélement, l'lautolyse mycélienne (qui traduit le vieillissement
des cultures) est d'autant lplus précoce que pHo est favorable.
- 152 -
LA CONIDIOGENESE
La variété hote, le type de lésion, l'humidité relative, la tempé-
rature, la nature du substrat nutritif, le pH, etc..., autant de paramètres
affectant la morphologie et sans doute la physiologie du parasite ; sous cet
aspect, nous avons examiné l'action du milieu, de la température et du pH sur
la conidiogénèse.
- Le PCA, le MISAT0 6.5 induisent l'apparition precoce (5e jour) d'organes
-
-
de fructification ; le PDA, l'ORGEOSE, en raison de leur richesse, favorisent
une végétation luxuriante au détriment de la conidiogénèse perceptible au
12e jour seulement.
- La température : l'optimum expérimental est de 30°C tant pour la précoci-
te que pour l'intensité de la conidiogénese.
- Le pH : la bande optimale des pH est encadrée expérimentalement par les
valeurs pH0 4,60 et pH0 6,45 ; nous avons observé une forte corrélation négati-
ve (r = -0,73) entre le pH et la longueur moyenne des conidies de Pl. owzae ;
aucune variation significative n'affecte la largeur moyenne des conidies.
LA GERMINATION DES CONIDIES
- La réduction du taux de germination observée aux fortes concentrations
conidiennes (30 125 conidies/ml) est liée au ph?nomene d'auto-inhibition.
- La température optimale expérimentale est de 25°C ; l'incubation a 40°C
détermine la mort des conidies.
-e La zone optimale des pH est comprise entre 4,60 et 5,45.
-
P.
-' La lumière continue est défavorable (8 % contre 90 % de germination sous
alternance lumiere-obscurité) à la germination des conidies.
Sur la base de ce PREALABLE PROSPECTIF, nous avons envisagé la neu-
tralisation in vitro du parasite par le biais soit d'auxiliaires naturels, soit
de 4 fongicides systémiques ; pour ce faire, nous avons, au terme d'un criblage
sélectif, retenu les 3 germes Trichodem~ viride, Chuetomiwn~ globosum,
Myrothecium~ verrucatia dont il a fallu cerner les exigences par rapport à celles
du parasite ; c'est à la lumi&e de cette étude préliminaire que nous avons fixé
- 153 -
les parametres expérimentaux pour la suite de nos travaux : milieu a base de
carotte-pomme' de terre ; temperature de 25OC ; obscurité continue ; pH compris
-
-
m-
soit entre 3,o et 4,lO soit entre 5,55 et 6,o.
De plus l'analyse comparative des pourcentages d'inhibition relati-
ve des, croissances radiale (mm) et en surface (cm*) de Pl. orym:aé confronte
simultanément pendant 5 et 7 jours avec les germes antagonistes nous a conduit
a admettre une meilleure représentativité du taux d'inhibition évalué sur la
base de la croissance en surface que celui évalué en fonction de la croissance
radiale et ce, en raison principalement de la déformation affectant la colonie
du parasite dont l'épanouissement est contrarié par la contigu'ité avec le germe
antagoniste ; cependant, les deux méthodes gardent toute leur valeur lorsque le
type de confrontation n'altère en rien la régularité de la colonie du parasite
(confrontation différée ; confrontation avec les fongicides).
Portées ces precisions , nous avons tenté d'interpreter le phénomène
d'antagonisme préalablement mis en évidence en faisant appel aux influences
exercees par les germes antagonistes soit sur la multiplication végétative,
soit sur le phénomene physiologique qu'est la germination des conidies du para-
site.
INFLUE:NC:E DES GERMES ANTAGONISTES SUR LA CROISSANCE MYCELIENNE DU PARASITE
-
-
-
Le test U de MANN et WHITNEY nous a permis de juger de la significa-
tion des différences de croissance observées par rapport au tCmoin.
-- i'excellents résultats (100 % d'inhibition de la Croiss#ance mycélienne
pendant toute la durée de l'expérience) sont obtenus avec les traitements effec-
tues ei pH0 4,lO et associant le binbme PJ. oryzae X !Q. uermcotxtia avec
175. u~kzXe seul ou en conjugaison avec Cl. gtobosm (évaluations realisées par
rapport au témoin TI) ; ces mémes résultats sont observés avec le seul bénomyl
10w5 mole/1 (cf tableaux 28, 30, 36, 40).
-- le tridémorphe 10-4 et 5 x 10-5 mole/l, de m&ne que les autres traite-
ments associant le binome 1)~. oryzae X ~1. verruearia avec l'un ou les deux au-
tres germes antagonistes procurent également de très bons résui’ltats (les plus
-
-
faibles taux d'inhibition sont en effet de 82,5 % et 80,O % pour les germes
auxiliaires et le fongicide respectivement).
- 154 -
- Les résultats fournis par les germes antagonistes au cows d'une confron-
tation simultanee s'avCrent nettement supérieurs 3 ceux observéss avec : le
bénomyl 3.0'6 et 10B7 , les 3 concentrations du chloronèbe et du EL-291. Cette
-
-
-
meilleure efficacité revet une double signification :
. La valeur du taux d'inhibition induite par les germes auxiliaires
est plus élevee que celle engendde par les fongicides concernés ;
. Le taux d'inhibition exerce6 par les germes antàgonistes est
CROISSANT avec le temps (excepté pour la confrontation différ& en raison pro-
bablement soit de la"f&ible rémanente des substances caracteristiques des germes
antagonistes, soit d'une ACCOUTUMANCE du parasite, soit enfin de la superposi-
tion de ces deux phénomènes) ; ce qui leur confère une aptitude! prolongee de
contr8le du parasite ; par contre, les fongicides (comme les substances inhibi-
trices impliquées au cours d'une confrontation differi5e) exerçaint une action qui
s'estompe a mesure, ne parviennent plus a restreindre la croissance du parasite.
Les germes antagonistes interviennent par une action soit a distance
(production de substances inhibitrices diffusibles agissant sur le parasite),
soit Pr contact (les substances eventuellement émises ayant alors une faible
-
vitesse de migration et/ou une faible stabilité) soit enfin, a (distance et par
-"
contact.
INFLUENCE: DES GERMES ANTAGONISTES SUR LA GERMINATION DES CONIDIES DU PARASITE
-
-
- Sejpt traitements ont éte utilises
: suspensions et mélange de suspensions
conidiennes des germes antagonistes dans l'eau distillee stérile : filtrats et
- -
mélange de filtrats naturels de cultures ; filtrats et mélange de filtrats auto-
-
clavés de cultures ; conidies antagonistes maintenues en suspension dans le li-
- -
quide de culture.
- Les traitements suivants : le filtrat autoclave issu d'une culture liquide
de Cl. gZobosum pH, 4,lO (cf tableau 40) ; le mélange de filtratz non autocla-
vés de Cls. globoswn t Ml. verruearia pH, 4,lO (cf tableau 41) ainsi que celui
autoclave impliquant Tg. vir<de t Cl. gtoboswn pH, 4,lO (cf tableau 41) ; les
-
conidies de MI. verrmc&a maintenues en suspension dans le liquide de culture
-
pH, 4,lO et pH, 6,0 (cf tableau 42), inhibent à 100 % la germination des coni-
dies de PI. oryzae.
- De très bons résultats sont également observés avec les filtrats non au-
- 155 -
toclavés de Cl. gZoboswn pH, 4,lO (97,6 % d'inhibition de la germination des
conidies du parasite) et Mi. uerrucaria pH, 4,lO (70,7 %) ; les mélanges de
filtrats naturels de culture du bin8me Tg. viride t Cl. globoszm pH, 4,lO
(95,9 % d'inhibition) ainsi que du trinbme 1'5. vitide t Cl, ghbosm t
Ml. verrucaria (95,9 % d'inhibition).
Au terme de nos investigations, nous pensons avoir demontre la vali-
dite du1 contrble in vitro de P. oryzae par des germes antagonistes ; cependant,
cet acquit, s'il permet d'évaluer l'importance du chemin parcouru, n'a d'inter&
pratique qu'au travers de ses prolongements in &VO ; à ce proposS toute tenta-
tive de vulgarisation de la lutte biologique devra nécessairement tenir compte
de deux principes fondamentaux :
- maintien de l'auxiliaire dans le milieu naturel,
- cownpatibilité des exigences culturales du parasite et des germes anta-
gonistes.
C'est a ce titre et a la lumière des resultats établis par nos expé-
riences que nous qualifierons de RELATIVE, l'efficacité de chacun des germes sé-
lectionnés : chaque germe pouvant manifester sa supériorité pour peu que les
conditions qui prédominent dans le milieu co'ïncident avec ses exigences propres ;
en l'occurence, nous préconiserons l'emploi de Ml. uerrucaria pour circonscrire
le parasite lorsque le facteur de tiférence est le pH ; il est evident par ail-
leurs, qu'? T5. viride qui requiert un pH relativement bas est inapte à garantir
une couverture satisfaisante contre le parasite dont on sait qu'il rehausse trGs
précocement le pH, vers des valeurs optimales défavorables au Tr%dzmierma.
Lorsque l'ensemble des conditions de milieu cofncident avec les
optima requis par le parasite (ex. 30°C ; pH moyens de 3,95 à 7,,0, etc...),
Ml. ver:rucaria serait très certainement le germe dont l'usage individuel indui-
rait le meilleur contrale du parasite.
Cependant, eu ég,ard à la persistance et au développement "convena-
bles" de P. ozyzae lorsque les paramètres du milieu fluctuent au sein d'une
fourchette relativement large (pH, 2,95 à 7,50 ; température de 20 à 30°, etc...),
seule l'association TA. viride t Cl. globoswn t Ml. verruearia permet de juguler
le parasite ; le germe antagoniste le plus favorisé sur le moment parvenant à
supplée,r Ci la déficience du ou des autres : T5. viride joue le r6le pri?pondérant
à pH bas (3,50 ; 4,lO) puis sera relayé par Cl. globosm et/ou Ml. verracar4a
- 156 -
3 mesure que le pH est rehaussG vers 6,20 et 7,50.
k méme, Ts. uirride sera relayé par Cl. gZoboswn et,'ou Ml. vermcatia
lorsque la température passe de 20-25°C a 28-30°C ou inversement ; l'associa-
tion des germes antagonistes permettant d'exploiter le phéno&ne de recouvrement
du spectre d'action caractéristique de chaque germe auxiliaire.
Au vu des résultats obtenus avec les preparations fournies par les
germes antagonistes (filtrats de cultures, mi?lange de filtrats de cultures, CO-
nidïes maintenues en suspension dans le liquide de culture, etc..) sur la crois-
'sance mycélienne et la germination des conidies de P. oryzae), compte tenu par
ailleurs de la synthèse bibliographique Idéalisée, nous serions autorisés a prko-
niser -dans une perspective pratique- soit un trempage de semences ou de jeunes
plants de riz, soit une pulvérisation au niveau de l'appareil foliaire, étant
entendu que l'application PREALABLE des germes antagonistes PREMUNIT l'hdte et
partant; lui confere une meilleure r&istance vis-à-vis du Paras:ite.
SYNTHESE DES ABREVIATIONS
CD = Confrontation différée du parasite avec les germes antagonistes
CD x cs = Conjugaison des confrontations différée et simul,tanée du parasite
avec les germes antagonistes
CM1 = Commonwealth Mycological Insti tute
CMS - Conidies (antagonistes) Maintenues en Suspension (dans le liquide de
CU1 tut-e)
(y; = Confrontation Simultanée du parasite avec les germes alntagonistes
D= Distal (e)
F'c z Filtrat de Cultures des germes antagonistes (= FCN)
FCA = Filtrat autoclavé de cultures des germes antagonistes
FCN = Filtrat naturel (:Par opposition à autoclavé) de cultures des germes
antagonistes
H;iODS = Eau distillée stérile
IKP = variété IKONG-PAO
IHAT = Institut de Recherches Agronomiques Tropicales et de Cultures Vivrières
IRRI = International Riice Research Institute
j = Jour
L 2: LUM = lumière
MFCPI = Mélange (volume à volume) de FCA
MFCN = Mélange (volume à volume) de FCN
M/l = mole/litre
MS C = Mélange de SC dans l'eau distillée stérile
o = OBS - obscurité
ORGEJA = Orge-Agar (cf annexe technique no 1)
P
Proximal (e)
??
PADDY/A = Paddy-Agar (cf annexe technique na 1)
PC -.: Poromés de terre-Agar (cf annexe technique no 1)
PCA - Pomme de terre-Carotte-Agar (cf annexe technique no 1)
PUA .= Potatoe-Dextrose-Agar (cf annexe technique no 1)
pH, - pH initial, observe après autoclavage.
cl;[, ::y Diw%tre de la ronde!lle inoculum (6 mm)
!& z.: Variété Sefa
U;eI = Ilî. om~zae (souche I de P. oryzae provenant de la varieté Se 302 G)
1 = Témoin (ZERO)
TG -:: Témoin Global (traduisant l'effet de masse)
FU'B m. RESISTANCE VERTICALE : regroupement de gènes choisis de façon à conférer
à la variété hôte une RESISTANCE ELEVEE vis-à-vis d'un nombre RESTREINT
de races phytopathogènes.
"v RESISTANCE HORIZONTALE : regroupement de gènes choisis de manière à confé-
rer à la variété hdte un LARGE SPECTRE DE TOLERANCE vis-à-vis d'un nombre
ELEVE de races phytopathogènes.
- 159 -
BIBLIOGRAPHIE
ALLEN, PAUL J., (1966). The role of host in the development of disease symp-
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ANNEXES
ANNEXE TECHNIQUE no 1
COMPOSITION DES SUBSTRATS NUTRITIFS UTILISES POUR LA
CULTURE DES GERMES CRYPTOGAMIQUES
1.1 - LE MISAT0 pH 6.5
- Amidon soluble..............
10 9
- Extrait de levures..........
39
- Gélose (éventuellement).....
15 g
- Eau distillée q.s.p.........
1 000 ml
Le pH observé après autoclavage est de 6,5.
1.2 - MILIEU A BASE D'ORGEOSE
- Orgéose................,....
15 9
- Gélose (éventuellement).....
15 9
- Eau distillée q.s.p.........
1 000 ml
L'orgéose est un produit commercialisé par JAMMET et dont les com-
posantes sont : orge, dextrine, maltose, malt, germes de blé, levure, sel.
1.3 - MILIEU A GRAINS D'ORGE CUITS A LA VAPEUR
Sa préparation est rigoureusement identique a celle du milieu a
base de paddy que nous décrivons au paragraphe suivant.
1.4 - PADDY/AGAR
A défaut de chaume de riz, le milieu spécifique par excellence de-
-2-
vrait Hre celui fabriqué avec du paddy ; l'essentiel des substances nutriti-
ves étant fourni par les grains de riz enveloppes par les pieces florales (glu-
mes et glumelles) ; l'ensemble portant le nom de paddy.
Le paddy est trempé une dizaine de minutes et lavé abondamnent à
l'eau distillee afin d'en eliminer les traces de fongicides de conservation.
Il est alors réparti a raison de 150 grains par bo4te de Petri de
diametre intérieur 110 mm.
Parallelement, nous préparons de l'eau gélosée (20 g de gelose par
litre 'd'eau distillée). Apres gonflement, l'eau gélosée est coulée dans la
bo4te de Petri jusqu'au niveau supérieur des grains. Nous portons alors les
boftes de Petri dans l'autoclave réglee à 120" pendant 20 minutes.
L'inoculation des bo4tes a lieu apres refroidissement et solidifi-
cation de la gelose.
1.5 - POMME DE TERRE-CAROTTE-AGAR ou PCA
- Pulpe rapee de carotte........
20 9
- Pulpe rapee de pomme de terre.
20 9
- Gelose (éventuellement).......
20 9
- Eau distillée q.s.p........... 1 000 ml
Ce milieu est preconisé par LANGERON ainsi que le C.M.I.
(Commonwealth Mycological Institute).
l-6 - "POTATOE-DEXTROSE-AGAR"
ou PDA
- Pulpe rapée de pormne de terre.
200 g
- Glucose ........................
20 g
- Agar (eventuellement) .........
20 g
- Eau distillée q.s.p ...........
1 000 ml
1.7 - EXTRAIT DE PADDY
- 20 g de paddy à cuire pendant 30 mn ; broyer et filtrer,
- ajuster le volume à 1 000 ml par de l'eau distillée,
- ajouter 1.5 g de glucose,
- 3 -
- agar = l!j g (éventuellement).
Stériliser 20 mn a 120°C.
1.8 - FORMULE A DU MILIEU SYNTHETIQUE DE TANAKA et KATSUKI (1965)
-
\\--
- Sucrose ........................
1530 9
- NH4 NO3 .......................
190 9
- KH2 P04 .......................
035 9
- K2H P04 .......................
035 g
- MgS04.7 H20 ...................
Os25 9
- CaC12.6 H20 ...................
Os05 g
- FeS04.7 H20 ...................
0,75 mg
- MnS04.5 H20 ...................
0,22 mg
- c u s o 4 . 5 H20 . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
0,60 mg
- ZnC12 .. ..m .....................
7,50 mg
- (NH& Mo7; 024.4 H20 ..........
0,06 mg
- H38O4 .........................
0,09 mg
- Biotine
... ....................
550 IJg
- Thiamine ......................
2,5 mg
- H20 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1 000 g
Au début de nos expériences seulement, nous avons dCi utiliser ce
milieu qui, outre sa complexité, ne présente aucun avantage excleptionnel par
rapport aux milieux naturels 8; pour cette raison et compte-tenu du fait que
notre travail n'est pas spécifiquement axé sur la determination qualitative et
quantitative des exigences trpphiques du parasite, nous n'avons pas jugé uti-
le de le garder.
1.9 - AUTRES MILIEUX PRECONISES DANS LA BIBLIOGRAPHIE
- Solution de TOCHINAI t 1 % de décoction de chaume de riz
- Feuilles de Brachiaria mutica
- Milieu de OGASA-WARA glucosé
- feuilles stérilisees de Pennisetm typhoG%mm STAPT. et
HUBBARD
-4-
ANNEXE TECHNIQUE no 2
COMPOSITION DE LA SOLUTION NUTRITIVE DE KIMURA
S04(NH4)2 ...................
48,2 mg
S04K2 .......................
15,2 mg
SO4Mg .......................
65,9 mg
N03K ........................
18,5 mg
(NOS)2Ca ....................
59,9 mg
P04H2K ......................
24,8 mg
Sesquicitrate de Fe .........
15,0 mg en paillettes
B ..........................
020 ppm
Mn .........................
Os40 ppm
Zn ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?
081 ppm
C U .........................
O,Ol r-m
Mo .........................
W1 ppm
Remarques ::
-
-
-
- il est possible d'ajouter du silicate de sodium,
- 100 plants de riz bons a repiquer exportent environ 1,20 g
d'azote, 0,19 g de phosphore et 0,94 g de potassium.
[cf travaux de la station d'Agronomie de Montfavet, cités par le Professeur MARIE ;
station d'amélioration des plantes, I.N.R.A. Montpellier].
-5-
ANNEXE TECHNIQUE no 3
TEMPERATURE, HIJMIDITE RELATIVE ET HEMEROPERIODE MOYENNES
RELEVEES EN SERRE
Mois Novembre Déc:embre Janvier
Température
- . - -
-
-
-
Humidite
L--------------'--------------
_------------------..
1-..-------*--1
relative
.--
Intensité
Intensif$
héméroperiode,
3 5 000
35 000
3 5 000
3 5 000
3 5 000
héméropériodc
'4h6 pfgy'
lux
'1 ux
lux
l u x
lux
$lCh ";yh
-
-6-
ANNEXE T~~IQUE no 4
TECHNIQUE D'ISOLEMENT DES GERMES CRYPTOGAMIQUES DU RIZ
4.1 - ISOLEMENT DIRECT
4.1.1 - Sans désinfection pr+alable
La m6thode consiste a placer les fragments végetaux (feuille, cou,
grain) en chambre humide disposée a 25°C ou a la température ambiante de labo-
ratoire ; l'examen direct a la loupe binoculaire permet de détecter des colo-
nies que l'on repique isolément et que l'on purifie progressivement.
4.1.2 - Avec désinfection préalable
Avant incubation en chambre humide, le matériel végétal est désin-
fecte soit par le chlorure mercurique 1 %, pendant 3 mn, soit par l'hypochlori-
te de sodium 10 % pendant 10 mn, soit enfin par immersion dans l'alcool éthyli-
que 50 % pendant 3 mn, puis rincé abondamment à l'eau distillée stérile avant
d'&tre séche dansune double epaisseur de papier filtre stérile ; l'incubation
est alors réalisée sur substrat nutritif gélosé à 25'C/obscurité continue.
L'obtention de cultures pures se fait comme précédetmwnt.
4.2 - METHODE DE LAVAGE
Le matériel végétal est agité pendant une heure dans une quantité
définie d'eau distillée stérile ; les organes végétaux serviront à isoler les
germes non détachés par lavage, ; la fraction liquide est diluée plusieurs fois,
chacune de ces dilutions est étalée sur substrat nutritif solide que l'on incube
-7-
a 25"C/obscurité continue.
Il suffit alors d'en suivre l'évolution pour isoler les colonies
pratiquement pures au tout début de leur développement. Il nous faut signaler
l'inconvénient que constitue' pour cette méthode, la présence de germes bacté-
riens difficiles a éliminer.
4.3 METHODE D’IMPRESSION
-
Les organes végétaux sont disposés au fond d'une bo'lte de Petri
stérilisée dans laquelle le milieu gélosé ramené a 40°C est coulé. Apres soli-
dification du milieu, les portions de gélose porteuses d'échantillons sont pré-
levées aseptiquement par decoupage et incubées 2 heures à 25°C ; les fragments
sont alors éliminés et le milieu ainsi inoculé est maintenu à 25°C.
-8-
ANNEXE TECHNIQUE no 5
METHODES DE CONFRONTATION DE P. oryzae AVEC LES GERMES
ANTAGONISTES SUR SUBSTRAT GELOSE
5.1 - CONFRONTATION SIMULTANEE
Le parasite est~directement confronté avec le germe antagoniste.
Dans une bofte de Petri renfermant environ 30 ml de milieu gélose, les 2 inocu-
lats sont disposés a la distance d l'un de l'autre @ = 30 mm dans le cribla-
ge sélectif et d = 20 mm dans les expériences ultérieures] et symétriquement
par rapport au centre de la'bo'lte de Petri.
Le degré d'inhibition de la croissance Riycélienne (du parasite par
le germe antagoniste est évalué par la relation :
MT = croissance mycélienne (définie en cm2 à l'aide du planimetre) du parasite
sur botte de Petri "témoin franc" (= T)
M E = croissance mycélienne (cm2) du parasite confronté avec le germe antagoniste
Mi = pourcentage d'inhibition de la croissance mycélienne du parasite par le
germe antagoniste et par rapport au "témoin franc".
Remarques : - Dans ce type de confrontation, l'inhibition du parasite par le
germe antagoniste fait intervenir tant les dérivés métaboliques de l'antagonis-
me que la non miscibilité éventuelle des mycélia des germes en présence.
- Pour confronter simultanément le parasite avec 2 germes antagonis-
tes, nous avons disposé le P. oryzae au centre de la boite de Petri et les ger-
-9-
mes antagonistes sur un time diametre et symétriquement par rapport au para-
site.
- Pour impliquer simultanement les 3 germes antagonistes, nous
avons disposé le parasite au centre ; les antagonistes étant placés sur 3 rayons
définissant 2 a 2 un angle de 120".
- L'intervention simultanée de 2 ou plus de 2 germes permet de révé-
ler un antagonisme ou une synergie dérivant de la nature des interactions eta-
blies entre les germes en présence.
5.2 - CONFRONTATION DIFFEREE
Le germe antagoniste n'agit que par ses dérivés métaboliques, aucun
contact n'étant établi entre mycelia.
5.2.1 - Préparation du substrat
Le milieu gélosé est tapissé stérilement d'une feuille de cellopha-
ne (no 600 du commerce) découpée à la dimension interne de la bofte de Petri
de 90 mm, La pose de la cellophane, en dépit de sa simplicité apparente est re-
lativement délicate ; en effet, la cellophane se contracte et s'enroule sur
elle-m&ne des son contact avec le substrat gélosé ; le fait de laisser reposer
l'ensemble pendant 5 a 10 mn suffit pour homogéneiser l'hydratation de la cello-
phane et partant, de parfaire l‘étalement.
Il faudra particulierement veiller a expulser la moindre bulle d'air
entre cellophane et milieu nutritif afin d'une part, de ne pas nuire à la régu-
larité du développement de la colonie antagoniste, d'autre part, d'assurer une
répartition homogène des substances diffusibles produites par les germes anta-
gonistes et migrant au travers de la paroi de cellophane pour imprégner le mi-
lieu gelosé.
5.2.2 - Inoculation par le germe antagoniste
Le substrat ainsi préparé est inoculé en son centre par le germe
antagoniste.
L'incubation est réalisée à 25"/obscurité continue pendant
*
48 heures.
- 10 -
5.2.3 - Inoculation par P. oryzae
Au bout de 48 heures, la cellophane ainsi que la colonie antagonis-
te sont éliminées aseptiquement ; l'inoculum parasite est alors disposé à l'en-
droit précis du site d'inoculation du germe antagoniste ; l'incubation est faite
a 25'/obscurité continue.
5.2.4 - Evaluation du pourcentage d‘inhibition
L'inhibition de la croissance en surface du parasite est évaluée
conformément a la relation utilisée au paragraphe 5.1 et par rapport au témoin ;
cependant, étant donné la régularité des colonies, l'inhibition peut @tre esti-
mée en tenant compte de la croissance radiale (mm) du parasite confronté en
différé avec l'antagoniste.
5.3 - CONJUGAISON DES CONFRONTATIONS DIFFEREE ET SIMULTANEE;
Cette technique permet d'associer les deux méthodes précédentes.
Sur un même substrat nutritif, le parasite est confronté en DIFFERE à
Mpothecizunl verruearia et en SIMULTANE à Trichoderma5 viride et/ou Chaetomiwnl
gtoboswn.
5.4 - CONFRONTATION SUR SUBSTRAT GELOSE DU PARASITE AVEC LE FILTRAT DE
- -
CULTURE (naturelou autoclave) OU UN MELANGE DE FILTRATS DE CULTURES LIQUIDES
-
-
DES GERMES ANTAGONISTES
5.4.1 - Obtention de filtrats et mélanges de filtrats de cultures
- -
liquides des germes antagonistes
- Préfiltration : les cultures liquides des germes sont débarrassées des
feutrages mycéliens par préfiltration sur papier filtre PRAT-DUMAS no 1.
- Filtration stérilisante : le filtrat limpide précédemment obtenu est fil-
tré sous vide soit sur BOUGIES CHAMBERLAND 5L5, soit de préférence sur un dispo-
sitif mis au point par la "GELMAN INSTRUMENT COMPANY" ; ledit système comporte
d'une part un entonnoir inox, d'autre part deux membranes filtrantes dont les
pores ont respectivement une dimension de 1,2 microns (membrane supérieure) et
0,2 micron (membrane inférieure). Ces membranes donnent de.meilleurs résultats
- 11 -
lorsqu'elles sont inversées (face supérieure en bas) sur l'ento!nnoir inox.
Les conditions de travail aseptiques garantissent l'obtention d'un
filtrat de culture exempt de tout germe exogène et rigoureusement sterile.
Les liquides recueillis sont utilisés soit isolément, (filtrat de
culture ou FC) soit mélangés volume a volume (mélange de filtrat de culture ou
MFC) ; dans tous les cas, le volume final de chaque type de preparation est
fixe et égal a 12 ml ; chacune de ces préparations est utilisée sous forme na-
turelle ou apres autoclavage (20 mn à 120").
5.4.2 - Préparation du substrat de confrontation
A l'aide d'un emporte-piece sterilisé et de diamètre intérieur 6 mn,
nous aménageons au site d'inaculation (centre de la bofte) une cavité dont la
dimension est telle que la rondelle inoculum du parasite en épouse exactement
la forme.
5.4.3 - Confrontation
Nous plaçons 2 à 3 gouttes du FC ou MFC dans la cav$té que nous re-
couvrons par la rondelle inoculum du parasite (mycelium en haut) ; le liquide
ne doit alors déborder que très peu autour du site d'inoculation ; l'incubation
est réalisée à 25"/obscurite continue. Nous avons suivi l'évolu'tion de la crois-
sance radiale pour divers délais d'incubation.
" 12 -
ANNEXE TECHNIQUE no 6
METHODES DE CONFRONTATION DU PARASITE AVEC LES GERMES
ANTAGONISTES SUR MILIEU LIQUIDE
6.1 - CULTURE DU PARASITE SUR FILTRAT (FC) OU MELANGE DE FILTRATS (MFC)
DE CULTURES (C) LIQUIDES DES GERMES ANTAGONISTES
La préparation des FC ou MFC jouant le role de substrat liquide
pour le parasite obéit aux m&nes règles que celles énoncées au paragraphe 5.4.1
(annexe no 5) ; pour chaque type de préparation, le volume final est fixe et
égal è 30 ml placés stérilement dans un erlenmeyer de 100 ml préalablement sté-
rilisé (20 mn au Four ,Pasteur réglé a 18OOC).
Après inoculation par le parasite, nous incubons a 25"/obscurité
continue pendant 10 jours et évaluons la croissance pondérale en fonction de
la composition de base du substrat liquide.
Afin de détecter l'âge optimum des cultures antagonistes correspon-
dant au maximum d'inhibition de la croissance pondérale de P. o;rgza:e, celles-ci
sont incubées pendant 5, 9 et 29 jours.
6.2 - TECHNIQUE DES ERLENMEYER JUMELES
Il eut été intéressant de tester cette technique qui, mieux que tou-
tes les autres, devrait révéler la dynamique du phénomène ; en raison des con-
traintes matérielles, nous n'avons pu l'expérimenter et nous nous bornerons à
en donner le principe : les deux erlenmeyer sont jumelés par les extrémités ro-
dées de tubulures latérales émergeant à leur base.
Un dispositif de filtres millipores occupant la section des tubulu-
- 13 -
res latérales joue le rble de crible de sélection ne laissant transiter que
des molécules de faible dimension (métabolites notamnent).
Introduire le liquide de culture et inoculer l'un des erlenmeyer
par le germe antagoniste et l'autre par le parasite ; les germes, se développent
chacun dans l'erlenmeyer qui lui correspond ; les métabolites des germes antago-
nistes sont sensés migrer au travers des filtres millipores et imprégner le subs-
trat de culture du parasite dont la croissance ponderale est plus ou moins af-
fectee.
Il serait intéressant de pouvoir associer à ce dispositif un syste-
me d'agitation permanente pour faciliter le flux des substances diffusibles
ainsi que 1"homogénëisation du contenu de chaque erlenmeyer.
Cette methode revient donc à confronter 'kimultanément" antagoniste
et parasite sur milieu liquide.
6.3 - CULTURE DU PARASITE SUR FILTRAT DE CULTURE DE L'ANTAGONISTE
CONFRONTE "SIMULTANEMENT" AVEC LE PARASITE SUR MILIEU LIQUIDE
Dans l'expérience pr&édente, il faut recueillir le liquide de cul-
ture du germe antagoniste ; ce liquide est prefiltti, filtré sterilement et
inoculé par le parasite ; le comportement de ce dernier sur un tel substrat de-
vrait donner une idée des modifications (bénéfiques ou non pour le parasite)
exercées par le parasite sur la culture antagoniste au cours de la confrontation
simultanée.
- 14 -
ANNEXE TECHNIQUE no 7
COMPOSITION DU TAMPON MC ILVAINE
Acide citrique
Phosphate
dissodique
H20
PH
M/l0
12 H20
Ml5
-
196,00 ml
4,00 ml
2 ,2
158,90 ml
41,lO ml
3 ,o
122,90 ml
77,lO ml
4 ,o
106,50 ml
93,50 ml
4 ,6
92,80 ml
107,20 ml
5 ,2
79,lO ml
120,90 ml
5 ,13
61,50 ml
138,50 ml
6 ,4
35,30 ml
164,70 ml
7 ,o
5,50 ml
194,50 ml
8 $0
-e
” 15 -
A N N E X E T E C H N I Q U E no 8
LISTE DES VARIETES HOTES RECOLTEES SUR LE TERRAIN
1 -
ACORN 1
2
-
ARPA SALY
3 -
BALA
4a2a-
BOUAKE Notées Pl a P23
2 7
BRANSA
2 8
CKC
2 9
DELTA
3 0
DJIBELOR-346 D
3 1
DJIBELOR 72-2-74
3 2
DJIBELOR 72-2-75
3 3
DJIBELOR 72-2-76
34
DJIBELOR 72-2-84
3 5
DOURADO PRECOLE
3 6
DUBOVSKY
37
EVIOUKOUE
38
GETU
3 9
IKP
40
IR 442
4 1
IR 528
4 2
KOUELOUAI
4 3
KPF-6
4 4
L-5-26
4 5
L-11-14
4 6
MblR 67-13 a1
- 16 -
4 7
NORIN 21
4 8
SAUNTANE
4 9
SEMBON ASAH 1
5 0
SEFA 302 G
5 1
SEFA 319 G
5 2
SEFA 319 G2
5 3
SEFA 319 G7
5 4
SEFA 322 Glg
5 5
SEFA 272 G
5 6
SEFA 301 D
5 7
SEFA 365 G
5 8
SEFA 66-31-19
5 9
SEFA 497 G
6 0
SEFA 249 D
6 1
SEFA 288 D
6 2
SEFA 314 G
6 3
SEFA 363 G
6 4
SOAVINA
6 5
SR-26 b
6 6
SHINRIKI 11
6 7
TC-1-49
6 8
TAZ'NUNG CHUEN 2 S
6 9
TEP-TEP
7 0
TCHAOYANG no 1
71
TTW
72
UZ ROS 269
7 3
ZEN IT
7 4
6044
75
63-104,XLS/117 B
76
63-104 YLS/160 B
7 7
13 a2X IGC/334
- 17 -
c!\\NNEXE TECHNIQUE no 9
DES 71 PAYS ET ETATS
AFFE 'ES PAR LA PYRICULARIOSE
D'après C.M.I. 1961
AFRIQUE (18)
ASIE (19)
Cbte d'ivoire
Birmanie
Ghana
Borneo
Guinde
Ceylan (Sri-Lanka)
Kenya
Chine
Madagascar
Corée
Malawi
Hong-Kong
Maroc
Inde
Mauritaine *
1 rak
Nigeria
Japon
Ouganda
Java
Republique du Soudan
Malaisie
République Sud Africaine
Pakistan
Rhodésie
Philippines
Sénégal
Sarawak
Sierra Leone
Taiwan (Formose)
Tanzanie
ThaClande
Za'ire
Turquie
Zambie
U.R.S.S. (Asis Centrale)
Viet Nam
* Suite à nos observations : . le terrain, nous avons dû ajouter la République
Islamique de Mauritanie.
- 18 -
AUSTRALASIE - OCEAN1
(5)
AMERIQUE CENTRALE (10)
Australie Occidentale
Costa'Rica
Australie du Nord
Honduras britannique
Queensland
Guatemala
Fidji
Jama'Fque
Hawa'i
Nicaragua
Panama
Porto-Rico
EUROPE (8)
République dominicain,e
Salvador
Bulgarie
Trinite et Tobago
France
Grèce
Hongrie
AMERIQUE dlu SUD (9)
Italie
Arqentine
Portugal
Br&.il
Roumanie
Colombie
Yougoslavie
Guyane britannique
Paraguay
P&rou
AMERIQUE du NORD
Surinam
Uruguay
Mexique
Venezuela
U.S.A.
.,_-_
---
--
--,...--------
..%,.,“.
-m-m.--
.
I
/
I
.C
.
.
9
,
d.
a
I
.
PLANCHE no IA - CRIBLAGE SELECTIF
Confrontation (âgee de 7 j, sur PCA/25"C/obscurité continue) de
PI. o;ryzae avec les germes dont on recherche l'activité antagw
nlque.
En haut de la bolte de Petri, la colonie de PJ. oryzae ; en bas,
celle du germe testé.
1 - PJ. oryzae seul = Témoin
oryaae x Chaetomium gZobosum
oryzae x Trichodema viride
4 - Pl. oryzae x Gonatobotrys sinplex
6 - Pl. ozyzae x PeniciZZium frequentans
7 - Pl. oryzae x Myrothecium verruearia
PLANCHE no IB - CRIBLAGE SELECTIF
-
-
Confrontation (agée de 7 j, sur PCA/Z"C/obscurité continue) de
Pl. oryzae avec les germes dont on recherche l'activité antago-
nique.
En haut de la bofte de Petri, la colonie de Pl. oryzae ; en bas,
celle du germe testé.
a - pl. oryzae x Gonatobotryum macuZicoZum
9 -Pj. oryzae x i?picoccwn purpurascens (Extra.)
10 - PJ. oryzae x Epicoccwn purpzwascens (ITO.)
11 - Pl. oryzae x Altemuria duuci
12 - Pl. oryzae x GZiocZadiwn roseum
13 - Pl. oryzae x PuZZuZaria (Aureobasidiwn) pu1 ZuZans
_- ._._-
----^
. . . . . . .
--‘lll)llfur
--.-17--
PLANCHE n" IC - CRIBLAGE SELECTIF
Confrontation (âgée de 7 j, sur PCA/25°C/obscurité continue) de
Pi. oryzae avec les germes dont on recherche l'activité antago-
nique.
En haut de la botte de Petri, la colonie de PI. oryzae ; en bas,
celle du germe testé.
1 - Pl. oryzae X CumZaria lutta
2 - Pl. oryzae X CurvuZaria c’lavata
oryzae X Fusar-ium roseum
; 1;;: oryzae X Coniothyrium minitans
5 -Pp oryzae x Asper&Zlus niger
6 - PJ. oryzae x DrechsZera rostrata
7 - Pl. oryzae x Coniothyrim minitans
8 - Pl. oryzae x Starkeyomyces koorchaZomo$des
PLANCHE no II - PyticuZaK~tloryzae
Confrontation simultanée (agée de 7 j, sur PCA/25*C/obscurité
continue) avec les germes antagonistes.
En haut de la botte de Petri, la colonie de PJ. ozyzae ; en bas,
celle du germe dont on évalue l'activité antagonique.
A - pHo 3,50
B - pH0 5,55
w - obscurité continue
1 - PI. oryzae x 0 - Témoin
2 - PI. o r y z a e x T5. viraide
3 - PJ. oryzae x Cl. gtoboswn
4 -"Pl. oryzae x Ml. verrwaria
PLANCHE no IIIA -
-
Pyricu Zarial oryzae
Morphoses affectant le mycélium au cours d'une confrontation simul-
tanée (dgée de 3 j/250C/PCA/pHo 3,50/obscurité continue) avec les
germes antagonistes ; les préparations sont issues de la région
proximale de la colonie du parasite.
A - Pl. oryzae x T4. uiride (GX 1440) : cellules rrlycéliennes
fortement épaissies , se désarticulant facilement, intensé-
ment colorables par le bleu coton ; faciès global de '"bal(ai
de sorcière".
B- Pl. oryzae x T5. uiride (GX 1440) : filament mycélien
contourné.
C - PJ. oryzae x Cl. gZoboswn (GX 2160) : hélice
D - Pl. oryzae x CI. gZoboswn (GX 2160) : torsades
PLANCHE no IIID - PyricuZatial oîyzae
Morphoses affectant le mycélium au cours d'une confrontation simul-
tanée (agée de 3 j/25*C/PCA/pHo.5,55/obscurite
continue) avec les
germes antagonistes.
Les préparations microscopiques sont issues de la région proximale
de la colonie du parasite (par rapport a celle antagoniste).
E - PJ. oryzae x TT~. titi& (GX 1440) : filament mycelien
contourné sur lui-m&ne
F - .PI. oryzae x Tg. uitide (GX 2160) : "torsades"
G - RI. oryzae x T5. uitide (GX 2160) : hélice
H
Pl. oryzae x T5. vitic?e (GX 2160) : filament mycélien
enroulé en pelote terminale
1 - PJ. oryzae x Ml. oermcm-ia (GX 2160) : filaments mycéliens
dont la configuration rappelle étrangement les torons du DNA.
PLANCHE no IV - PyricuLutial oryzae
Confrontation différée (8gee de 7 j/25"C"PCA/obscurité
continue)
avec les germes antagonistes.
A = PH, 3965
B = pH, 6,20
1 = Pl. 02yzae seul (témoin)
2 = PJ. oryzae en différG avec T5. virile
3 = PJ. oryzae en différé avec Cl. globoswn
4 = PJ. oryzae en différé avec Ml. vermcaria
PLANCHE no 'v - Pyr-icuZaria~ oryzae
Morphoses affectant le mycélium au cours d'une confrontation dif-
férée N(agée de 6 j/PCA/25OC/pH, 3,65/obscurité continue)
A - PJ* ozyzae en différe avec T5. vh-ide (GX 1440) :
cellule mycélienne intermédiaire hypertrophiée.
B - Pl. oryzae en différé avec Cl. globosum (GX 1440) :
fillament mycelien contourné sur lui-m&ne en "jambe de chien".
c - Pl. oryzae en différé avec Ml. verruearia (GX 1440) :
faciès de "balai de sorcière".
PLANCHE no Y1 -
Action Conjugu&e de confrontations différée (= X) (par rapport a
Ml. ue~ywxw&z) et simultanée (=X) (par rapport a Tg. uitide S/ou-
CI. globoswn) sur la croissance wcélienne de Pl. ozyzne.
-
7 jours d'incubation sur PCA/25*C/pH, 4,lO/obscurité continue.
T1 = "témoin franc"
T2 = Pl. orpae en différé avec Ml. verrucaria
El = Essai comportant (M . verruc~a) X (Pl. oryzae x T5. viride )
E2 = (Ml. uerrucaria) X tPl. ozyzae x Cl. gZobosum)
E3 = (E41. verrucaria) X (Pl. oryzae x T5. tdtide et Cl. glaboswn)
PLANCHE no VII -
Action conjuguée des confrontations différée (= X) (par rapport d
MI. verracaria) et simultanée (= X) (par rapport a T5. uiy~isde et/ou
Cl. ghboswn) sur la croissance de Pl. oryzae.
-
-
7 jours d'incubation sur PCA/25"C/pHo 6,0/obcurité continue.
T1 = "témoin franc"
T2 = PJ. oryzae en diff&+ avec Ml. vermccaz-da
El = essai comportant
verrucatia) X (PI. oryzae x T5. viride)
E2 = (Ml. verwmzria) X Pl. oryzae x Cl. gtoboswn)
E3 = (Ml. verrucaria) X
oryzae x T5. viride et Cl. gLoboswn)
PLANCHE no VIIIA - Pp-icularial oqzae
Confrontation fongicide-tqycélium ; 7 jours d'incubation sur PCA/
25"C/obscurité continue.
A - Croissance qycélienne en présence de BENOMYL
B - Croissance mycélienne en présence de CHLORONEBE
NB - les concentrations sont exprimi?es en nombre de mole/l.
MCHE no VII IB - PyricuZari~ orpae
Confrontation fongicides-mycelium
; 7 jours d'incubation sur PCA/
25"C/obcurité continue.
A - Croissance mycélienne en prhence de EL-291
B - Croissance mycélienne en prhence de TRIDEMDRPHE
NB - Les concentrations sont exprimees en nombre mole/l.
PLANCHE na Ix - PYRICULARIOSE DU COU
Une,att+que grave de la base de la panicule perturbe l'appro-
visionnement des grains qui se trouvent soit vidés de leur conte-
nu, soit sous-développés.
A et B - varieté IKP
C
- variété ROS 269
Remarquer l'aspect "blanc crémeux" des panicules.
PLANCHE no XA - D'après SH OU : “RICE DISEASES”
A - Observation (après élimination des bordures) de pyriculariose
sur variétés résistantes et sensibles plantées en pépinière.
B- Lésions foliaires observées sur variété résistante (a gauche)
moyennement résistante (au milieu) et sensible (à droite).
C - Pyrîculatia oryzae Cav. : conidies et conidiophores (GX 500).
PLANCHE no XB - D‘après S.H. OU : "RICE DISEASES"
A- Réaction prkoce d'une variété résistante (GINNEN) contre
l‘infection par P. oryzae.
B '- Réaction tardive d'une variété sensible (KAIRYOSHINRIKI) contre
l'infection par P. oryzae.
C a- Apparition de substances apparentées aux résines dans les
tissu:5 nécrotiques d'une variété résistante après infection.
D - Cas des tissus d'une variété sensible.
E- Conidie de P. owzae vue au microscope électronique (GX 10 000).
Chaque cellule possède un noyau comportant 2 types de granu-
lés dont le type gros correspond aux nucléoles ; le pore, les
mitochondries et d'autres organites sont également visibles.
-
THESE
présentée
A L’UNIVERSITE PAUL SABATIER DE TOULOUSE
pour obtenir le grade de
DOCTEUR INGENIEUR
Abdou1 Aziz S Y
CONTRIBUTION A L’ETUDE DE
PYRICULARIA ORYZAE CAV.
- M O R P H O L O G I E , B I O L O G I E E T P H Y S I O L O G I E -
RECHERCHE IN VITRO D’ANTAGONISTES
DANS UNE PERSPECTIVE DE LUTTE BIOLOGIQUE
.Soutenue le 30 juin 1976 devant la commission d’examen :
M. C. HAMANT
Président
Me”c J. BERDUCOU
I
MM. L. ALBERTINI , bm-ninateurs
C .TOROSSIAN
\\
*I--l-----
--.-------
-.__.-_
--.
..~-~,
Tout au long de mon expérience au Laboratoire de Cytologie et
Pathologie Végétales de 1'E.N.S.A. Toulouse, j'ai bénéficié de l'attention,
de la disponibilité et de la confiance de Monsieur le Professeur HAMANT qui
a véritablement été l'initiateur du présent travail ; il a toujours su motiver
ma curiosité intellectuelle et aiguiser mon esprit critique ; je voudrais ici
lui exprimer ma sincère reconnaissance et mon respectueux attachement.
Mademoiselle BERDUCOU, professeur, dont j'ai gardé un très bon
souvenir apres 3 années de scolarité à 1'E.N.S.A.T.; me fait honneur en accep-
tant de participer à la commission d'examen ; je l'en remercie très vivement.
J’adresse ma profonde reconnaissance à Monsieur ALBERTINI, Ma4tw
Assistant,avec qui j'ai pu avoir des échanges enrichissants et dont les précieux
conseils m'ont été d'une grande utilité.
Monsieur TOROSSIAN, Ma4tre-Assistant, dont j'ai eu à apprécier les
qualités humaines et pédagogiques , m'a consacré un temps inestimable pour la
confection de documents photographiques ; je suis particulierement sensible à
l'honneur qu'il me fait en acceptant de participer à mon jury de thèse ; qu'il
trouve ici le gage de ma profonde gratitude.
Je remercie tout particulièrement Madame PAVILLARD, Assistant,
pour ses marques de sympathie ainsi que sa disponibilité permanente.
J’assure Monsieur LACOMBE, Assistant, de toute ma reconnaissance
pour le temps qu'il m'a consacré et ses précieux conseils afférents aux tests
statistiques.
Mademoiselle JEREMIE, dont j'ai beaucoup apprécié la patience, a
consenti un effort et un soin inestimables pour la dactylographie de la présente
thèse, je tiens à lui témoigner ma très sincère reconnaissance.
Monsieur GUERMQUCHE, ainsi que ses collègues de service, m'ont tou-
jours réservé un accueil agréable ; je les remercie du fond de moi-méme pour
l'intérét constant qu'ils portèrent à la reproduction de mon mémoire.
Mes remerciements vont également à Monsieur LAUGA, dont l'aide tech-
nique m'a procure un grand soulagement.
Je remercie Monsieur le Professeur MARIE de la Station d'Amélioration
des Plantes de Montpellier pour les informations utiles qu'il a bien voulu me
donner concernant les conditions de culture du riz sous serre.
Que l'ensemble du personnel technique et administratif de
l'E.N.S.A.T., et tous mes camarades de laboratoire soient ici remerciés pour l'a-
mabilité qu'ils surent me réserver.
Je remercie enfin tous mes camarades et amis auprès de qui j'ai
toujours trouvé un soutien sans limite.
S O M M A I R E
Pages
INTRODUCTION. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . m
1
- PREMIERE PARTIE -
CARACTERES DESCRIPTIFS, BIOLOGIE ET PHYSIOLOGIE DE
Pyrdcularia oryzae CAV. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . e
5
CHAPITRE PREMIER - ISOLEMENT ET PURIFICATION DE P. ozyzae,
ETABLISSEMENT DE CULTURES MONOCONIDIENNES, CYCLE EVOLUTIF DU
PARASITE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
6
1 - ISOLEMENT ET PURIFICATION DE P. oryzae . . . . . . . . . .
6
1.1 - Le matériel végetal
. . . . . . . . . . . . . . . .
6
1.2 - Révélation du parasite. . . . . . . . . . . . . . . .
6
1.3 - Isolement et purification : obtention de cultures
pures . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
7
II - ETABLISSEMENT DE CULTURES MONOCONIDIENNES . . . . . . . .
8
2.1 - Préliminaire. . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
8
2.2 - Méthode de dilution . . . . . . . . . . . . . . . .
9
2.3 - Méthode de la dilution améliorée. . . . . . . . . .
10
III - CYCLE EVOLUTIF DE L'AGENT PATHOGENE. . . . . . . . . . .
1 1
3.1 - Prélim naire . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1 1
3.1.1 - Remarque . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1 1
3.1.2 - Conservation des souches . . . . . . . . . .
1 1
3.2 - I n f e c t on de l'ht3te . . . . . . . . . . . . . . . .
1 2
3.2.1 - L'hbte . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
12
3.2.2 - L'inoculum . . . . . . . . . . . . . . . . .
13
3.2.3 - Technique d'inoculation. . . . . . . . . . .
1 3
3.2.4 - L'infection. . . . . . . . . . . . . . . . .
13
3.3 - Symptbmes de la pyriculariose . . . . . . . . . . .
1 4
3.3.1 - La pyriculariose foliaire ou "LEAF BLAST". .
1 4
3.3.2 - La pyriculariose du cou. . . . . . . . . . .
15
3.3,.3 - Notations en serres après inoculation
artificielle . . . . . . . . . . . . . . . .
16
3.4 - Dissémination . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
16
3.5 - Longévité . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
17
SHAPITRE DEUXIEME . CARACTERES DESCRIPTIFS DE PyricuZatiaI
oryzae CAV.. * . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1 8
I- CARACTERES MORPHOLOGIQUES ET CYTOLOGIQUES DE L'AGENT
PATHOGENE. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1 8
1.1 - Le conidiophore . . . . . . . . . . . . . . . . . .
18
1.2 - Les conidies. . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1 9
1.3 - Caracteres cytologiques . . . . . . . . . . . . . .
21
II - CARACTERES CULTURAUX EN FONCTION DU MILIEU. . . m . . . .
2 2
2.1 - Morphologie de la culture . . . . . . . . . . . . .
2 2
2.2 - Lemycélium . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2 3
2.3 - Le revers des cultures. . . . . . . . . . . . . . .
2 3
HI1 - CARACTERES CULTURAUX EN FONCTION DE LA TEMPERATURE . . u
2 3
I V - CARACTERES CULTURAUX EN FONCTION DU pH (tampon Mc Ilvaine,
annexe technique no 7). . . . . . . . . . . . . . . . . u
2 4
CHAPITRE TROISIEME -
-
-
BIOLOGIE ET PHYSIOLOGIE DE PyrieuZaria~
oryzae CAV.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2 5
1 - PARAMETRES DE LA CROISSANCE DE PJ. oryzae. . . . . . . . .
2 5
1.1 - Préliminaire.
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
25
1.2 - Paramètres trophiques . . . . . . . . . . . . . . .
2 6
1.2.1 - Nature des milieux utilisés. . . . . . q , .
2 7
1.2.2 - Définition de l'inoculum . . . . . . . e . .
2 7
1.2.3 - Résultats. . . . . . . . . . . . . . . e , .
2 7
1.2.3.1 - Croissance en milieu solide . . . . .
2 7
1.2.3.2 - Croissance en milieu liquide. . . . .
28
1.2.4 - Expression des résultats : discussion. I . .
2 9
1.3 - Action de la température. . . . . . . . . . . . . .
3 3
1.3.1 - Résultats. . . . . . . . . . . . . . . . . .
3 3
1.3.2 - Expression graphique : interprétation. . . .
3 3
1.4 - Action de l'héméropériode . . . . . . . . . . . . .
3 5
1.4.1 - Résultats. . . . . . . . . . . . . . . . . m
3 5
1.4.2 - Expression graphique : discussion. . . . m .
3 7
1.5 - Action du pH sur la croissance de PJ. ozyzae. . * .
37
1.5.1 - Résultats. . . . . . . . . . . . . . . . . *
37
1.5.2 - Expression graphique des résultats :
discussion . . . . . . . . . . . . . . . . .
3 8
1.5.2.1 - Préliminaire. . . . . . . . . . . . .
3 8
1.5.2.2 - Analyse des courbes traduisant la
croissance pondérale en fonction du
p H . . . , . . . . . . . . . . . . . .
3 9
1.5.2.3 - Analyse des courbes traduisant le
phénomène d'autolyse. . . . . . . * .
45
1.5.2.4 - Régularisation du pH. . m . . . . . .
4 5
1.5.2.5 - Croissance radiale du parasite en
fonction du pH. . . . . . . . . . . .
4 6
II - PARAMETRES DE LA CONIDIOGENESE DE PyricuZarial oryzae . .
4 6
2.1 - Influence du milieu sur la conidiogénèse. . . . . .
48
2.1.1 - Précocité de la sporulation. . . . . . . . .
48
2.1.2 - Caractéristiques des conidies en fonction
du milieu. . . . . . . . . . . . . . . . . .
48
2.2 - Influence de la température sur la conidiogénèse. .
4 9
2.3 - Influence du pH sur la conidiogénèse. . . . . . . .
50
2.3.1 - Sur la précocité de la conidiogénèse . . . .
50
2.3.2 - Intensité de la conidiogénèse en fonction
dupH....................
5 2
2.3.3 - Caracteres des conidies en fonction du
pH.......... , . . . . . . . ..e
5 2
2.3.4 - Cinétique de la sporulation. . . . . . . . .
5 5
III - PROBLEMES RELATIFS A LA GERMINATION DES CONIDIES . . . .
5 6
3.1 - Germination en relation avec la concentration
conidienne : rbultats, expression, discussion. . .
5 7
3.2 - Germination des conidies en fonction de la
température : résultats, expression, discussion . .
58
3.3 - Germination des conidies en fonction du pH :
résultats, expression, discussion . . . . . . . . .
5 9
3.4 - Germination des conidies en fonction de l'hémé-
ropériode : résultats, expression, discussion . . .
6 0
- DEUXIEME PARTIE -
CONTRIBUTION A L'ETABLISSEMENT D'UNE METHODE DE LUTTE BIOLOGIQUE
CONTRE FyticuI-aria oryzae CAV . . . . . . . . . . . . , . a . . . .
6 2
CHAPITRE PREMIER - DEFINITION DU MATERIEL BIOLOGIQUE ET CRIBLAGE
SELECTIF DES GERMES SAPROPHYTES. . . . . . . . . . . . . . . .
67
1 - GERMES CRYPTOGAMIQUES. . . . . . . . . . . . . . . . . a .
6 7
1.1 - Fyticularia~ oryzae CAV. . . . . . . . . . . . w .
6 7
1.2 - Germes saprophytes isolés a partir du riz . . . . .
6 7
1.3 - Germes fournis par BAARN. . . . . . . . . . . . . .
68
II - CRIBLAGE SELECTIF EN VUE DU CHOIX DES GERMES UTILISA-
BLES DANS UNE PERSPECTIVE DE LUTTE BIOLOGIQUE
(Planche no 1). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
6 8
III - GERMES SELECTIONNES. . . . . . . . . . . . . . . . e . .
72
CHAPITRE DEUXIEME - MISE EN EVIDENCE DU PHENOMENE D'ANTAGONISME
-
-
in vitro . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
73
1 - PRELIMINAIRE . . . . . . . . . . . . . . . s . . . . . . .
73
1.1 - Comportement des germes en fonction de la
température . . . . . . . . . . . e . . . . .
. .
74
??
1.2 - Comportement des germes en fonction de
l'héméropériode . . . . . . . . . . . . . . .
. *
77
??
1.2.1 - Résultats. . . . . . . . . . u . . . . . . .
78
1.2.2 - Caractères descriptifs en fonction de
l'héméropériode. . . . . . . . . . . . . . .
79
1.2.3 - Expression graphique . . . . . . . . . . . .
79
1.3 - Comportement des germes en fonction du pH . . . . .
79
1.3.1 - Formulation des résultats. . . . . . . . . .
a4
1.3.2 - Caracteres descriptifs en fonction du pH
après 3 jours d'incubation . . . . . . . . .
a4
1.3.3 - Expression graphique . . . . m . . . . . . .
a5
1.4 - Synthese. . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. .
a5
II - EXPERIENCE DE MISE EN EVIDENCE DU PHENOMENE D'ANTAGO-
NISME in vitro : CONFRONTATION SIMULTANEE (CS) DU
PARASITE AVEC LES GERMES “ANTAGONISTES” . . . . . . . . .
a7
2.1 - Appréciation de l'inhibition (%) exercée par les
germes antagonistes sur la croissance radiale
(mm) dePI. oryzae. . . . . . . . . . . . . . . . .
a7
2.X.1 - Caractères descriptifs . . . . . . . . . . .
88
2.1.1.1 - Examen macroscopique (Planche no II).
88
2.1.1.2 - Examen microscopique (Planche no III).
90
2.1.2 - Expression graphique des résultats
(fig. 16 A et C) : interprétation. . . . . .
91
2.2 - Appréciation de l'inhibition (%) exercée par les
germes "antagonistes" sur la croissance en sur-
face (cm2) de PJ. oryzae . . . . . . . . . . . . . .
93
2.2.1 - Résultats. . . . . . . . . . . . . . . . . .
93
2.2.2 - Expression numérique des résultats . . . . .
94
2.2.3 - Signification. . . . . . . . . . . . . . . .
94
2.3 - Expression graphique des résultats : discussion . .
95
2.3.1 - Analyse comparative des pourcentages d'inhi-
bition relative des croissances radiale (mm)
et en surface (cm2) de PI. oryzae confronté
durant 5 et 7 jours aux germes "antagonistes"
(cf fig. 16, diagrammes A-C et B-D respec-
tivement). . . . . . . . . . . . . . . . . .
95
2.3.2 - Evolution du pourcentage d'inhibition de la
croissance en surface (cm2) de Pl. oryzae
exercée par les germes "antagonistes" en
fonction du temps ; PCA/25OC/pour 2 valeurs
de pH/obscurité continue . . . . . . . . . .
98
2.3.3 - Représentativité de chacune des methodes . .
98
2.4 - Remarques . . . . . . . , . . . . . . . . . . . . .
98
CHAPITRE TROISIEME - ESSAI D’INTERPRETATION DU PHENOMENE D’ANTA-
GONISME in uitm . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
103
I- REMARQUE PRELIMINAIRE. . . . . . e . . . . . . . . . . . ,
103
II - CONFRONTATION DU PARASITE ET DES GERMES ANTAGONISTES SUR
MILIEU SOLIDE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
104
2.1 - Confrontation différée du parasite avec les
germes antagonistes . . . . . . . . . . . . . . . .
104
2.1.1 - Résultats. . . . . . . . . . . . . . . . . .
104
2.1.2 - Observations . . . . . . . . . . . . . . . .
105
2.1.2.1 - Examen macroscopique (Planche no IV).
105
2.1.2.2 - Examen microscopique (apres 6 jours
d'incubation ; planche no V). . . . .
105
2.1.3 - Expression numérique des résultats . . . . .
106
2.1.4 - Expression graphique : discussion. . . . . .
106
2.2 - Conjugaison des confrontations simultanée et
différée (CS x CD) du parasite avec les germes
antagonistes (Planches no VI et VII). . . . . . . .
109
2.2.1 - Résultats. . . . . . . . . . . . . . . . . .
109
2.2.2 - Expression numérique des résultats . . . . .
1 1 0
2.2.2.1 - Relativement au témoin
Tl = PJ. oryzae x 0 . a . . . . . . .
1 1 0
2.2.2.2 - Relativement à T2 = Sel X (3) . . . .
110
2.2.3 - Expression graphique (fig. 20) :
discussion . . . . . . . . . s . . . . . . .
111
2.2.3.1 - Par rapport à Tl. . . . . . . . . . .
111
2.2.3.2 - Par rapport à T2. . . . . . . . . . .
113
2.3 - Essai de mise en évidence de la production d'anti-
biotiques en milieu liquide . . . . m . . . . . . .
1 1 4
2.3.1 - Résultats. . . . . . . . . . . . . . . . . .
194
2.3.2 - Discussion . . . . . . . . . . . . . . . . .
116
III - CONFRONTATION DU PARASITE ET DES GERMES ANTAGONISTES SUR
MILIEU LIQUIDE : CROISSANCE PONDERALE (mg) DU PARASITE
INCUBE SUR FILTRAT OU MELANGE DE FILTRATS DE CULTURES
DES GERMES ANTAGONISTES. . . . . . . . . s . . . . . . .
117
3.1 - Résultats . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
118
3.2 - Expression numérique des résultats. . . . . . . . .
119
3.3 - Expression graphique (fig. 21 et 22) : discussion .
119
3.3.1 - Relativement au pH, 4,lO . . . . . . . . . .
119
3.3.2 - Relativement au pH0 6,D. . . . . . . . . . .
122
3.3.3 - Remarques.
. . . . . . . . . . . . . . . . .
123
IV - INFLUENCE DE L’ANTAGONISTE SUR LA GERMINATION DES CONIDIES
DU PARASITE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . <I
. .
125
4.1 - Action de la suspension conidienne (SC) et du
mélange de SC (dans l'eau distillée) des antago-
nistes sur la germination du parasite . . . . . . .
126
4.1.1 - Préliminaire . . . . . . . . . . . . . . . .
126
4.1.2 - Résultats et expression numk ique. . . . . .
128
4.1.3 - Expression graphique (fig. 23 et 24) :
discussion . . . . . . . . . . * . . . . . .
128
4.2 - Action des filtrats "naturels" (FCN) et filtrats
autoclavés de cultures (FCA) des germes antagonis-
tes sur la germination des conidies de PJ. oryzae .
132
4.2.1 - Résultats et expression numérique. . . . . .
132
4.2.2 - Expression graphique : discussion. . a . . .
132
4.3 - Influence du mélange de filtrats "naturels" (MFCN)
ou autoclavés (MFCA) des cultures antagonistes agées
de 10 j/25"C/obscurité continue sur la germination
des conidies de Pl. oryzae. . . . . . . s . . . . .
136
4.3.1 - Résultats et expression numérique. . . . . .
136
4.3.2 - Expression graphique (fig. 27 et 28) :
discussion . . . . . . . . . . . . . . . . .
136
4 . 4 - Influence des conidies antagonistes maintenues en
suspension dans le liquide de culture (CMS) sur la
germination des conidies du parasite. . . . . . . .
140
4.4.1 - Résultats et expression numérique. . . . . .
141
4.4.2 - Expression graphique : discussion. . . . . .
142
4.5 - Remarques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
142
CHAPITRE QUATRIEME - ELEMENTS DE REFERENCE : ACTION DE QUELQUES
FONGICIDES SUR LA CROISSANCE MYCELIENNE DU PARASITE. . . . . .
144
1 - EXAMEN MACROSCOPIQUE (cf planches no VIIIA et VIIIB) . . .
144
1 . 1 -Bénomyl . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
144
1.2 - Chloronèhe.
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
145
1.3-EL-291.......................
145
1.4 - Tridémorphe . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
145
II - R E S U L T A T S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
146
III - EXPRESSION NUMERIQUE : DISCUSSION. . . . . . . . . . . .
147
CONCLUSION GENERALE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
150
SYNTHESE DES ABREVIATIONS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
157
BIBLIOGRAPHIE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
159
ANNEXES TECHNIQUES. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
173
PLANCHES PHOTOGRAPHIQUES
INTRODUCTION
Du fait de l'accroissement de la consommation de riz dans le monde,
de nombreux cultivars hautement productifs ont été mis au point dans le sud-est
asiatique notamment ; ces cultivars ont cependant dû @tre progressivement délais-
sés en raison de leur sensibilité à la pyriculariose.
Connue par le passé sous le terme de "fièvre du riz" usité dans la
littérature chinoise et japonaise , successivement décrite par TSUCHIYA (1.704),
MIAYANAGA (1788), KOJIMA (1793)) KONISHI (1809)) la pyriculariose a en realité
eté signalée depuis 1637 en Chine par SOONG YING-SHIN dans son ouvrage intitule
"Utilisation des ressources naturelles".
En Italie, la maladie alors connue sous l'appellation de brusone
-
-
fut décrite par ASTOLFI (1828), BRUGNATELLI (1838) et GERA (1846).
METCALF (1906, 1907) au vu de l'intensité des dégâts engendrés par
la pyriculariose en 1876 dans le sud de la Caroline, la dépeignit comme étant
la plus grave parmi les 8 maladies importantes répertoriées sur le riz aux
U.S.A.. Il fut le premier à lui attribuer la dénomination anglaise de "blast'".
En Inde enfin, la présence de la maladie daterait de 1913 ; l'épidé-
mie catastrophique observée dans l'état de Madras en 1919 serait imputable a
i'agent de la pyriculariose (PADMANABHAN, 1965).
En raison de sa plasticité par rapport aux conditions du milieu, de
son spectre de répartition et des attaques graves engendrées par l'agent patho-
@ne 5 la pyriculariose est considérée comme étant la principale maladie du riz
dans le monde.
-2-
Les recensements du C.M. 1. ("Commonwealth Mycological Institute")
de Ig7'l!, rëvelent sa présence dans 70 pays des cinq continents (cf annexe
no 9).
Dans le cas particulier du Sénégal, la pyriculariose semble coloni-
ser des régions de plus en plus vastes :
- 1951, CHEVAUGEON (cité par BOUHOT et MALLAMAIRE dans "les principales
maladies des plantes cultivées au Sénégal") établissait la rareté de la maladie.
- 1972, l'I.R.A.T. la définit comne étant "la principale maladie cryptoga-
mique du riz au Sénégal"(cf "les variétés de riz au Sénégal" - juillet 1972).
- Mai 1974, nous avons isolé et purifié le parasite à partir de la variété
L.5.26 récoltée à SAVOIGNE (delta du fleuve Sénégal) ; cette région nord-ouest
du pays etait jusqu'alors exempte de germes infectieux.
- Octobre 1974 enfin, nous observons des infections paniculaires dans les
parcelles de ROSSO en Mauritanie ; l'introduction de la riziculture datait seu-
lement de quelques années (à l'origine, il y aurait eu notamment une importation
de semences infectées).
La persistance et l'extension de la maladie ne sont donc plus à dé-
montrer tant sur le territoire sénégalais que dans le monde.
Les pertes et dégâts occasionnés par la maladie sont considérables ;
quelques chiffres suffisent pour nous en convaincre :
- Au Japon, en 1953, les pertes étaient évaluées à 800 000 tonnes.
- Durant la campagne agricole 1960-1961 en Inde, les pertes s'élevèrent à
266 000 tonnes.
-' En 1960, au Japon, les pertes furent estimées à 273 000 tonnes (soit
24,8 % du total des pertes dues aux insectes, au froid, au typhon, aux inonda-
tions et maladies diverses).
- De méme en 1962 (toujours au Japon), sur 909 000 ha traités chimiquement,
l'infection paniculaire eut malgré tout lieu sur 721 000 ha.
- Au Sénégal, en octobre 1974, nous avons été amenés à observer le grillage
foliaire très précoce affectant la variété 6044 sur près de 44 ha (MEDINA SANGAKO
au SINE-SALOUM).
-3-
L'attaque foliaire pendant ou avant le tallage peut ~!eterminer la
destruction complè,te de l'hôte (cf planche n*XA) '; moins précoce, elle engendre
malgré tout un rabougrissement des plantes, une réduction du nombre de p-anicu-
les mures ainsi qu'une diminution du poids de 1 000 grains.
L'infection paniculaire est d'autant plus catastrophique qu'elle est
précoce,
L'attaque du cou aboutit à une profonde altération qualitative et
quantitative des grains (cf planche no 9).
L'agent phytopathogène, baptisé pour la première fois QricuRzria
oryzae par CAVARA en 1891 (Italie) fut décrit par SHIRAX en 1896 (Japon).
L'espece PyrimZaria oryzae Cav. se définit selon le diagrarrme
suivant :
- Classe des Champignons,
e- Groupe des Adelomycètes (champignons imparfaits),
- Ordre des Moniliales,
- Famille des Mucedinacées,
-- Gen w Pyricularia.
L'amélioration des resistances verticale ou horizontale de l'hôte,
l'influence du type de fertilisation et le rôle des techniques culturales sur
les relations hôte-parasite, l'action des facteurs physiques (température, humi-
dité, lumière, etc...) et chimiques (oxygene, etc...) du milieu sur le parasite,
la chimiothérapie, l'étude des mécanismes agressifs de l'agent pathogène, la
multiplicité des races physiologiques, etc..., sont autant de thèmes importants
préoccupant les chercheurs pour une meilleure connaissance et partant, un meil-
leur contrôle des relations hôte-parasite.
A ce jour cependant, aucune solution définitive n'a été trouvée au
problème de la pyriculariose en raison notamment de la très forte variabilité
de l'agent pathogène (PARTHASARATHY et OU, 1965) ; peu de choses ont été tentées
dans le domaine de la lutte biologique ; on sait seulement que des souches avi-
rulentes du parasite, préalablement inoculées sur l'hôte pouvaient induire une
meilleure tolérance voire une meilleure résistance de celui-ci vis-à-vis d'une
souche virulente (YOSHII, 1950 ; KIYOSAWA et FUJIMAKI, 1967).
-4-
Nous nous proposons, dans la présente etude, d'apporter une modeste
contribution pour combler ce que nous osons appeler une lacune.
La lutte biologique, impliquant des organismes vivants est évidem-
ment des plus complexes, des plus délicates yuisqire les composantes fondamenta-
les en sont :
- la recherche de germes antagonistes,
.- la définition de l'action des germes considerés sur tous les élëments
de la biosphère : l'antagoniste, outre son action contre le parasite, ne doit
manifester aucune influence néfaste,directe ou indirecte sur 1 "hbte, les vegétaux
u,tiles du milieu, l"homne:, les animaux, l'envsronnement de façon genérale,
- l'étude du mécanisme du phénomene d'antagonisme,
- la définition des conditions d'application (temperature, humidité, etc...)
et d'efficacité,
- Tes problèmes économiques posés par Ta vulgarisation.
.
La première partie de ce travail traitera de la morphologie, la bio-
logie et de la physiologie du parasite ; 1"objet de ?a deuxieme partie étant la
mise en évidence du phénomène d'antagon9sme ainsi que de l"essai d'interpréta-
tion des mécanismes impliqués.
Quant au matériel biologique de base, a1 comporte :
- Les variétés hotes :
.__
.-
les échantillonnages ont e?;é réalisés soit en plein
champ, soit en parcelles expérimentales au cours de prospections effectuées au
Senégal et en Mauritanie au cours des campagnes agricoles 1973 et 1974 ; au to-
tal, nous avons observé, noté et récolté 77 varlétes dont la liste est con,si-
gnée dans l'annexe pIo 8.
- Les germes cryptogamiques : classés dans le tableau 118 et le paragraphe
1.3 de la deuxieme partie (p. 68).
~ÈRE
P A R T I E
CARACTERES DESCRIPTIFS,
BIOLOGIE ET PHYSIOLOGIE DE
P~r7kuZarict oryzae C~V.
C H A P I T R E P R E M I E R
1 SQLEMENT E T P U R 1 F I C A T I O N D E ?. oryzae
E T A B L I S S E M E N T D E C U L T U R E S M O N O C O N I D I E N N E S
CYCLE EVOLUTIF DU PARASITE
1 - ISOLEMENT ET PURIFICATION DE z-. ory~tn
- - -
- - - - . -
1 . 1 - Le matériel végétal
Le matériel végétal qui a servi à nos experiences a été récolté en
CASAMANCE (région sud du Sénégal), dans le périmètre expérimental de l'I.F!,A.T.
(Institut de Rec herches Agronomiques Tropicales et des Cultures Vivrières) connu
sous l'appellation de SEFA.
Ce matériel a été récolté le 17 septembre 1.973 ; le séchage et la
conservation ayant eté réalisés dans du papier journal a l'abri de l'humidité.
1 . 2 - Révélation du parasite
--_I_
Quelle que soit la technique employée, elle requiert toujours une
humidité relative élevée ; deux méthodes ont été utilisées pour révéler et ex-
térioriser le parasite présent dans les lésions foliaires.
- Dans la première, le fragment foliaire porteur de lésions est directement
- 7 -
.
.
i
<L L J
1. Ise*?ernent et qw-~i Fication
: obtentjon de cultures pures
. ..-.-_" --_---. ~ -----_--..-----_..--- --- ,-- _.I. _--_-"_ ..,--<. --...----.11
iiprf!s 3 à 4 jours d'incubation, la d@tection de t!. LW~ZCXS se fait
C;d i::.i ')(y-a;'ta j pe '; c 'est 5. 'la lumière de ces observations que la deuxième méthode
lieus Est apparue preférable
: en effet, la prtisence d'une multjt;ude de saprophy-
tes masque tres preicocement les colonies tres discrètes du parasite ; par contre,
: 2 jeijh -i t?,me tra-j tement )I s"i1 n'elimine pas errei6remer:t la proliferation de ger-
ws tel ,J 1 es %4;:,7 o1 ri It~rw~~k~, ~;.~rl324l~::1’:~d, :'r.~:~kc'~-rnl~.,""c; ) etê ) . . en 1 imite tout
au iwins l'ïnstallation.
Par ailleurs, nous avons, au cours de cette opération, été confron-
tés ac~ problème de souillure par des germes bactériens ; nous disposions alors
d'une série de mt!thodes dont certaines ont fait 1 'objet d'une application et ont
abouti à des rësultats plus ou moins satisfaisants :
'- Incorporation dans le substrat nutritjf d'antibiotique spécifique : en
.v-Ve------, .~-ll_-ll_- l_--.. __--_-_-._l-_---
-
-
1 ' wxrence y nous avions opéré avec de la streptomycine (bactéricide et bacté-
rIostitti!~uej mais awons dir renoncer à ce procCd6 du fait que l'antibiotique @tait
:;~O!S induire une modification des caracteristique5 physiologiques du parasite
et pa;qJnt son i:ornportement phytopathogène ; c 'est du reste ~3 c't tftre que nous
avons préf&6 1 'hypochlorite de sod.iurn 10 % au chKwure mercurique comme désin-
C~ec,Lan~t: superfr ciel <
'. irlcehcde prëi;onis& par VOLKQNSKY " f? c,"ag"it d'ensemencer un milieu gëlo-
.----. ^_--.-_- ---.-_, I_ -"-~ -,--,----- _
s 16 :, Ta face ifiterne du couvercle aÿant eté pr:ialablemerrt recouverte par un peu
,Fj 1 1 r$j 'i j !? i,j 3' 1 rj 5 6 ) nous incubons à l'ktuve couvercle en bas ; le myc6lium en
t:ri~'-is:;~t:r:e finit. par venir au contact du couvercle quï fournit dès lors un ino-
-8-
1:ulum exempt. de ge'rmes etrangers et conduisant après repiquage à une culture
pu rc .
Cette méthode nous a semblé inadéquate d'abord parce que le germe
'i,e C:aractérise par une croissance en surface et non de type aérien ; ensuite
parce que des bactéries se développant plus vite que la colonie parasite par-
yienn-nt dans un tres bref délai (48 heures environ) a recouvrir l'inoculum à
purifier.
Compte-tenu de, la croissance relativement lente du parasite étudié3
~OU!; avons éliminé ce procédé de purification.
- Technique de RAPER (1937) : un anneau de verre prklablement stérilisé
-
-
-
-
-
est placé dans une boite de Petri stérile ; le milieu gelosé est coulé jusqu'à
,trcis-quarts de la hauteur de l'anneau ; l'inoculum à purifier est placé au cen-
tre de l'anneau ; on observe alors la persistance des germes bactériens a l‘inte-
rieur de l'anneau tandis que ceux du champignon migrent a 1"extérieur de l'anneau
par la zone de contact emntre la base de l'anneau et le fond de la boîte de Petri.
Seule la première méthode avait retenu notre attention, dans la pé-
riode où nous réalisions une incubation sans désinfection prealable ; nous avons
contourné ces difficultés supplémentaires de purification en procédant à une
désinfection préillable ; dès lors il est possible, moyennant le respect des
conditions d'asepsie, d'obtenir directement une culture pure aprës un seul repi-
quage ,
A TITRE INDICATIF, nous citons une méthode de purification consis-
tant à ensemencer l'inoculum à purifier dans un tube incliné qui est ensuite
'dressé verticalement ; les auteurs affirment que le dëveloppement des champignons
s'efb'ectuerait vers la région supérieure du substrat et se detacherait des germes
bactWiens ; il suffirait d'un repiquage pour obtenir une culture pure
(cf RAPILLY dans "TECHNIQUES DE MYCOLOGIE EN PATHOLOGIE VEGETALE"' : obtention de
cultures pures'I).
1s - ETABLISSEMENT DE CULTURES MONOCONIDIENNES
2.1 - Préliminaire
Une preuve éclatante de la variabilité des races de P2jY’<i?l4 Zm~rx oryzue
2 , i - Mét.rtcide de d i 1 uti on
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- 10 -
considérée donnerait d'emblée une culture monoconidjenne.
La relation UNE CONIDIE-UNE COLONIE n"étant pas nécessairement véri-
fiable, cette méthode ne nous paraft pas sike ; de plus, la chance d'obtenir
des colonies reellement issues de conidi es isolées est d'autant plus grande que
la concentration est réduite ; or, plus la concentration de l'inoculum est fai-
ble dans cette méthode, plus s'amenuise la fréquence des conidies dans le volume
étalé ; d'où la nécessité d'un nombre él evé de répétitions et 1 "utilisation d'un
matériel considérable.
Enfin, au fil des dilutions successives, une infime quantité de ger-
mes étrangers dans l'une des dilutions mères suffirait pour contaminer toutes
celles de concentration inférieure et partant rendrait difficile l'établissement
d'une culture monoconidienne.
Pour toutes ces raisons nous avons dii délaisser cette méthode qui
nous para4t moins satisfaisante que celle de la dilution améliorée.
2.3 - Méthode de la dilution améliorée
Nous réalisons une suspension conidienne mëre à partir de la culture
pure determinée plus haut ; par dilutions successives, nous ajustons la concen-
tration conidlenne à environ 1 000 conidies/ml
; cette concentration permet, à
l'aide d'une pipette' PASTEUR très fine, de déposer sur une lamelle des micro-
gouttes ne renfermant qu'un nombre très réduit de conidies à défaut d'une seule.
Le dénombrement des conidies présentes dans une microgoutte se fait au micros-
cope, le dessechement de la microgoutte étant évité par 1"usage d'une chambre
hum<de de VAN TIE:GHEM préalablement stérilisée.
Ayant repéré la ou les microgouttes ne renfermant chacune qu'une
SEULE conidie, nous les captons individuellement par la pointe d'un triangle de
papier filtre stérilisé ; le fragment de papier filtre ainsi chargé d'une coni-
dia est aseptiquement déposé à la surface du substrat nutritif qui est inocule
et incubé à 28°C.
Cette technique très délicate nous a neanmoins permis en 12 jours
d'observer une colonie très nette dont la multiplication nous assurait suffisam-
ment d'inoculum pour pouvoir démarrer les expériences proprement dites. Par cette
méth,ode, nous avons établi 11 cultures monoconidiennes notées Se i (i = 1 à 11)
* 11 -
et 7 cultures monoconidiennes notées
IKPj à partir de l'hi3te !KONG PAO.
.III - CYCLE EVOLUTIF DE L'AGENT PATHOGENE
3.1 - Préliminaire
3.1.1 - Remarque
Partant d'une culture monoconidienne, nous aboutissons, au fil des
repiquages, à une culture relativement différente de celle de départ ; ce qui
se traduit généralement par une réduction de la croissance, probablement liée à
une variation dans la physiologie du parasite ; dès lors, le recyclage du
1'. oryzae sur l'hôte nous para'it nécessaire puisqu'au cours de la confrontation
HOTE-PARASITE, ce dernier retrouve certains de ses caractères de base (exemple :
taille, forme, vitesse de croissance, etc...) ou en acquiert de nouveaux à la
faveur des relations nouvellement établies avec l'hote.
3.1.2 '- Conservation des souches
Dans l'état actuel de nos travaux, nous avons réalisé un repiquage
toutes les 2 à 4 semaines ; nous n'avons observé aucune réduction de croissance.
Nous avons, par ailleurs, conservé des souches à température de
10°C; pendant 60 jours ; le substrat nutritif utilisé étant soit de l'eau de
pomme de terre (20 g de pomme de terre par litre d'eau), soit du PCA 50 % (10 g
de pomme de terre, 10 g de carotte, 3. 000 ml d'eau distillée) ; aucune réduction
de croissance n'a été observée ; mieux, le repiquage sur PCA révèle ml5me une vi-
tesse de croissance relativement plus importante que celle observée à partir
d'un inoculum régulièrement reproduit sur PCA.
De nombreux auteurs ont préconisé l'usage de la basse température
(4°C) ; le substrat usité est généralement appauvri : exemple, MILIEU de
SABOURAUD (glucose massé = 30 g ; peptone = 10 g ; gélose = 20 g ; eau distillée =
1 000 ml) ; eau de pomme de terre ou encore malt à 1 %.
Cette dernière méthode permettrait des repiquages espacés de 6 mois.
Il convient de situer ici le problème très fréquent des pollutions
aux températures moyennes (20°C et 15°C notament) ; ce qui, à notre avis, tien-
a*----
,“U.--l”-.---
---
----l----UI~-m.lsl-
. 12 ”
;;?ait d la ventilation necessaire pour une bonne régulation thermique ; 1 'enve-
loppement minutieux des boFtes de Petri par du papier filtre devrait permettre
de pallier cet inconvenient.
Enfin la presence d'acariens
doit être systématiquement combattue
pckr une desinfection prealable des étuve s à l'alcool éthylique 95" puis néces-
sairemedi au formol .
A ce propos, il nous paraft plus aisé de conserver intacte une cul-
ture en tube incline ou en erlenmeyer qu'en bofte de Petri.
3.2 - Infection de l'hôte
------I_L.--
3.2.1 - L'hôte
Les graines de trois variétés de riz (63-83 ; SEFA 302 G ; IKONG-
PAO) sont abondamment rinciies à l'eau de robinet d'abord, à l'eau permutée en-
suite afin d'éliminer les fongicides de conservation ; elles sont alors réparties
dans les boîtes de Petri tapissées intérieurement par du papier filtre humecté
(50 graines par boite de Petri de diamètre 90 mm) ; la prégermination dure
5 jours ; à cet age,, la première racine et le coléoptile sont tres nets ; le
repiquage se fait SLW perl ite ; pendant les 5 à 7 jours qui suivent la date de
repiquage, l'arrosage se fait à l'eau permutée ; au-dela, nous arrosons à l'aide
d'une solution nutritive de KIMURA dont la formule est définie dans l'annexe
technique no II.
Cependant, un procédé encore plus avantageux parce qu'aussi satis-
faisant et relativement plus simple, consiste à repiquer les graines prégermées
sur dae la terre de jardin débarrassée des grosses particules par tamisage et
lestée par environ 20 % de fumier.
Une fois par mois, nous avons arrosé à l'aide de la solution nutri-
tive de KIMURA pour suppleer à un épuisement éventuel des réserves du substrat
de culture. Pendant la durée de l'expérience (octobre à avril), la photopériode
s'est révélee comme étant une donnée fondamentale ; la faible intensité lumi-
neuse diu jour impose un éclairage intense de 35 000 lux (mesure effectuée au
niveau supérieur des cuves placées à 70 cm sous le dispositif d'ëclairage) main-
tenu de 4 à 20 heures. La tempërature et l'humidité relative sont groupées dans
le tableau de ?'annexe technique no III. L'inoculation a été réalisée au 45e
jour. j/
- 13 -
3.2.2 - L'inoculum
L'inoculum est issu soit d"une culture liquide de P. oryzae sur PC
(milieu à base de pomme de terre et de carotte) dgée de 15 jours, soit d'une
culture sur PCA Sgée de 8 a 12 jours ; l'incubation ayant été réalisée a 25°C
et a l'obscurité continue. Après broyage et filtration, nous avons ajusté la
concentration conidienne à 30 000 conidies/ml, valeur qui, selon FUJIMAKI
(Y.967) induirait le maximum de lésions foliaires.
Deux à trois gouttes de TWEEN 80 (jouant le role de mouillant) sont
ajoutées a la suspension conidienne ainsi préparée et disposée dans la cuve du
pulvérisateur.
3.2.3 - Technique d'inoculation
Nous avons inoculé par pulvérisation directe de la masse foliaire ;
les plantes ainsi traitées et celles témoin sont incubées 4 jours en chambre
humide,
A cette méthode classique, des auteurs préfèrent l'usage d'une cham-
bre à nébulisatisn permettant une meilleure répartition des conidies sur le ma-
tériel végétal.
Cependant, il est possible, sur de très jeunes plants (âgés de
3 semaines), d'utiliser la méthode d'inoculation par contact ; l'incubation à
25'C est maintenue pendant 48 heures.
Enfin, nous signalerons ici la méthode usitée par SAKAMOTO pour ino-
culer les gaines foliaires : le matériel végétal est découpé en fragments de
7 à 10 cm ; il est ensuite plongé dans une suspension conidienne maintenue
40 heures entre 24" et 28°C. ; les cellules de la surface interne des gaines sont
examinées au microscope ; la pénétration et le taux de croissance interne du
parasite sont utilisés convie critères d'appréciation du degré de la résistance.
3.2.4 - L'infection
Elle exige comme préalable l'établissement de certaines conditions
de température (exemple 32°C pendant 10 heures ; 28°C pendant 8 heures ; 24°C
pendant; 6 heures selon les expériences de HASHIOKA (1965)) ; d'humidité (exem-
- 14 -
ple 12 heures de rosée à 15,6"C selon BARKSDALE et JONES (1965)) et de lumière
(l'infection serait plus aisee à l'obscurité qu'a la lumière et serait suppri-
mée par la lumière diffuse).
Lorsque les conditions requises sont assurées, l'infection commence
par la germination des conidies qui émettent un tube germinatif ; elle se pour-
suit par la formation d'app&sorium ; la pénétration des cellules de la plante
h6te se fait soit par la cuticule, soit par les stomates ; c'est après cette
invasion que se développe une hyphe infectieuse issue d'une vésicule et dont le
devenir est fonction de la réaction de l'hote :
- l'hbte résistant réagit rapidement en produisant des granules brut& ou
des "RESIN-LIKE-SUBSTANCES" d'où le blocage du développement de la vésicule et
de la croissance de l'hyphe (cf planche no XB).
- chez l'hbte sensible par contre, la vésicule et l'hyphe se développent
librement étant donné la faible réaction de l'hbte (cf planche no XB).
3.3 - Symptbmes de la pyriculariose
Ils peuvent s'exprimer sur les noeuds (pyriculariose nodale), le cou
("ROTTEN NECK ou NECK ROT"), les grains, les feuilles ("LEAF BLAST").
3.3.1 - La pyriculariose foliaire ou "LEAF BLAST" (cf planche no XA)
Les taches foliaires sont typiquement elliptiques à extrémité poin-
tue ; la zone centrale est grise ou blanchâtre, la zone marginale est brune à
brun rougedtre.
Sur variété sensible et sous des conditions d'humidité élevée, les
taches foliaires se développent rapidement ; la coloration grisâtre persiste
pendant un certain temps ; une attaque précoce peut conduire non seulement à
une dessication de la gaine foliaire mais au grillage de tout l'appareil foliai-
re sans, lequel toute récolte se trouve gravement compromise.
La dimension des lésions completement développées peut étre de 1 à
1,5 cm x 0,3 à 0,5 cm.
Chez les variétés hautement résistantes, on observe seulement des
taches de la dimension d'une tête d'épingle.
- 15 -
Les variétés présentant une réaction intermédiaire montrent des lé-
sions rondes ou elliptiques dont la taille est voisine de quelques millimètres
et dont la marge est brune.
Il semble que la couleur brune corresponde soit à une réaction de
résistance varietale, soit aux conditions défavorables (exemple : lumière dif-
fuse.,.) de développement des lésions.
Cependant, la couleur, la forme des lésions, sont elles-mêmes fonc-
tion des conditions et du degré de sensibilité du riz ; on distingue générale-
ment deux types de lésions :
- celles de dimension réduite, de couleur brune appelées lësions chroni-
ques ou "chronic lesions",
-. celles grisatres,
bien développées que l'on désigne par le terme de
"ACUTE LESIONS" (lésions aigües).
Selon OSHII (1937), la lésion elle-méme se compose de trois zones
bien caractéristiques :
-e La zone empoisonnée- (ou zone plesionécrotique) : c'est la bande la plus
externe de la lésion ; caractérisée par la diffusion de substances toxiques sé-
crétées par le champignon.
-8 La zone nécrotique : bande brune, étroite, placëe le long du bord inté-
rieur de la zone empoisonnée. La zone nécrotique se caractérise par des inclu-
sions cellulaires et des parois cellulaires dégénérées et décolorées.
- La zone désintégrée, quant à elle, se définit par des inclusions cellu-
laires et des parois cellulaires complètement rompues et détruites.
3.3.2 - Pyriculariose du cou
Le cou (ou base de la panicule) peut etre attaqué et conduire à
l'apparition de sympt&nes de "Rotten neck" ou "neck rot", c'est--à-dire une pour-
riture au niveau du point de jonction qui se traduit par la chute de la pani-
cule.
Tout se passe comne si l'installation du parasite au niveau du cou
altërait les tissus et vaisseaux conducteurs à l'endroit du site d'infection et
partant empêchait les métabolites (élaborés par la plante ou puisés dans la rhi-
- 16 -
zosphère par son système radiculaire) de parvenir dans l'épi dont la formation
est dès lors qualitativement compromise ; pareilles à dés épis de riz héber-
geant un Borer ou à des epis d'orge altérés par une attaque tardive d’OphioboZus
!3ra;nz:nZs,
les panicules du riz se composent de grains soit complètement vidés
de leur contenu, soit sous-développés et donc dotés d'une fertilité amoindrie
voire nulle.
Le "ROTTEN NECK" revet à nos yeux l'une des formes d'expression les
plus catastrophiques de la pyriculariose.
Notons que ce type d'attaque peut aussi se manifester sur les autres
noeuds de la tige.
3.3.3 - Notations en serre après inoculation artificielle
.-_
- La variété 63-83 : fournie .>.?Y 1'I.R.A.T. est définie comme étant dotée
d'une "très bonne résistance" : ce r;ultivar examiné et noté (par rapport au té-
moin) présente sur les feuilles subterminales, des taches brun-rougeâtre très
fines ; certaines de ces lésions sont nettement brunes.
- La variété SEFA 302 G : semble moins attaquée dans son ensemble ; toute-
fois, eu égard à la teinte vert foncé, à la consistance des feuilles et à une
lumiinosité déficiente à l'époque de ces observations, les symptbmes étaient plus
difficiles à apprécier.
- La variété TKP : les symptômes observés sont nets ; cependant nous signa-
lerons qu'au cours d'une prospection effectuée à 1’I.R.A.T. en septembre 1973,
nous avions observé que ce cultivar, utilisé dans les essais I.R.R.I.
(International Rice Research Institute) comme variété contaminatrice, s'était
révéslé plus résistant que des cultivars réputés résistants ; resterait donc à
éclaircir ce problème.
3 .4 - Dissémination
La production de conidies intervient 6 jours après l'inoculation et
par une humidite relative supérieure ou égale à 93 % (HEMMI et IMURA, 1939) ;
le taux d'émission serait de 2 000 à 6 000 conidies par jour et ce, pendant les
14 premiers jours dans les conditions expérimentales au laboratoire (cf I.R.R.I.,
données non publiées).
- 17 -
Des expériences très récentes (KATO et al., 1970) riivèlent un pic
au bout de 3 à 8 jours après apparition des lésions foliaires et au bout de
10 à 20 jours pour les lésions se manifestant sur les rachis.
La dissémination du champignon serait réalisée par l'eau d'irriga-
Lion (SUZUKI, 1969), le vent (les conidies transportées par le vent sont parfois
---.
- -
recueillies jusqu'à une hauteur de 24 m), les semences infectées-' le chaume in-
fecté.
- - -
Le nombre de spores déposées par feuille est fonction du point d'in-
sertion de la feuille et de son inclinaison par rapport à la tige ; ainsi le
nombre des spores déposées par feuille est plus élevé pour les variétés de riz
à feuilles voisines de l'horizontale que pour celles à feuilles formant un angle
aigu avec la tige.
3 .5 - Longévité
-
-
Dans les régions tempérées, le champignon passe l'hiver sous forme
de mycélium ou de conidies ; lorsque les conditions sont sèches, la survie des
conidies peut &tre de un an et celle du mycélium de trois ans.
Pour passer l'hiver, le champignon peut soit demeurer dans l'embryon
de riz, dans l'endosperme, dans les glumes (SUZUKI, 1930), soit hiverner sur
d'autres céréales jouant le rôle d'hôtes de transition.
- 18 -
C H A P I T R E D E U X I E M E
C A R A C T E R E S DESCRIPTIFS DE
PyrieuZaria oryzae Cavara.
De nombreux auteurs se sont attachés à caractériser et à définir
le genre Pytiwlariiz : SACCARDO (1880) ; CAVARA (1891) fut le premier à décrire
une espèce de PyricuZaria oryzae se manifestant sur le riz en Italie ; les re-
cherches de BRIOS1 et de CAVARA aboutirent en 1892 à l'apparition d'une descrip-
tion identique [dans la littérature courante, l'espèce P. ohyzae est souvent
attribuée à BRIOS1 et CAVARA ; en réalité, seul CAVARA doit être cité comme au-
teur puisqu'il fut le premier à caractériser l'éspèce P, oryzae ; d'où la déno-
mination PyricznZaria oryaae Cavara.] ; HORI (1898) ; KAWAKAMI (1901-1902) ;
SHI:RAI (1905) ; ASSUYAMA (1965), etc....
Conformément à ces travaux, le parasite du riz sera nommé
PyrYim4laria oryzae cav. ; les recherches de BRIOSI et CAVARA (1893), KAWAKAMI
(1901-1902)) NISIKADO (1917, 1927) etc.. . conduisirent à réserver le binome
PykmZaria grCsea (CKE) sacc. au parasite rencontré sur d'autres graminées ou
céréales (Eleusine, Paspuhn, Panicum, Setaria).
1 -G CARACTERES MORPHOLOGIQUES ET CYTOLOGIQUES DE L'AGENT PATHOGENE:
1.1 - Le conidiophore (cf planche no X)
-
P. oryzae est doté de conidiophores naissant groupés à partir d'un
stroma ; la partie basale du conidiophore est renflée, fuligineuse et la région
- 19 -
djp,i ca 7 c s'amincit progressivement.
La Premiere conidie est émise par l'apex du conidiophore, les sui-
vantes etant formées sur les ex,trémités de nouvelles ramifications émergeant
juste au-dessous du point d'émission de la première conidie (radulglspore) ;
plusieurs conidies (de 2 à 20) peuvent naitre d'un méme conidiophore.
1.2 - Les conidies
Les conidies possèdent généralement une base arrondie et un apex ré-
,trelci ; elles sont biseptées, rarement triseptées ou monoseptées ; elles présen-
tent parfois un rétrecissement au niveau des septa ; les conidies sont le plus
souvent hyalines a olive pdle ; leur taille est voisine de 19 a 23 microns x
:7 à 9 microns ;
..------Y
elles portent généralement un petit appendice basa1 mesurant
â 6 à 2,4 microns ;
..-?--
la germination de la conidie se fait le plus souvent au ni-
-
veau de la cellule apicafe ou de la cellule basale, parfois d'une cellule médiane.
Mais les conidies de P. oryzae se caractérisent aussi par une cer-
taine variabilité dans leur forme et dans leur taille ; la dimension des coni-
dies serait fonction de nombreux paramètres, entre autresle type de lésion,
l'h&te, l'humidité relative, la température :
- Ainsi, les conidies des lésions de type "acute lesion" seraient plus pe-
tites et un peu plus rondes que celles issues des "chronic lesions" (ON0 et
NAKAZOTO, 19583.
- De meme le champignon de riz, inoculé sur différents hbtes donne lieu
a l'apparition de conidies différentes d'un hôte à l'autre (cf tableau A) ;
Tableau A : taille des conidies de P. oryzae après infection de divers hotes.
------'---
BARITA, IWATA et YAMANUKI, 1965 ; ASUYAMA, 19651, Extrait de
S.H. OU :"RIDE DISEASES"
----------.----
-
Hbte inocule
Hote inoculé
--l-_-_-"-.l-..---._l-.---_._
E'estuca arwdinu(~ea
k’. elatior
arundinacea
s'. ruhra ( 1)
P. canariensis
(2)
Phcm pratense
fi0 Ze~ns Zana tus
Secbale cerea Ze
Hmiem vu Zgarér ( 1)
(2)
26,4 x 9,7
- .II -.-. ^...--._. .^-----..--s+-
-
-
-
- 20 -
par contre lorsque ces dernières conid"<s, toutes différentes les unes des au-
tres sont inoculées sur le rit, toutes les nouvelles conidies, produites sur
riz sont de même taille (NARITA, IWATA et YAMANUKI, 1956).
- Par ailleurs, des conidies produites sous une humidité élevée suffisante
seraient plus longues que celles produites sous une faible humidité et a fortiori
dans un milieu sec (NISIKADD, 1926 ; SUEDA, 1928).
- La température semble aussi Jouer un rble significatif : les conidies pro-
duites a température élevée (30°C et 27OC respectivement) seraient plus longues
que celles fomées aux basses températures (18 à 20°C et 21 à 22OC) ; par contre
la variation de la largeur sous l'action du facteur thermique ne semble pas si-
gnificative (YAMANAKA et KDBAYASHY, 1962).
- Enfin, les conidies produites dans les milieux de culture présentent une
certaine variabilité, fonction du type de milieu, et elles sont généralement
plus longues que celles produites sur plante h6t.e (NISIKADO, 1926 ; KULKARNI et
PATEL, 1956 ; ON0 et NAKAZATO, 1958) (cf tableau B).
Tableau B : tailles moyennes des conidies de P. oryzae produites sur lesions
- - - - -
de l'hote et sur décoction gélosée de plantes [SAWADA, 1917 ;
ASUYAMA, 19651. Extrait de S.H. OU "RICE DISEASES"
--1----
r
r ---_--
-
Sur milieu gélosé issu d'une décoction de
Sur lésions
--,_~
--1.
de 1'hCrte
----
_l_-.--l_l~
261,O x 8,8
m--m
- - -
-
-
Quant à la germination des conidies, elle est suivie de la forma-
tion d'appressopia émis aux extrémités des tubes germinatifs ; l'appressorium
(que d'aucuns baptiserent
"RECREATING SPORE" ou "RESTING SPORE"ou même "CHLA-
MYDOSPORE") semble jouer un rble très important dans la première phase d'agres-
sion de l'hbte,
If semblerait même (SUZUKI, 1951, 1953) qu'il y ait une relation
entre pathogènie et grosseur de l'appressorium.
- 21 -
1.3 - Caracteres cytologiques (cf planche no XR)
L'observation de conidies au microscope électronique a conduit 8
divers résultats : la membrane cellulaire serait composée de 3 couches selon
certains auteurs (MIZUSAWA, 1959), 2 couches seulement selon d'autres (HORINO
et AKAI, 1965) et enfin 4 couches selon WU et TSAO (1967) ; ces deux derniers
chercheurs mirent en évidence l'existence de noyaux, de nucléoles, de pores
au niveau du septum, ainsi, que la présence de 2 types de particules denses dont
l'une serait le lysome.
Le nombre de noyaux par cellule mycélienne ou conidienne est encore
incertain eu égard aux résultats certes nombreux mais souvent controversés :
les cellules seraient plurinucléées selon SUZUKI (1965, 1967), uninucléées se-
lon HORINO et AKAI (1965), WU et TSAO (1967). YAMASAKI et NIIZEKI (1965)
pensent au contraire que, de façon générale, les cellules seraient uninucléées
mais qu'il existerait un faible pourcentage de cellules contenant 2 a 6 noyaux
pmour certaines souches seulement du champignon.
HASHIOKA et INAGAKI (1968) établirent que les 7 espèces de
PyricuZarYia étaient uninucléées mais qu'fl y avait possibilité d'anastomose en-
tre P. orpae et P. zizaniae ; ce qui conduirait a la formation d'un noyau mix-
te générateur de différents types de conidies.
Enfin, récemment encore, GIATGONG et FREDERIKSEN (1967, 1968, 1969),
établirent que de façon générale, les cellules conidiennes ou mycéliennes étaient
uninucléées mais qu'un nombre réduit de cellules, reconnaissables par leur forme
(forme en tonneau), avaient 4 noyaux ou plus.
Cette étude cytologique révèle, entre autres, toute la difficulté
de caractérisation de l'agent pathogene ; si nous ajoutons par ailleurs que des
études tres récentes révèlent une très grande variabilité dans la pathogénie du
parasite, nous conviendrons alors une fois de plus de la nécessité de mieux
appréhender les caractéristiques biologiques du pathogt?ne, autrement dit des re-
lations entre ces caractéristiques et la variabilité de la pathogénie ; pourquoi
la quantité de mycéliun parasite varte-t-elle d'une masse cotonneuse épaisse a
un ,tres mince film ? Pourquoi observe-t-on de si fortes variations de la couleur
du mycélium ? Quelle relation existe-t-il entre ces variations et la pathogenie ?
Autant de problèmes a definir et 11 résoudre pour une meilleure approche des rela-
tions h6te-parasite et partant pour l'édification d'une méthode efficace de lutte.
- 22 -
II - CARACTERES CULTURAUX EN FONCTION DU MILIEU
Seuls seront examinés dans ce paragraphe les caractéres descriptifs
afférents a la morphologie des cultures et a celle du mycélium ; les conidies,
quant à elles, seront examinées dans la partie traitant de la conidiogénèse.
Les milieux utilisés : PCA, PDA, MISAT0 6.5, ORGEOSE dont les com-
posantes sont definies dans l'annexe technique no 1 ont été incubés après ino-
culation ; les notations ont été journalières jusqu'au L15e jour-d'incubation-
% 2 5 °.C
2.1 - Morphologie de la culture
-- La forme de.la colonie est régulière par rapport au site d'inoculation
quel que soit le milieu solide util4sé ; cependant, alors que l'épaisseur du
mycélium est tr&s fine sur PCA, nous observons sur PDA, ORGEOSE, une masse my-
célienne relativement plus abondante quoique moins importante que sur MISAT0 6.5.
-. La couleur :
-
la teinte "brun cendre" est tres nette quel que soit le mi-
lieu ; cependant, alors qu'elle est homogène et régulière sur toute l'étendue de
la C!olonie observée sur PCA, ORGEOSE ou MISAT0 6.5, nous notons au lQ,e jour
sur :PDA une gamme de nuances ainsi réparties' de l'intérieur vers l'extérieur :
. autour du site d'inoculation (c'est la zone la plus dgée), un an-
neau d'environ 3 mm d'épaisseur, d'aspect poudreux très fin et de teinte gris-
rosâtre,
. une zone de 8 mn d'épaisseur, de teinte beige à gris clair, légë-
rement plus épaisse que la précédente,
. une bande annulaire d'environ 8 mn d'épaisseur caractérisée par
un mycélium floconneux lache (telles les particules peu denses d'un velours),
. une zone d'environ 10 mm dont la masse mycélienne relativement
plus épaisse que toutes les précédentes est nettement plus claire,de teinte
"huileuse",
" enfin, une marge externe claire.
- 23 -
2.2 - Le myctElium
La croissance mycélienne semble bloquée au contact des parois des
boTtes de Petri ; ce qui suggère la présence d'un mycélium du type rampant.
Au microscope, le mycélium très f in, hyalin, de diamHre moyen avo i-
sinant 3,14 a 4,18 microns ne présente aucune différence significative liée au
substrat nutritif.
La longueur moyenne des cellules mycéliennes est de 26,78 microns
(moyenne de 50 valeurs pbservées sur PCA).?.
2.3 - Le revers de cultures
Nous nous bornerons a signaler la tres forte pignentation observée
sur PDA.
XII - CARACTERES CULTURAUX EN FONCTION DE LA TEMPERATURE
Les cultures décrites ici sont issues d'un inoculum isolé de la
variété 302 G ; le substrat nutritif choisi est le PCA, l'observation s'est
faite à 25*C pendant 9 jours.
Nous avons réalisé cet essai aux températures de 10,5",
- - w,x,
20", 25", 30" ; chacune de ces valeurs étant entachée d'une marge d'erreur de
-- e -
f 0,5*c.
-
-
- La masse mycélienne formée à 30' et 25*C est d'une teinte brune réguliè-
r e ; cette coloration, nous le verrons ultérieurement, traduit une bonne sporu-
lation de façon générale ; les cultures placées à ces deux températures sont
aussi caractérisées par un revers très pigmenté.
- A 20*, se développe une masse mycélienne d'aspect poudreux très homogène.
- Pour les températures de 17", 15*, 10,5*', le mycélium, parfois flocon-
neux, devient blanchdtre et on constate l'absence de pigmentation du revers des
cultures.
- 24 -
IV - CARACTERES CULTURAUX EN FONCTION DU pH (Tampon Mc Ilvaine, ann. tech. no 7)
Les caractères ci-dessous ont eté établis sur la base de culture
en milieu liquide a base de carotte-pomme de terre ; dès les premières perio-
des d'incubation a 25"C, nous observions dans les erlenmeyers des masses mycé-
liennes cotonneuses a duveteuses, blanchatres, isolees les unes des autres, de
dimension variable en fonction du pH ; trk tbt cependant, des différences se
révèlent et se concretisent avec l'age.
- Pour les pH bas de 2,95 et 2,35, la teinte initiale persiste hormis une
tégere augmentation dans la taille ou la confirmation de l'aspect blanc laiteux.
- Pour les pH 3,95 et 4,60, les flocons deviennent plus solidaires et a la
periphérie se développent dès les 5e et 6e jours, un anneau continu brun verdS-
tre au contact de la paroi de l'erlenmeyer.
- A pH 5,3D, s'est développee, des les 5e et 6e jours, une assise mycélien-
ne porteuse par endroit de "touffes" brun clair.
- Au cours des essais réalises, le pH 5,95 est celui qui a révélé la plus
grande homogenéité tant du point de vue régularité dans l'épaisseur du mycélium
que rëpartition de la teinte brune.
_ Aux pH 6,45, 7,00, 7,55 se développent, par endroit, des touffes duve-
-
-
-
teuses.
- 25 -
CHAPITRE TROISIEME
BIOLOGIE ET PHYSIOLOGIE DE
PyricuZatia oryzae
I- PARAMETRES DE LA CROISSANCE DE P. oruzae
1.1 - PrGliminaire
L'établissement d'une méthode de lutte contre le P. oryzae impose
a priori une définition m&ne partielle des relations hbte-parasite, ce qui sup-
pose entre autres la connaissance de la biologie et de la physiologie du para-
site au travers de ses exigences nutritives, thermiques, lumineuses, etc... ;
l'importance de cet aspect du problème n'est plus a démontrer et, s'il en était
besoin, nous pourrions très bien la matérialiser à la lumiere des expériences
de TANAKA et KATSUKI (1956) qui ré@lèrent que de nombreux composés du cycle de
KREES présents dans les feuilles de riz jouaient un r8le stimulant dans la crois-
sance du parasite impliqué ; cette "réceptivité", sur le plan trophique tout au
moins, liée a la présence d'acides succinique, malique, citrique, joue donc un
rble important dans la nature des relations établies entre le parasite et l'hbte
cons'idéré.
Dans l'étude qui va suivre, nous nous efforcerons de cerner l'action
du milieu, de la température et celle du pH sur la croissance de P. oryzae.
Il convient cependant de signaler l'existence de certaines souches
utilisatrices de sorbose, de sorbitol, de mannitol, d'inuline,
ce qui révele
une variation dans l'utilisation des métabolites ; resterait donc a établir la
corrélation -si corrélation il y a- entre cette variation de type trophique et
la variabilité du pathogène.
- 26 -
TANAKA et KATSUKI (1956) postulèrent par la suite que les amino-
acides libres tels par exemple le glutamate, l'aspartate ainsi que des traces
de Mn, de Zn, de Mo pouvaient jouer un rble de cofacteurs de croissance.
1.2 - Paramètres trophiques
De façon générale, la croissance de P. oryzue est relativement ai-
sée sur milieux naturels, autrement dit de milieux composes soit de tissus de
plante, soit de décoction de plante ; de méme l'addition dans un milieu de cul-
ture d'extraits de chaume de riz dans l'eau chaude stimule considérablement la
croïssance et la sporulation de P. oryz~e, ce qui ttsmoigne en faveur de l'exis-
tence d'une substance initiatrice de croissance ou "GROWTH-PROMOTING-SUBSTANCE"
dans l'extrait de chaume de riz.
Par contre la croissance de P. oryzae s'avère difficile sur milieu
synthétique.
De nombreuses expériences ont été réalisées dans le but de mieux
cerner la nutrition carbonee ; il semble bien établi de nos Jours, que les meil-
leures sources de carbone soient le sucrose, le glucose, le maltose, le fructose,
le lactose, le xylose et que de façon générale les acides organiques ne soient
pas des sources convenables (OTSUKA et al., 1965).
Quant à la nutrition azotée, l'état actuel de nos connaissances met
en évidence l'intervention convenable de l'histidine L ; de l'acide L-glutami-
nique, L-proline, L-serine ; de la L-glycine, L-arginine, L-asparagine, L-alanine.
Pour quantifier la croissance mycélienne, nous nous limiterons a
deux méthodes :
.- La méthode radiale : fondée sur la mesure du diamètre moyen des colonies ;
dans tous les cas, la valeur moyenne indiquée représente la moyenne établie à
partir de 5 boTtes de Petri ; pour chaque boite, la valeur affectée est une
moyenne entre 2 mesures effectuées le long de 2 diamètres perpendiculaires.
L'unité de mesure sera le millimètre (mn).
- La méthode pondérale : dont le principe est de suivre l'évolution pondé-
rale (en mg} de la masse mycélienne préalablement filtrée (papier filtre DURIEUX
no 111) et séchée à l'étuve à 105°C.
- 27 -
Dans tous les cas, la valeur mo,yenne mentionn(5e a eté établie à
partir de 3 mesures correspondant à 3 erlenmeyers.
1.2.1 - Nature des milieux utilisés
cf annexe no 1.
1.2.2 - Définition de l'inoculum
Il est, de façon g&&-ale, issu d'une culture présentant une bonne
croissance dont l'age est de 5 à 12 jours.
1.2.3 - Résultats
1.2.3.1 - Croissance en milieu solide
----------------_----------
Experience no 1
- -
Tableau 1 - PyricuZaria oryzae : croissance radiale (exprimée en mn) en fonc-
-
-
tion du milieu de culture ; température d'incubation = 28'C/obs-
curité continue.
- 28 -
Expérience no 2
PCA
6
33,6
3 6
31,l
30,4
I 8
I
45,2
42,0
I
I 12
I
7 7
l 14
1 84
87,2
I
l
68,4
Tableau 2 - P. oryzae : croissance radiale en fonction du milieu ; incubation
à 28°C/obscurité continue.
1.2.3.2 - Croissance en miilieu liquide
---------------_-------
--me
--
Age des
\\
cultures
7
16
211
28
4 1
(jours)
Nature
des
\\
milieux
--
I
Tableau 3 - P. oryzae : croissance ponderale (exprimée en mg en fonction du
-
-
milieu de culture ; temperature d'incubation = 2B oC/obscurite
continue.
Remar ue : Quant aux milieux a base de pomme de terre-glucose, Paddy, orge, ils
rp tent
+- tr& mal a ce genre de manipulation ; nous avons dQ les éliminer au
- 29 -
2le jour eu égard a la quantité de mi1ie.u qui, au cours de la filtration ve-
nait fausser l'apprkiation ponderale de la croissance mycélienne ; en effet
l'emploi de papier filtre rapide ne permet pas une séparation correcte mycélium/
milieu ; par contre la filtration est extremement lente voire impossible lorsque
l e papier filtre utilisé est du type lent.
1.2.4 - Expression des résultats : discussion
Les résultats obtenus sur les tableaux 1 et 2 sont respectivement
exprimes par les figures 1 et 2 ; on peut conclure au regard de ces repr&en-
tations graphiques que ORGE/AGAR, PADDY/AGAR, PCA, PDA, MISAT0 6.5 confèrent au
parasite une bonne croissance , relativement equivalente pour tous ces milieux.
Par contre, le milieu a base d'orgéose manifeste une inferiorité
sur le plan stimulation de la croissance.
L'ORGEOSE, le PDA (qui induit une stérilité très prkoce), le
PADDY/A, l'ORGE/A ne présentent pas de supériorité particulière par rapport aux
deux autres milieux et, du fait qu'en outre, leur usage s'avère très difficile
pour les cultures en milieu liquide, nous avons choisi de poursuivre notre étu-
de alvec seulement le PCA et le MISAT0 6.5.
Pour cette raison, l'appréciation de la croissance pondérale expri-
mée par la figure 2 ne fait intervenir que les 2 milieux retenus '; sur cette
figure, nous détectons un maximum de croissance situe entre 2 ou.3' semaines ;
le MISAT0 6.5 manifeste une tres nette supériorité sur le PC (pomme de terre-
caroltte).
Le fait que le maximum de croissance observé sur PC soit atteint
environ 5 jours avant celui sur MISAT0 6.5 ne devrait pas étre étranger a la
précocité de la décroissance pondérale présentée par PC ; autrement dit, il
nous semble que plus la croissance est active au départ, plus précoce sera le
phénomène de lyse mycélienne expliquant la décroissance pondérale.
Remam : à notre avis, l'évaluation de la croissance pondéra le devra t etre
G précise que celle de la croissance radiale ; à y regarder de plus près,
l'appréciation de la croissance radiale donne un aperçu sur la vitesse d'éta-
lement de .la colonie, aucune information n'ëtant fournie quant au déve oppement
aérien du mycélium.
Fig. 1 - P . orgzae : croissance radiale (mm) en fonction du milieu et
du délai d'incubation ; 28"C/obscurité. A = orge/agar ;
B = paddy/agar ; C = PDA ; D = PCA ; C = Misato 6.5
Fig. 1 bis - Il, orzzzae : croissance radiale (mm en fonction du
milieu et du délai d'incubation ; 1 8'C/obscurité.
A = PDA ; B = PCA ; C = Misato 6.5 ; D = Orgéose.
60
/
---c-W, ‘Z-U”““““““““”
6
I
b
16
21
218 '
3'6
411 J
Fig. 2 - P . oryzac3 : croissance pondérale (mg) en fonction du
milieu et du délai d'incubation ; 28"C/obscurité ;
A = Misato 6.5 ; B = PC.
i q
a I d “- .nct~ion Iv: ia température
-.- ....^.l.-.l - .-. ^<-_-_ ,--_
y‘ , 1;
‘:.t..L!“‘x,
‘SI,, t, Id crobssance mycelienne de I:. orys.32 a 7 ieu entre
8-9" et 37°C ; 1'6rP imtE se situanT à 28OC. les températures expe4mEntales
choIsies ~ppa~t~~~~~~~~t 4 la fourchelte ainsi definie : 10,5"C, 15'C, ;T:'C,
-.
":‘ 13i'
c:. 'li!
. -, -.. ?5"C, 2?"C acat 3J"c. *
.rl-l -- .."-.--' -... _~_,_'
35OC et 37OC sont en effet les températures qut
.--.
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nous avons retenues.
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---
2 5
35
3?
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13 ,Ei
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Q*O
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-
-
890
18,8
26 ,o
28,0
29,0-
23,5
-
- --t-
-t-
18,5
0,O
27,5
38 $4
41,O
42,4
34:,7
41 ,o
56,8
50,4
Tableau 4~ -2 P. oryzae
I_I--
: croissance radiale (mn) en fonction de la temperature/
PCA/obscurité continue.
1.3,2 - Expression graphique : interptitation
Si aux températures experimentales extrémes (10,5", 15" et 35') la
croissance demeure possible, elle reste faible voire nulle (cf fig. 3 pour la
duree d."incubation de 36 heures).
Pour les 3 premiers délais d'incubation, le parasite manifeste une
meilleure croissance a 30°C (qui est la température optimale observée) qu'à
27'6 ; cependant, au bout de 9 jours, l'a vitesse de croissance à 27°C augmente
au point de surpasser la croissance observée à 30°C ; il n'est pas impossible
que ce phénomène puisse s'expliquer par le fait que la valeur de 27" est rela-
tivement proche de l'optimum théorique Iqui est de 28OC.
!
A
3
20
.y-+----
l
? 0
\\ \\
A
/
/
t
,/
Fig. 13 a'. Ij. oryzae : croissance radiale (mm11 en fonction de la tempé-
rature ; PCA/obscurité ; A = âge de 36 h ; B = 4 j ; C = 6 j ;
D = 9 j.
- 35 -
A 37'C, la croissance observée est nulle au bout des 9 jours d'in-
cubation ; nous avons alors transporté le matériel conservé de 37% 25" pour
situer le seuil de létalité ; les valeurs observées après cette transplantation
sont représentées dans le tableau 4B/25"C/obscurité continue.
Diamëtre
moyen colonies
090
090
15,0
>> 90,o
-(fM
Tableau 4Bis - P. myzae : culture préalablement incubée 9 jours à 37"/obscu-
-
-
-
rité et transplantée à 25°/obscurité.
1.4 - Action de 1 'héméropériode
1.4.1 -. Résultats
Tableau 4' - P . oryzae: croissance radiale en fonction de l'héméropériode et du
délai d'incubation/PCA/25'.
1) = lumiëre,continue
t 2) = obscurité continue
(3) = 8 heures lumière + 16 heures obscurité
I.l~“UUI-lll-----.-“-,---l
----_.--
-
--.-----l---<CI-lllm
Fig. 3' - P. 9ryzae : croissance radiale (mm) en
fonction de l'hémëropériode et du dëlai
d'incubation ; 25'C/PCA.
A = 8 heures LUM + 16 heures OBS
B = Lumière
C = Obscurité
- 37 -
1.4.2 - Expression graphique :: discussion
-
Quoique la croissance mycélienne fût très satisfaisante quelle que
soit 1 'héméropériode, l'alternance LUMIERE:-OBSCURITE semble plus bénéfique que
la lumière ou 1"obscurité continue ; il aurait probablement été intéressant de
pouvoir affiner les durées respectives dans l'association lumiére-obscurité
afin de détecter la combinaison optimale pour la croissance mycélienne.
Par ailleurs, l'obscurité continue serait préférable à la lumière
continue.
Dans la suite de nos expériences, nous travaillerons -sauf indica-
tion contraire- à l'obscurité,d'abord
parce qu'elle correspond à la courbe
moyenne (cf fig. 3'), ensuite en raison de contraintes matérielles.
1.5 - Action du pH1 sur la croissance de P. oryzae
-
62,73
55,06
58,60
48,66
53,06
46,00
41,oo
34,66
28,26
29,30
31,53
30,56
30,50
30,85
30,73
25,30
21,06
24,50
25,85
26,00
21,55
31,20
/
60,70
41
(
42,53
1
37,95
31,lO
37,80
27,45
30,05
30,80
Tableau 5 - P. oryzae :
-
croissance pondérale (exprimée en mg) en fonction du pH/PC/
25'C/obscurité continue.
- 38 -
2,35
2,95 3,95
4,60
-
-
2,75
3,75 6,90
5,,95
7,20
7,50
7,60
7,50
7,85
- - -
2,85
5,85 7,85
8,lO
l 26
1 2,70 1 8,051 8,05
8,15
-
-
37
) 2,65 1 8,251 8,25
8.,20
/I 41
) 2,70 1 8,201 8,20
8!,20
8,20 1 8,20 j 8,20 1 8,20 1 8,30
-
-
Tableau 6 - P. oryzae : évolution du pH au cours du vieillissement des cultures/
-
PC/25°/obscurité continue.
3,95
4,60
5,3C
- -
2
11,50 13
13,7
- -
4
21,50 23
23,51
- - -
9
51,0
52,75
54,51
Tableau 7 - F. oryzae : croissance radiale (mm) en fonction du pH/PCA/25'/
-
obscurité continue.
1.5.2 - Expression graphique des résultats : discussion
1.5.2.1 - Préliminaire
------------
La croissance en milieu liquide implique une interaction entre l'i-
noculum et le substrat nutritif :
- Le substrat, par ses composantes (glucides, lipides, protides et ici pH)
induit une certaine croissance du parasite ; à telle enseigne qu'à la limite il
peut en modifier quelque peu la physiologie.
- Le parasite consomme certains métabolites issus du milieu, y rejette des
composés résultant de son métabolisme et partant modifie qualitativement le mi-
lieu sur lequel il pousse.
En l'occurence, cette interaction, très remarquable pour ce qui est
du pH en milieu liquide {ce qui serait moins important pour les milieux gélosés
en raison des echanges très limités), suggère qu'au fil du temps, le parasite
n'est jamais confronté au même milieu de base ; connaissant les relations parfois
étroites entre la nature du milieu et certaines caractéristiques du parasite,
l'on saisit alors la nécessité.de tenir compte de l'évolution du pH du milieu.
En d'autres termes, l'appréciation de la croissance pondérale en
fonction du pH devra, sous peine d'erreur, tenir compte du role joué par le pa-
rasite dans l'évolution du pH au cours du vieillissement des cultures. Cette
'régularisation"
du pH dans le temps vers une valeur optimum est un fait cons-
tant observé dans la plupart des cultures.
Pour ce faire, les représentations graphiques de la croissance pon-
dérale et de l'évolution du pH devront être a,;Ca;:ysées de façon concomitante ou
du aoins, la figure 4 sera analysée en ayant tnzjours présente a l'esprit la
figure 5.
1.5.2.2 - An$]xse des courbes traduisant la croissance gond&
----------_--_-------------------------- .w---
rale en fonction du EH
--.--s.---w--I-v------ -
La figure 4 comporte 5 courbes qui n'ont pas toutes la même impor-
tance ; les courbes A et B étant surtout les plus représentat;Jes de la crois-
sance (encore que des évaluations plus précoces auraient certainement été plus
significatives)
; les autres traduisent plutdt une croissance interférant avec
le vieillissement des cultures.
En nous fiant plus-à' la courbe obtenue après 7 jw-~ (A), nous es-
timons que la bande des pH optimums comporterait toutes les valeurs situees
entre 3,95 et 5,95. Il est vrai qu'à cette date déja, les pH limites correspon-
P
-
dant à ces deux valeurs sont de 6,90 et 7,20 ; autrement dit, meme à cet dge re-
6C
,
\\ I
,
7,
,/ \\
50
b(
\\0
4c
B i !I1.II\\
30
C 31
20
6 1 ’
,l1
F-ig. 4 - P. 0zy.m.e : croissance pondérale (mg) en fonction du
pH/PC/E"C/obscurité ; A = âge de 7 j ; B = 18 j ;
C =26j;D=37j;E=41j.
A
I
‘\\1,
*
-t*/
1 8
2 6
3 7
41J
Fig. 5 -- 1'. oryzae : croissance pondérale (mg) au cours du vieillissement
des cultures ; PC/25"C/obscurité.
PH0 : A = 2,35 ; 0 = 2,95 ; C = 3,95 ; D = 4,60 ; E = 5,30 ;
F = 5,95 ; G = 6,45 ; H = 7,0
; 1 = 7,50
PH
I
/
Fig. 6 a- P. oryzae : Régularisation du pH au cours du vieillissement des
cultures ; PC/Z"C/obscurité ; pH0 : cf fig. no 5.
(W
c
II/
4
:
I/I
//
/f
/I/
:
2
/
,/’
/
/
/
,
I
/
<
0,
3995
!5,30
a;45
*
7,50
pH
Fig. 7 - F’. oryzae : Croissanlce radiale (mm) en fonction
du pH ; PCA/25"C/obscuritë ; A = tige de 2 jours ;
B=4j;C=9j.
- 44 -
lativement jeune, les poids observés tiennent bien entendu aux pH de base
(3,95 ; 4,6 et 5,30) mais aussi aux effets certainement bénëfiques induits par
--
-
-
les pH intermédiaires (aux 3e, 4e, 5e et 6e jours par exemple) ; par là nous
voulions dire que l'accroissement pondéra1 observé n'était pas dû au SEUL effet
du pH de base ; l'idéal serait d'avoir un tampon suffisamment STABLE pour TOU-
JOURS NEUTRALISER les variations éventuelles induites par le parasite.
Cette contrainte n'étant pas rëalisée, il faudrait alors effectuer
des mesures au moment ou 1es"modifications du milieu sont les moins percepti-
bles, c'est-à-dire au 3e jour, peut être m&ne après 48 ou 24 heures ; mais
alors les valeurs observées sont tellement faibles que la marge d'erreur risque-
rait de conduire à des conclusions aberrantes.
La courbe (B) correspondant à une durée d'incubation de 18 jours
tralduit naturellement de manière plus prononcée les fluctuations du milieu ;
néanmoins, son allure genérale est conforme à la courbe précédente.
Nous observons qu'au 18e jour, l'accroissement pondéra1 au point
pH :z 2,95 est presque le double (57,7 mg) de celui observé à la méme abscisse
au '7e jour (24,l mg) ; cela signifie que le! pH 2,95 est hors de la bande opti-
male des pH puisqu'il faut au champignon un certain délai pour, qu'au terme
d'une activité m&e faible, le pH de base soit REHAUSSE à une valeur compati-
ble avec un meilleur épanouissement de son métabolisme.
Quant aux autres courbes traduisant la croissance en milieux liqui-
des (C, D, E), elles ne sauraient à notre avis, représen,ter VALABLEMENT la dynami-
que du phénomène étudié.
En effet, au-delà d'un certain dge, en l'occurence à l'dge 26, 37
et 41 jours il y aurait tellement de modifications (notamment du pH) que nous
ne sommes plus assurés que toutes les manifestations observées dépendent seule-
ment du pH.
Il faut 41 jours au parasite pour fabriquer 60,70 mg à partir du
pH de base 2,35 alors qu'en 7 jours, il synthétise 60,13 et 62,73 mg pour les
pH de base 3,95 et 4,60 respectivement, ce qui signifie en clair que le pH de
-
-
2,35 ne répond pas aux exigences du germe étudié.
- -
L
su....-UI
--I”“I-
--
..-
I-m
- 45 -
1.5.2.3 - Analyse des courbes traduisant le phénomène d'autolxse
-w-m --_11-_-1,--_-_-----_------"--
"mlmm-"-l..---"wl --
La figure 5, établie à partir du tableau 5 traduit le phénomène
d'autolyse ; ce phénomene serait d'autant plus précoce que le pH de base est
voisin de la valeur optimale. Par exemple : à pH = 2,95 le phénomène de lyse my-
célienne ne se manifeste qu'à partir du lt3e jour (environ) ; par contre, ce phé-
nomene est déclenché dës le 7e jour par les pH favorables de 3,95, 4,60, 5,30.
De même, l'autolyse mycélienne ne se manifeste qu'au delà du
41e jour pour pH 2,35.
Ces courbes traduisent parfaitement la dynamique des cultures du
parasite en fonction des délais d'incubation ; elles extériorisent 3 phases
continues et successives :
-. Première phase : la croissance mycelienne est supérieure à l'autolyse
mycélienne ; la croissance mycélienne du parasite est alors très active au tout
début de l'expérience :; le phénomène d'autolyse appara?t progressivement et
tend à neutraliser l'accroissement pondéra1 dont la vitesse s'amenuise ; cette
première phase correspond aux branches ascendantes des courbes.
-e Deuxieme phase :: la croissance myclilienne égale l'autolyse mycélienne ;
à mesure qu'augmente la durée d'incubation, le phénomène d'autolyse s'intensi-
file et parvient à équilibrer exactement lUaccroissement pondéra1 ; la conjugai-
son de ces deux phénomenes se traduit par un maximum qui, très certainement,
aurait correspondu à un plateau si nous avions pris le soin d'affiner autour
du délai optimum d'incubation.
- Troisième phase : la croissance mycélienne devient inférieure (en valeur
absolue) à l'autolyse mycélienne ; au fur et à mesure du vieillissement des cul-
tures, l'autolyse augmente au point de devenir prééminente par rapport à l'ac-
crloissement pondéra1 ; la résultante décro9t progressivement, ce qui correspond
aux branches descendantes des courbes.
Toutes ces données confirment parfaitement les conclusions tirées
de la figure 4.
1.5.2.4 - Régulation du pH-
La figure 6, matérialisant l'iwolution du pH au cours du vieillisse-
- 46 -
ment révèle, qu'excepté pour le pH de 2,35, tous les autres tendent vers 8,20
à 8,30 au bout de 41 jours.
-.
Cette évolution s'expliquerait par l'activité du champignon, la
preuve nous en est fournie par le fait que pour un pH très bas (2,35) où l'ac-
tivité du parasite est tres réduite, nous observons corrélativement une tres fai-
ble variation du pH. Cette hypothèse est conforme aux conclusions établies par
LILLY et BARNETT (1951) qui expliquerent le phénomene consideré à partir du mé-
tabolisme du champignon : le parasite utiliserait des anions et cations pour fa-
briquer et excréter dans le milieu des composes acides ou basiques (édifiés res-
pectivement par utilisation de glucides et d'amino-acides). Ainsi au-delà d'une
certaine date, le tampon ne parvient plus à s'opposer aux variations de pH im-
posées par le parasite.
C'est pourquoi, et en dépit de ce que nous avons soutenu par ailleurs,
la plus grande fiabilité de la méthode pondérale, il nous semble que pour le fac-
teur pli, la méthode radiale devrait fournir des résultats bien plus représenta-
tifs à la condition que les mesures soient réalisees très précocement ; encore
qu'on puisse nous opposer l'argument somme toute logique de l'accumulation des
produits excrétés par le parasite faute de migration possible sur un substrat
gélosé.
1.5.2.5 - Croissance radiale du parasite en fonction du EH
------------------,----
-_-----_-_--I__-------- -
S'agissant de la croissance radiale en fonction du pH (cf figure 7),
la prkocité des mesures suppose par exemple qu'au bout de 48 heures, le pH du
milieu soit tri% peu différent de ce qu'il était le jour de l'inoculation ; si
cette hypothèse est vraie, le pH 5,95 serait le meilleur pour la croissance my-
célienne ; la bande des pH observés en liquide s'expliquant par l'activité du
champignon qui rehausse tres t8t les valeurs de 3,95, 5,30, vers cette valeur
-
-
optimale.
II - PARAMETRES DE LA CONIDIOGENESE DE P. oryzae
-
De nombreux facteurs (température, humidité relative, lumière, pé-
riode d'incubation, nombre de repiquages, nature des substrats nutritifs, etc...)
influent sur la production d'organes de reproduction.
- 47 -
Ainsi par exemple, la production de conidies à partir de lésions
foliaires n'a lieu que par une humidité relative de 93 % ou plus ; on observe
par ailleurs une corrélation positive entre vitesse de sporulation et éléva-
tion de l'humidite relative (tout au moins dans certaines limites bien préci-
ses de l'humidité relative).
De m&ne, des feuilles sur pied porteuses de lésions placées à 100 %
d'humidité relative émettent des conidies pendant la seule période nocturne ;
l'émission débute peu de temps aprk la chute du jour, atteint un maximum en
quelques heures et décroft lentement pour s'arreter a l'aube.
Il semble que l'alternance obscurité-lumière soit nécessaire.
Dans ce paragraphe, nous nous proposons de tenter une approche de
la conidiogénèse en relation avec le milieu nutritif, la température, le pH.
C'est en considérant conjointement les aspects trophiques et ceux ayant trait
a la conidiogénèse que nous parviendrons a appréhender les criteres de choix
des conditions des cultures.
Le principe d'appréciation de la conidiogénèse sera le suivant :
- pour les cultures en milieu liquide-, nous ajoutons a la culture (en
erlenmeyer) une vingtaine de billes de verre, le bouchon de coton cardé est
recouvert de papier d'aluminium ; l'homogénéisation est obtenue après 2 minu-
tes d'agitation vigoureuse ; l'évaluation de la concentration conidienne se
faJt alors a l'aide de l'hématimètre de MALASSEZ,
- pour les cultures en milieu solide, 4 rondelles Sont prélevées par
bolke de Petri a 1"aide d'un emporte-piece de diametre intérieur égal a13mm.
Pour un essaidonné (un pH par exemple), 4 x 5 échantillons sont ainsi prUe-
vés et placés dans un erlenmeyer renfermant une vingtaine de billes de verre
ainsi que 10 ml d'eau distillée. La determination de la concentration conidien-
ne est réalisée comne précédemment.
Remarque : en raison des méthodes différentes de mise en suspension des coni-
dies, aucune comparaison directe n'est valable entre les chiffres obtenus pour
les milieux solide et ljquide.
On devrait cependant, en interprétant isolément chacun de ces résultats, abou-
tir a une m&me conclusion pour un paramètre donne.
- 48 -
2.1 - Influence du milieu sur la conidiogénese
2.1.1 - Précocité de la sporulation
On sait depuis longtemps (cf KREBS cité par BERDUCOU : thèse, 1957)
que, de façon générale, les conditions favorables a une woissance luxuriante
sont quelque peu défavorables à la prolifération d'organes de fructification ;
par contre la dessication des cultures, les variations subites de température,
l'appauvrissement du substrat sont autant de conditions favorisant le phénomène
de sporulation.
Certains milieux, par leur composition meme, sont plus favorables
8 la conidiogénèse que d'autres ; ainsi, le milieu modifie de GOTO (20 g de
grains d'orge lavés ; 1 g de feuilles de riz hachées ; 20 ml d'eau distillée
stérile dans un erlen de 250 ml) induirait une très bonne sporulation en 3 ou
4 jours.
Le choix des milieux pour les essais concernés a porté sur le PCA,
le PDA, le MISAT0 6.5/AGAR, l'ORGEOSE/A.
- La sporulation sur PCA et MISAT0 6.5 a été excellente dès le 5e jour
d'incubation à 25°C.
- Sur ORGEOSE, la croissance est luxuriante et parallèlement les organes
de fructification ne se manifestent que très tardivement vers le 12e jour.
- Sur PDA, 4 zones concentriques ont été examinées :
. les deux zones centrales et la région marginale (déjà décrite
au 2e chapitre) sont toutes trois exemptes de conidies,
. seule la 3e zone (bordant intérieurement la bande externe) révèle
des conidies vers le 12e jour.
2.1.2 - Caractéristiques des conidies en fonction du milieu
Les résultats suivants ont été observés sur PCA, MISAT0 6.5,
QRGEOSE.
- 49 -
PCA
ORGEOSE
Longueur moyenne
des conidies
24,39 (+ 0,48)
23,19 (+ 0,42)
21,40 (+- 0,37)
(Imicron)
Largeur moyenne
des conidies
8,96 (’ 0,19)
9,07 (’ 0,17)
8,71 (k 0,17)
(Imicron)
Nb de conidies
unicellulaires
Nb de conidies
bi'cellulaires
Nb de conidies
ai 3 cellules
9 6
Nb de conidies a
plus de 3 cellules
Nombre total de
conidies examinées
Taibleau 8 - P. oryzae : dimensions moyennes et cloisonnement des conidies en
-
fonction du milieu ; 25"/obscurité continue ; les valeurs entre pa-
renthèses désignent les intervalles de confiance.
2.2 - Influence de la température sur la conidiogénèse
La gamne des temperatures compatibles avec la conidiogénèse serait
comprise entre 10-l!i” et 35°C ; l'optimum thermique étant de 28OC. Cependant,
le rythme de la conidiogenese est fonction de la temperature ; ainsi à 28'C,
13émission des conidies est tres rapide jusqu'au 9e jour seulement ; par contre,
iI 16', 20" et 24' cette émission se poursuit m&ne au-dela du 15e jour (HENRY
et ANDERSON, 1948). La temperature letale des conidies est de 50°C en 13 a
15 mn dans l'eau ; cependant, certaines conidies survivent 30 heures a 60°C
lorsque l'environnement est sec (SUEDA, 1928).
Les températures expérimentales choisies sont : 10,5', 15", 17",
-v-
2Ei0 et 30" .
--, -
- 50 -
Le diamètre interieur de l'emporte-piece utilisé est de 6 mn.
L'inoculum utilise provient de la variété 302 G, il est dgé de
1.5 jours a 25°C sur PCA.
Les essais ont fourni les résultats suivants après 9 jours d'incu-
bation.
17"
20"
25"
30"
Précocitê de la
6e jour
6e jour
5e jour
5e jour
Concentration
17 333 1 89 000 1 156 333 1 206 666 i
Tableau 9 - P. oryzae : Précocité et intensité de la sporulation en fonction
de la température ; PCA/obscurité continue.
L'expression graphique de ces resultats (cf.fig,. 8) permet de situer
l'optimum thermique autour de 30'.
Nous nous posons ici la question de savoir quelle serait l'influen-
ce -si influence il y a- du transfert subit de l'inoculum de 25" vers les au-
tres températures ?
N'y a-t-il pas eu au cours de ce transfert un choc thermique qui
s'ajoute a l'effet direct de la température de 10,5O; 15"; 17"; 20" et 30' ?
2.3 y Influence du pH sur la conidiogénèse
2.3.1 - Sur la précocité de la conidiogénèse
Lableau 10 - P. oryzae : .précocitè de la sporulation en fonction du pH/PCA/
25O/obscurité continue.
SO
(“Cl
Fig. 8 - P . oryzae : Intensité de la conidiogénhe (milliers
de conidies/ml) en fonction de la température ;
PCA/âge = 9 j/obscurité.
- 52 -
2.3.2 - Intensité de la conidiogenese en fonction du pH
60 666 157 666 1
432 333 389 333 3:
Tableau II - P. OPyzat? : intensité de la conidiogénèse (exprimée en nombre de
- - - -
conidies/ml) en fonction du pH a 25OC après 16 jours d'incubation
En milieu solide, les valeurs adéquates de pH se situent entre
4 60 et 5,95 (cf'flg. '9, courbe.A). Par contre,
-L-.
les résultats obtenus en milieu
-e,-
liquide (cf fig. 9, courbe B) situent cette bande entre 3,95 et 5,30. Enfin,
- -
compte-tenu de l'évolution des pH de base que nous avons évoquée au début de
ce chapitre et que nous retrouvons naturel'lement ici (cf devenir du pH après
16 jours : tableau 11), il serait normal que nous décalions la bande jugée conve-
nable vers les pH rétilés par l'essai sur PCA ; en effet, nous devrions pour in-
terpréter,
tenir compte du fait que la valeur de 432 333 conidies (pour le pH
de base 3,951. serait partiellement imputable à une action du parasite qui élève
ce pH pour les raisons déjà évoquées.
2.3.3 - Caractères des conidies en fonction du pH
-
Nous nous proposons de voir si les divers pH induisaient une varia-
tioln significative dans les dimensions des conidies.
\\l
\\\\\\I\\
Fig. 9 - i). oryzae
: Intensité de la conidiogénèse (milliers de
conidies/ml) en fonction du pH ; 25"C/dge = 16 j/obscurité ;
A = PCA ; B = PC.
- 54 -
-
Nb de conidies
unicellulaires
Nb de conidies
bicellulaires
Nb de conidies
tricellulaires
Nb de conidies
a plus de 3
cellules
Total conidies
examinees
Tableau 12 - P. oryzae : dimensions moyennes et cloisonnement des conidies en fonc-
-
tion du pH ; culture sur PCA tamponné, dgée de 8 jours, a 25"C/
obscurité continue.
NB - Les valeurs entre parenthèses désignent les intervales de confiance
Afin de cerner le type de liaison établi entre dimensions des coni-
dies de P. oryzae et pH initial du milieu de culture (PCA), nous avons évalué les
paramètres de la régression considérée ; les valeurs observées sont les suivan-
tes :
- par rapport à la longueur des conidies :
. le coefficient de régression observé est r = -0,73
. la pente de la droite de régression
m = -0,60
. l'ordonnée à l'origine
b = +26,23
- 55 -
Ces résultats révèlent une regression négative très significative
C/r/ = 0,731 voulant exprimer que la longueur des conidies de P. oqzae est in-
versement proportionnelle à la valeur des ~HO (tampon Mc Ilvaine).
Conformément aux travaux de ALBERTINI et al. (1972) sur CoGtiewn
bekjerinckii, C. cardinate, Hetmintihosporim teres, H. sati,vwn et dans la 1 imi -
te des pH compatibles avec une bonne croissance et une bonne sporulation, les co-
nidies de P. ozyzae sont d'autant plus longues que le pH0 est bas etinversement.
- quant à la régression éventuelle entre largeur des conidies et ~HO, elle
est à nos yeux peu significative puisque les valeurs observées sont :
r = -0,lO
m= -0,lO
b = +9,02
- enfin, nous avons comparé par test statistique les longueurs moyennes
des conidies à pHo 3,95 et pHo 7,50 (cf les valeurs extremes du tableau no 12) ;
- -
nous trouvons :
t= 8,33 pour un t,,,5 = L! au seuil de 5 %
La différence étant tres hautement significative tant au seuil de 5 % qu'à ce-
lui de 1 X, nous pouvons rejeter l'hypothèse nulle et postuler que le pH ini-
tial exerce une action significative sur la longueur des conidies de P. oryzae.
2.3.4 - Cinétique de la sporulation
Cette expérience réalisée en milieu liquide vise à déterminer la pé-
riode optimale d'incubation pour une sporulation maximwn.
Le milieu de base a été tamponné à pH = 5,30 ; l'incubation a eu
lieu à 25°C.
I --
Périodes d'incubation (j)
5
7
14
18
2 6
Nombre de conidies ml
par
13 333
124 DO0
471 666
227 333
253 000
-
-
Devenir du pH de base
5,95
6,70
7,60
8,00
8,20
A
Tableau 13 - P . oryzae
-
: cinétique de la conidiogénese ; PCA/25"C/pH, 5,30.
- 56 -
La période optimale d'incubation â 25°C pour un pH de base a 5,30
serait de 14 jours environ.
III - PROBLEMES RELATIFS A LA GERMINATION DES CONIDIES
-
-
Les spores sont des structure3 r microscopiques spécialisées, autono-
mes et pouvant initier une croissance nouvelle ; toute intervention écologique
ou visant à cerner le spectre de répartition de germes économiquement importants
devra, sous peine d'inefficacité, tenir compte de la germination des spores.
La germination quant â elle sera définie comme un processus dans le-
quel partie ou totalité des métabolites nécessaires sont présents ab initia
dans l'organe considéré ; c'est dans la nature qualitative et quantitative de
ces réserves que réside le degré de dépendance de la spore en germination vis-
â-vis des titabolites exogènes.
Outre cet aspect trophique, ce phénomène physiolog ique*est fonct ion
de parametres divers tels par exemple la température, le pH, 1 'oxygène, la
concentration conidienne, etc....
La turgescence des spores par exemple (donc la présence d'eau) pa-
raTt ëtre une règle générale ; elle a été observée et décrite pour les sporan-
giophores (BULLER, 1934), les ascospores (GWYNNE-VAUGHAN et WILLIAMSON, 1927),
les basidiospores (HESSE, 1876 ; BRODIE, 1936) et les conidies (BONNER, 1948 ;
GOTTLIEB, 1953 ; HAINES, 1930 ; MANDELS et DARBY, 1953 ; SORGEL, 1956 ;
YARWDOD, 1932 ; etc... ). Il faudrait remarquer que les conidies des o'ïdium ne
s'hydratent pas avant germination et constituent l'exception â la règle généra-
le universellement admise ("Water and germination" par V.W,, COCHRANE in
"Physiology of Fungi", 1958). De plus, il arrive que des spores morphologique-
ment normales ne germent qu'après une certaine période ; de telles spores se-
raient en phase soit de maturation (ladite période est alors relativement brè-
ve), soit de dormante (plusieurs semaines â plusieurs mois) ; le taux de germi-
nation pouvant varier en conséquence, chaque expérience réalisée ici sera analysée
par rapport â un témoin fraichement établi â partir de la même suspension coni-
dienne.
Enfin, le phénomène physiologique qu'est la germination révèle
trois manifestations successives :
- 57 -
- la turgescence,
- la division nucléaire (BAKER, 1945 ; BELLINGER, 1956),
- l'émission du tube germinatif.
Sous peine de demeurer partielle, notre interpretation devra tenir
compte du taux global de germination et de la dimension du tube mycélien qui,
d'une certaine façon, visualise la cinétique du phénoméne.
Nous nous limiterons dans ce qui suit a l'étude de la germination
des conidies de P. oryztze en fonction de la concentration conidienne, de la
température,
de la lumière et du pH.
N.B. : "BAIN D'ARRET" : au bout du délai fixe d'incubation (5 heures),
nous stoppons l'évolution de la germination ainsi que le développement des tu-
bes mycéliens par addition de 2 gouttes d'acide acétique concentre ou de formol.
3.1 - Germination en relation avec la concentration conidienne :
-
-
Résultats. exoression. discussion
--
--
Nombre conidies
490 000
245 080
122 500
61 250
30 125
observés
-
-
%
45
61,66
75,77
66
76
Germination
- - -
Nombre de
conidies
300
300
300
300
300
-
--
-
t
- - -
Longueur tube mycélien
(microns)
66,64
80,08
86,38
83,15
85,68
- - -
-
-
Nombre de tubes mesurés
79
75
75
75
75
--
-
-
Tableau 14 - Influence de la concentration conidienne sur la germination des
conidies de P. oryzae ; expérience réalisée à 25"/obscurité
totale/durée d 'incubation de 5 heures.
NB - Chaque pourcentage ind iqué est une moyenne entre 3 mesures isolées effec-
tuées à partir de 3 lames a concavité différentes.
- 58 -
Nous constatons (tif tabléau 14) qué le taux de germination ainsi que
la longueur du tube germinatif sont plus élevés (75,77 % et 80,OB microns res-
pectivement) pour la concentration moyenne de 122 500 conidies/ml que pour celle
tres forte de 490 000 conidies/ml [les valeurs obtenues sont de 45 % et 66,64
microns respectivement] ; cette réduction, notée pour les concentrations coni-
diennes élevées tiendrait au phénomène d'auto-inhibition ou “SELF-INHIBITION”
qui a été très étudiée chez Urornyces phaseo2i (YARWOOD, 1954-1956), chez
Puccinia graminis tritici (ALLEN, 1955) et P. helianthi (YARWOOD, 1956).
L'auto-inhibition, dont l'existence a éte établae in uiuo et in vitro
tiendrait, par exemple chez P. gruminis tritki, à l'intervention d'une subs-
tance thermostable, plus efficace à pH élevé et qui serait relativement inacti-
vable par les surfaces de verre.
,?yricuZaria oryzae serait lui-même générateur d'une toxine appelée
pyricularine et toxique vis-à-vis des conidies du parasite dont elle interdit
la germination ; lorsqu'il infeste un halte sensible, le parasite produit et
accunule parallèlement de la pyricularine dont il se prémunit par la synthèse
d'une "PYRICULARIN-BINDING PROTEIN" formant avec la toxine un complexe non toxi-
que pour le champignon mais toxique pour le riz.
Au-delà de ce problème expérimental, l'auto-inhibition joue un rble
écologique essentiel en ce qu'elle réduit la germination des spores au niveau
des fructifications ; les spores non germées sont plus résistantes aux agres-
sions du milieu que ne le sont celles germées ; ce qui en fait les agents de
dispersion par excellence.
3.2 - Germination des conidies en fonction de la température : résultats,
expression, discussion
Evs
5
11
15
2 0
2 5
T
3 0
4 0 ’
4
5,33
31,7O
8 8
90,66
8 5
0
3 0 0
3 0 0
3 0 0
3 0 0
3 0 0
3 0 0
3 0 0
3,14
4,49
40,69
56,58
66,14
47,22
0
5 0
5 0
5 0
5 0
5 0
5 0
5 0
Tableau 15 - P. oryzae : germination des conidies en fonction de la température.
- 59 -
Ree : les conidies ont été mises en suspension dans l'eau distillée à
concentration de 47 600 conidies/ml ; la période d'incubation, égale pour tou-
tes les températures, est de 5 heures.
Manifestement les très basses températures sont inadéquates pour
la germination des conidies ; nous pouvons aussi postuler que les conidies pla-
cées à 40°C ont été tuées puisqu'en les reprenant pour les incuber à 25°C (qui
semble proche de l'optimum thermique), il n'y a aucune modification, aucune évo-
lution, méme après 48 heures.
De plus nous observons une corrélation positive entre pourcentage
de germination et longueur du tube mycélien ce qui paraft normal puisque le
tube mycélien serait d'autant plus allongé que son émission est plus précoce.
3.3 - Germination des conidies en fonction du pH : résultats, expression
discussion
-
-
-
-w-e--
4
2,40
6,75
8,lO
-
Nombre conidies
5 4
germées
0
79
--~
Nombre conidies
non germées
100
21
4 6
Total
100
--
% germination
92
96
5 4
/
I
--
Longueur tube
germinatif
43,4
43,86
39,5
20,06
(30 conidies)
('t 23)
P 63)
(' 5,72)
(-: 2,63)
-
-
Nb tubes germi-
natifs avec
appresorium pour
0/5Q
x/50
3150
0/50
0/50
t
50 conidies
---I-l---L
Tabileau 16 -
-
-
-
Germination des conidies de P.. oryztze en fonction du pH ; mélange
volume à volume de la suspension conidienne et du tampon Mc Ilvaine
dans la lame à concavité ; incubation de 5 heures/25'C/obscurité.
- 60 -
De façon genêrale, les spores germent au sein d'une fourchette de
pH plus restreinte que celle qui est caractéristique de la croqssance mycé-
lienne ; cela pourrait s'expliquer par le fait que les spores ne disposent pas
d'un délai suffisant pour modifier par leurs dérivés métaboliques un milieu à
pH de base peu favorable.
La plupart des germes cryptogamiques, dont P. a.~@&, germent mieux
entre pH 4,5 et pH 6,5 et présentent une réduction notable à pH 3 et pH 8.
3.4 - Germination des conidies en fonction de l'heméroperiode : resultats,,
expression, discussion
Nb conidies germées
8
90
50
Nb conidies non
germées
92
10
50
Total
100
100
100
% germination
8
90
50
Longueur tube my-
célien (micron)
16,80
,32,20
40,13
Moyenne pour
P W)
(* 3,6)
(+ 493)
30 conidies
p.20 conidies
Tableau 17 - Germination des conidies de P. ~wyzae en fonction de l'héméro-
période : L = 5 heures lumière ; L t 0 = 2 heures lumière +
3 heures obscur ité ; 0 = 5 heures obscuri té ; incubation a 25".
La lumière continue semble peu favorable à la germination ; par
contre, l'alternance lumineuse et l'obscurité continue induisent une bonne ger-
mination.
- 61 -
Discussion
Il est évident que des chapitres aussi importants que complexes
tels les mécanismes agressifs (toxines, enzymes), les mecanismes de variation...
du parasite meriteraient d'(5tre abordés ou approfondis ; cependant, nous avons
voulu nous en tenir a ce PREALABLE PROSPECTIF sur la base duquel nous en arri-
vons au probleme crucial de la lutte contre le parasite.
De par son essence méme (et à fortiori de par l'esprit qui le guide
de nos jours), l'art qu'est l'agriculture est source de rupture des équilibres
naturels ; ainsi, les modifications physico-chimiques du milieu, l'introduction
de cultivars élaborés au point de ne.persister qu'avec le secours de l'homme,
le maintien des memes génotypes dans une meme aire géographique, le retour d'une
culture sur elle-meme pendant plusieurs annees l'usage abusif de pesticides,
etc..., s'ils assurent une meilleure production à court terme, n'en engendrent
pas moins de graves problèmes si l'on en juge par l'équilibre instable des rela-
tions hote-parasite nouvellement établies apres intervention de l'homme : l'exem-
ple du riz et du Pyticulatia oryzae est à ce propos édifiant ; dans la suite de
cet ouvrage , nous voudrions aborder le problème de l'eradication du parasite ou
mieux, celui du maintien de ce dernier en-dessous d'un seuil économiquement to-
lérable par le biais d'auxiliaires naturels.
2ÈME
P A R T 1 E
C O N T R I B U T I O N A L ’ E T A B L I S S E M E N T D ’ U N E
M E T H O D E D E L U T T E B I O L O G I Q U E C O N T R E
Fymhilaria ozyzae Cav.
- 63 -
;
Les systèmes foliaire et radiculaire; ainsi que les milieux associes
(phyllosphere et rhizosphère respectivement) sont le siege d'une population bal>-
tisée spermoflore et dont le r61e et la nature sont des plus variables.
Certains de ces germes sont parasites actifs, d'autres saprophytes
vrais, d'autres encore sont dits sy/biotiques.
Quant a la composition qualitative et quantitative de la microflore
saprophyte, elle varie suivant l'espèce de végetal (KERLING, 1964), l'$ge des
feuilles (DICKINSON, 1967), la température, l'h&n&op~riode et l'humidité rela-
tive qui est particulierement importante.
La microflore caractéristique de la rhizosphère serait relativement
plus stable que celle de la phyllosphère soumise a de fréquentes fluctuations
du milieu.
La population microbienne foliaire serait en outre liée au stade
phys iologique de la plante h8te ; ainsi, l'activité maximale serait observée
pendant la période de floraison en raison d'un apport de grains de pollen
(FOKKEMA, 1968, 1971 ; DIEM, 1970).
La connaissance de la biologie, du rble et des potentialités des
germes foliaires exige comme.préalable l'isolement et l'établissement de cultu-
res pures et monosporees des germes considérés (cf annexe technique no 4).
Nous .savons qu'au cours de la phase infectieuse (ou après une blessu-
re), le végétal peut manifester une réaction de rkistance par le biais d'inhi-
biteurs préexistants et connus sous le terme de phytoncides.
Nous savons également que suite à l'infection, l'hbte peut fabriquer
"de TU)VO" des substances (phytoalexines) inhibitrices à l'end.roit du germe exo-
gene.
Au-delà de ces observations, force nous est de constater que dans
la diversité de la flore fongique, il existe des espèces souvent banales qui,
de par leur comportement (hyperparasites de germes phytopathogenes ou produc-
teurs de toxines antifongiques), permettent d'envisager une forme de lutte bio-
logique.
D'un autre cote, l'implication de la mycoflore dans la technologie
alimentaire (fromages et fermentations diverses), le large spectre d'utilisation
- 64 -
des antibiotiques tels la pénicilline, la streptomycine, la tyrothricine (éla-
borés par Penicilliwn notatum, Streptomyces griseus et BaciZZus brevis respec-
tivement), la blasticidine S (produite par Streptomyces griseo-chromogenes
FUKUNAGA), témoignent de l'intétit considéwble porté aux genérateurs de tels
produits).
L'utilisation d'auxiliaires microbiens dans la lutte contre les ma-
ladies est des plus diverses :
- activités antibacteriennes des champignons,
- action antifongique de certains champignons,
- effets des batteries et actinomycètes sur les champignons,
- champignons entomophages,
- particules virales destructrices de certains champignons,
- bactériophages, etc....
Nous nous bornerons ici a examiner quelques exemples permettant de
cerner l'état actuel des recherches traitant des champignons mycoparasites :
- Des feuilles de riz préalablement inoculées par une race avirulente de
CochlioboZus miyabeanus (forme parfaite de He&inthosporiwn oryzae) sont moins
sujettes a l'infection par une race phytopathogène du germe (SINHA et TRIVEDI,
1969).
- Selon les travaux de Mc LEAN (1967), DEVERALL et al. (1968), l'infection
des feuilles de melon ou de feve par des races virulentes de CoZZetotrichum
orbicuZare et C. Zindemthianurn respectivement est moins grave si elle est pré-
cédée par l'inoculation par une race avirulente des germes correspondants.
- De m&w, on observe une réduction notable des urédospores de MeZampsora
occidentalis par Trichodeyma, E8’picoccum,
AspergiZZus spp qui sont autant de ger-
mes communément présents sur les feuilles de peuplier ; la germination des uré-
dospores semble très affectée in vitro (BIER, 1965).
a- Enfin, les plants de riz développés a partir de semences trempées dans
un extrait de culture d’HeZminthosporiwn oryzae BREDA de HAAN, manifestent une
meilleure résistance que ceux issus de semences non traitées (GANGLY et
PADMANABHAN, 1962).
De nombreuses recherches permettent désormais d'affirmer que la pré-
sence d'une microflore naturelle, notamment sur les parties aériennes telles que
-
- 65 -
les fleurs, les fruits, les feuilles, les tiges, engendrerait un milieu fon-
gistatique vis-a-vis de certains agents phytopathogènes.
Des études approfondies expliquent l'antagonisme in uitro soit par
un phenomène de mycoparasitisme,
soit enfin par l'implication de substances
antibiotiques inhibitrices : FAWCETT (1931), PORTER et CARTER (1938), WAKSMAN
(1945), WEINDING et a1 . (1950)) WOOD et TVEIT (195!i), DARPOUX (1960)) BARNETT
(1963, 1964)) BOOSALIS (1964) et TOUZE-SOULET (1967).
'
Dès lors, toute intervention pouvant altérer qualitativement et/ou
quantitativement la population microbienne du biotope (traitement pesticide no-
tarwnent) devra etre soigneusement dosée :
- NOUS savons par exemple que, lorsqu'un sol prealablement sterilisé est
recontaminé par certains parasites telluriques (germes occasionnant la fonte
des semis en l'occure'nce), les symptbmes morbides observes sont plus prononcés
que sur un sol non sterilisé au niveau duquel le parasite se trouve neutralisé
par les microorganismes antagonistes (LILIAN E. HAWKER, 1950).
- Des feuilles de seigle porteuses de densites variables de germes sapro-
phytes (pulvérisation soit par l'eau , soit par une solution de bénomyl) sont
soumises a une infection par C. miyabeanus juste avant floraison ; on remarque
que les échantillons préalablement pulvérisés par l'eau présentaient une quan-
tité de necroses inférieure de 60 % a ceux prétrajtés par le bénomyl ; dans cet
essai, réalisé en 1972-1973 en parcelle expérimentale, le fongicide avait dé-
truit la microflore saprophyte normalement antagoniste du parasite (FOKKEMA,
VAN DE LAAR, NELIS-BLOMBERG et SCHIPPER, 1975).
La présente étude vise a révéler in vitro les aptitudes des micro-
organismes épiphytes à s'opposer à l'infection du riz par Pyricularia oqpae
et a en dégager le mécanisme ; l'isolement et la caractérisation des produits
impliqués ainsi que les expérimentations in vivo retiendront notre attention au-
dela de notre cadre actuel de travail.
Du reste, avant d'expérimenter in vivo (sur l'hbte ou les organes
de l'h6te maintenus en survie) , il n'est pas inutile d'opérer ,in vitro où les
conditions de croissance sont a priori plus favorables que celles offertes par
l'hbte dans son milieu naturel.
Les investigations actuelles distinguent le parasitisme (par exemple
- 66 -
le mycélium de Trichodem s'enroule autour des h.yphes de Rhizoctonia solani),
de l'antagonisme (où l'agent auxiliaire intervient a distance par le biais de
substances inhibitrices diffusibles) et du phénomene conjugant les deux prédé-
de!lt!j .
Nous parlerons d'ANTAGONISME pour désigner indifféremment l'un
quelconque de cestrois aspects ; souvent d'aillews, les phénomènes que nous
avons observés traduisent l'interférence entre parasitjsme de contact et anta-
gonisme avec predominance de l'un ou de l'autre selon les conditions expéri-
mentales.
Les composantes de cette deuxième partie seront abordées dans l'or-
dre qui suit :
- Définition du matériel biologique et criblage sélectif des germes sapro-
phytes.
a- Mise en évidence du phénomène d'antagonisme in vitro.
- Essai d'interprétation du phénomène d'antagonisme.
- Action de quelques fongicides comparée à celle des germes antagonistes.
- 67 -
CHAPITRE PREMIER
DEFINITION DU MATERIEL BIOLOGIQUE ET
CRIBLAGE SELECTIF DES GERMES SAPROPHYTES
I- GERMES
CRYPTOGAMIQUES
1.1 - 3@+&4Zaria oryzae Cav.
Nous pouvons le caracteriser par la formule globale
Sel 3ü2 G (N)H2OUS exprimant qu'il s'agit de la souche no 1 de P. oryzae isolée
à, partir de fragments infectés du cou (N = NECK) de la varieté Sefa 302 G et
incubés sur papier filtre stérile inhibé d'eau distillée stërile (H2ODS).
1.2 - Germes saprophytes isolés à partir du riz
-
-
La microflore concernée est isolée à partir des 4 hôtes suivants :
- BOUAKE P11
- variété Se 302 G
- variété IKONG PAQ ou IKP
- variété TTW
Pour chacun des organes (graine, cou, feuille) des variétés préci-
tées, les méthodes d'isolement utilisées (lavage, impression, observation direc-
te avec ou sans désinfection) sont consignées dans l'annexe technique no 4 figu-
rant à la fin de cet ouvrage.
Afin de matérialiser la variété hote d'origine ainsi que la réparti-
- 68 -
tion des germes isolés selon les organes de l'h8te et.en fonction des techni+
ques d'isolement, nous formulons les résultats sous forme de tableau à triple
entree (cf tableau 18).
1.3 - Germes fournis par BAARN
- Alternuria dauci
(KÜHN) GROVES et SKOLKO
- Aureobasidiwn pullulans (DE BARY) ARNAUD
- Chaetomiwn gz0b08m ~(UN~E ex FR.
- Epicoccwn purpwuzscens EHRENB. e.x SCHLECHT. (Extra)
- Epicocczun purptcmscens EHRENB. e.x SCHLECHT. (E. oryzae souche ITO)
- GZioeZadiwn roseum (LINK) BAIN
- Gonatobrotys simplex CORDA
- Gonatobotyywn maculicolum (WINT.) SACC.
- Myrotheciwn verrucatia (ALB . et SCHW. )
- Penieillium f’requentans WESLING
- Pyrieulatia oryzae CAVARA
,- Ttichoderma viride PERS. ex S.F. GRAY
TOUS ces germes cryptogamiques ainsi que Coniothyrium minitans sont
reproduits sur PCA/25"/obscurité continue,
II - CRIBLAGE SELECTIF EN VUE DU CHOIX DES GERM_ES UTILISABLES DANS UNE PERSPEC-
TIVE DE LUTTE BIOLOGIQUE (Planche no 1)
Disposant ainsi d'une série de germes, nous nous proposons d'en ré-
véler l'activite antagoniste éventuelle sur la base du degrP d'inhibition de la
croissance mycélienne radiale du parasite. Ne sont retenus au travers de ce cri-
blage sélectif que les germes exerçant une inhibition jugée significative et qui
serviront de base pour une étude mieux approfondie.
Dans cette première étape , seul le parasite est issu d'une culture
monoconidienne.
Au moment du criblage sélectif, tous les germes y compris P. oryzae
avaient évolué pendant 7 jours a 25"C, sur PCA et a l'obscurité continue.
La confrontation se fait par inoculation simultanée d'un disque
- 69 ..
~ I I
”
. < - - - - - _ -
-
C O U
Organes /
T
Feuille
Grain
Technique!
isolement
:; tmptomyces sp
1 = Impression
l Streptomyces sp
CurvuZaria lunata
I. I _^“._---
-L ---
-
-
0.1). = Observatior
,?.,,;ur~iuYrl
Aspeqillus niger
directe :: 1 heure
AspergiIlus niger Botrytis
agitation dans
Rspergillus flavus VerticilZium
H2QDS + séchage
BOUAKE
I-~--I
.-
-l---
O.D.D. = observat
?Il
directe après dé-
Curvularia lunata sinfection par hy,
Helminthosporiwn
pochlorite de so-
dium, 10 % pdt7mr
L = lavage dans
H20DS
4
Streptomyces sp
Streptomyces sp
CurvuZaria luna ta
1
GZiocladiwn X4
Aspergilk4s flavus
AXI l?.,
I Y
Curvularia
AX2 ('?I
L34sar4um rosewn
O.D.
Fusarium
:KONG-
Penici lliwn
Streptomyces
PAO
Stu~eptomyces
Curvuluria lunata
Fusarium
Pusariwn roseum
Pyricu laria oryzae
Helminthusporium
O.D.D.
RamuZaria
Pyricularia oryzag
uQCl2)
L
1
---
--
Botrytis
Fusariurn
SEFA
DrechsZanz rostratz
0-D.
302 G
---
O.D.D. -
-
-
--
L
1
Rhizopus nigricans
O.D.
TTW
O.D.D.
L
.----
1
--
-
ableau 1.8 -
-
Germes cryptogamiques isolés à partir de 4 variétés de riz.
- 70 -
inoculum du parasite à 30 mm du disque reptisentant le germe teste ; les deux
rondelles étant disposées symétriquement par rapport au centre de la bofte de
Petri (cf annexe technique no 5).
Enfin, l'appréciation du pourcentage d'inhibition de la croissance
radiale du parasite par le microorganisme testé est basée sur la relation
(VAN DEN HEUVEL, 1970) :
Mo = croissance normale exprimée en mm ; Mo reprësente le rayon opposé à la co-
lonie du germe testé.
M = croissance mycélienne influencée (mn)
Mi = pourcentage d'inhibition de la croissance mycélienne du parasite par le
germe testé.
L'ensemble des résultats figure dans le tableau 19.
Au terme des confrontations, nous obser-
vons diverses conformations qu'illustre
le schéma théorique ci-contre :
P = colonie du parasite
A - colonie du germe dont on recherche
le caracterë antagoniste
Mo = croissance radiale (mn) distale de
la colonie parasite (Mo = R)
MZ croissance radiale à proximale de
la colonie parasite (M = r)
(C) - action par contact
(D) = action à distance
= action a distance et par
(D) + (') contact
0
ff!!3clA
P
+D
- 71 -
Germes confrontés
Remarques
avec PJ. oryzae
Chaetomiwn globoswn
1 208 1 8,0 1 60,O 1 Action nette à distance
Epic~ccwn purpurascens ITO /
21,O j 15 ,O j 28,5
/
GZiocladiwn rosewn
-
Alternaria dauci
E2;tioccwnpurpu~~scens Extra
-
Aureobasidium puZZuZans
Gonatobotrywn macuZicoZum 1 22,0 1- 18,O 1
18-,0
Idem
&potheciwn verruearia
21 ,o 1 13,O 1 38,0 1 Action nette à distance
-
Trichoderma vitide
Gonatobotrys simplex
FmiciZlium frequen tans
1 19,O 1 . 17,0 1
:10,5
ILimitat. mut. par contact
Aspergillus fZavus
18,0
13,0
27,8
-
AspergiZZus niger
20,o
12 ,o
-40 ,o
- -
Cuxvularia elavata
19,0
10,o
47,4
Action inverse de 46 %
Cztmularia Zuna ta
20,o
10,o
750 ,o
Action inverse de 50 %
Dr*echsZera .rostrata
--
Fusartwn. roseum
invirse de 50 %
Coniothyrium minitans
19,0
Action inverse de 11,l %
II
GZiocZadiwn X4
--
Starkeyomyces
koorchalomo&les
Contrôle = Sel X 0
1 24,0 1 24,0 1 0,O 1
Tableau 19 - P. oryzae : croissance radiale et inhibition de la croissance
radiale par les germes cryptogamiques. Observations réalisees
après incubation de 5 jours sur PCA/25'/12 heures lumière +
12 heures obscurité. Chaque valeur moyenne est établie à partir
de 5 bortes de Petri,
_ - , _ _ -
-
_...
.‘““~rall>““~““*“----~------~~
- - - . - - ~
-.-
-....
^.-
-..-
- 72 -
III - GERMES SELECTIONNES
A la lumiere des résultats ci-dessus, nous nous sommes arr@tes aux
trois germes suivants pour l'etude de ce type d'interaction :
- Ttidwdem~ titi& en raison du taux d'inhibition relativement important
(59 %) exerce sur le parasite.
- Chaetomiwn gZohosm qui exerce un taux d'inhibition de 60 % est de plus
responsable d'une action a distance et d'une action par contact.
- Enfin, Myrotheciwn verruearia retiendra notre attention en raison d'une
très nette action a distance.
Ces résultats appellent cependant quelques remarques, voire quel-
ques restrictions : les trois germes sélectionnés l'ont éte sur la base d'une
expérience in vitro ; cela signifie que dans les conditions expérimentales
(confrontation sur PCA, température de 25"C, cycle lumineux homophasique),les
germes retenus paraissent les plus intéressants ; rien ne laisse supposer que
lesdits microorganismes manifestent une activité inhibitrice supérieure a celle
des germes non sélectionnés au cours d'expériences in &VO, pr&ues ultérieu-
rement et ce, en raison m&ne de la nature 'complexe des interactions possibles
entre la plante et le germe saprophyte ; interactionsdont la nature peut engen-
drer des effets tout a fait différents de ceux observés in vitro.
- 73 -
CHAPITRE DEUXI,EME
MISE EN EVIDENCE DU PHENOMENE
D'ANTAGONISME
in vitro
I- PRELIMINAIRE
Les cultures pures établies peuvent, en fait, Rre chacune un mélan-
ge de plusieurs souches possédant chacune des caracteres propres ; nous expéri-
menterons pour tous les germes sélectionnés (P. oryzae, T. viride, C. gzobosm,
et M. verrucaz4a) à partir de cultures monospores afin de limiter au mieux les
aleasinhérents au matériel biologique lorsqu'il est soumis à l'action des di-
vers paramètres.
L'Établissement des cultures monoconidiennes se fait par examen mi-
croscopique en chambre de VAN TIEGHEM selon la technique utilisée dans la pre-
mière partie pour P. oryzae (paragraphe intitulé "Méthode de la dilution amelio-
réel' ) .
Ainsi, nous avons pu disposer de :
- 7 cultures monoconidiennes de T. virick,
- 12 cultures monospores de C. g’loboswn,
- 9 cultures monoconidiennes de M. verruearia,
- le nombre de cultures monoconidiennes de P. oryzae étant de 18 dont
11 obtenues a partir de la variéte Se 302 G et 7 de la varieté IKP,
Dans la suite des travaux, nous utiliserons strictement :
- la souche no 5 de Trichodema viride no,tée T5. viride,
- la souche no 1 de Chaetomiwn
globosum notee C,. viride,
- 74 -
- la souche no 1 de Myrotheciwn uerrucaria notee Ml. verrucaria,
- le parasite étant représenté par la souche 1 utilisée des le debut de
cet ouvrage et notée Sel ou PJ. oryzae.
Par ailleurs, la largeur de la zone d'inhibition de Sel ou le pour-
centage d'inhibition de Sel par le germe testé est fonction de la vigueur du
germe et de celle du parasite ; cela veut dire qu'en fonction du substrat nutri-
tif gélosé, de la température, de l'h&néropériode, du pH, etc..., le parasite
aura plus ou moins le temps de se développer avant que "l'antagoniste" ne le
contrarie soit à distance, soit par contact.
E:n bref, la largeur de la zone d'inhibition peut etre affectée par
un retard de la croissance de lJisolat "antagoniste" par rapport à P. oryzae et
inversement ; d'où la nécessité d'étudier le comportement intrinsèque propre à
chacun des microorganismes sélectionnés.
Il importe aussi de cerner quelque peu la biologie des germes choi-
sis sur les plans trophique, thermique, lumineux, ainsi que l'influence du pH.
Nous avons simultanément réalisé l'éitude du comportement des germes
en fonction des paramètres précités.
1.1 - Comportement des germes en fonction Ge la température
Les températures retenues sont de 15, 20, 25, 28 et 37°C ; les cul-
tures sont suivies jusqu'au 10e jour ; les résultats sont consignés dans le
tableau 20.
Remarques : - pour une température et un délai d'incubation donnés, x désigne
une moyenne de'3 valeurs moyennes ; chacune étant obtenue à partir de 2 mesures
effectuées le long de 2 diamètres perpendiculaires pour la bofte de Petri consi-
déde,
- tous les germes incubés à 37°C sont transférés a 25"/obscurité
au bout de 7 jours ; le but de ce transfert est de savoir si la température de
37°C est létale ou provoque simplement une inhibition réversible ; les résultats
sont représentés par le tableau 21.
-_
I-_-I______-<_
_I_ -.-.-..--. -- -.--
.“,_~“u----“-.....-~--II-
e.--m-
--.
m-v
I-
A!ile
Germe
PJ. ozyzae
Tg. viride
Cl. g lobosum
MI. verrucar&z
0)
(“Cl
_I_--
15
-
$0
25,5
13 ,Q
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2 0
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25,0
15,0
10 ,o
2
2 5
12,0
38,0
19,5
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2 8
15 ,o
12,0
21,0
14,3
3 7
00
$0
$0
-
-
- -
$0
15
-
00
42,0
18,0
990
2 0
16,O
43 ,o
24,0
13,0
3
25
17.0
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27,7
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2 8
21,0
16 ,O
29,3
18,7
3 7
$0
7,O
$0
$0
-
15
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5 4 , 0 - -
22,3
11 ,o
2 0
19 ,o
60,0
30,o
17,0
4
2 5
26,0
84,0
35 ,o
18,O
2 8
28,0
19 ,o
35 ,o
25 ,O
3 7
790
00
@O
$0
- - -
- -
15
-
17,o
33 ,o
16,O
2 0
32,0
51,0
26,0
7
2 5
36,0
> 90
53,7
27,7
2 8
49,0
50,o
40,5
3 7
$0
15,0
990
_--
-
- -
-
-
15
23,0
40 ,o
20 ,o
2 0
41,0
63 ,O
32,0
9
2 5
48,0
> 90
62,0
36,0
2 8
64,0
58,0
53,0
3 7
Transfert
Transfert
Transfert
Transfert
à 25OC
à 25°C
à 25OC
à 25°C
_--
-
15
-
26,0
42,0
22,0
2 0
48,0
35 ,o
1 0
2 5
55 ,o
> 90
64,0
40,3
2 8
72,0
63,0
58,0
3 7
Transfert
Transfert
Transfert
Transfert
à 25°C
à 25°C
à 25°C
à 25°C
- - -
Tableau 20 - Croissance radiale (mm) de PI. oryzae, T5. viril, c
gtobomn
et Ml. verruearia en fonction de la température ; PC&obscurite
continue.
A/
I
I
I
3c
Fig. 10 - Pl. oryzue (D) ; TA. viride (A) ; Cl. ghboszun (B) ;
Ml. verrucatia (C) : croissance radiale (mm) en
fonction de la température ; PCA/4 j/obscurité.
- 77 -
Cl. gZoboswn
Ml. vewucaria
20,o
12,o
27,0
16,O
45,0
27,0
Arret de la lumière au 4e jour et permanence
dans obscurité continue du 4e au 18e jour
-1
18
> 90,o
> 90,o
> 90,o
> 90,o
Blocage
puissant mais
Reversibilité Réversibilité
réversible
très précoce
tres précoce
Tableau 21 - Croissance radiale (mm) de PJ. ort/zae, 1”s. viride, Cl. globosum,
Ml. verrucatia prealablement incubes 7 jours a 37"C/obscurité
continue et transféres a 25"C/PCA.
La représentation graphique du comportement des germes en fonction
de la température après 4 jours d'incubation est matérialisée par la figure 10.
1.2 - Comportement des germes en fonction de l'héméropériode,
Nous soumettons les germes implantés sur PCA à 3 éclairements :
- lumiere continue = LUM soit 24 h/24 lumiere
- alternance lumineuse = LUM + OBS soit 8 h lumiere + 16 h obscurité
- obscurité continue - OBS soit 24 h/24 obscurité.
L'ensemble des resultats est représenté dans le tableau 22..,
1.2.1 - Résultats
Cl. gzoboswn
T5. viride-
--
LUPl
LUM i
LUM
LUM i
OBS
LUM LUM -
-UM + OBS
OBS
OBS
DBS
OBS
OBS
LUM
IBS
-
-
Conidiogenese
- Précocité
4e j
4e j
4e j
4e j
4e j
zko
zéro
6e j
4e j
4e j .4e j
i
- Intensité
t+t
ttt
ttt
t
ttt
tt
6Fj
1
relative
6?j
t
tt+
+-t-i- " tt+
..--
-
-
i
-
-
Age incubation
2j
13 ,o
-T-
14,0
23,3
24,0
23,0
17,7
16,3
13,0
12,5 12,5
-
-
3j
18,3
21,0 20,5
38,7
46,7
36,3
27,7
26,0
32,3
18,O
17,0 16,0
-
-
-
- -
-
23,7
27,0
26,0
57,3
65,0
55,0
38,0
34,7
39,0
23,2
21,5 20,O
-
-
75,0
> 90
74,0
46,0
I 29 ,o 34,0 32,0
42,0 47,0
28,0
26,0 25,0
- - -
6j
35,0
40,o
39,0
> 90
> 90
> 90
56,0
47,0
52,7
33,0
-
-
-
-
-+
7j
40,0
47,0
45,0
> 90 > 90
> 90
65,0
55,0
59,7
39,0
35,0 33,0
-
-
-
- -
-
/
1
46,7
53,0
50,o
> 90
> 90 > 90
72,0
62,0
65,0
43,0
39,0 37,0
-
-
-
-
/
Ci
52,0
56,0
54,0
> 90
> 90 > 90
> 90 > 90
> 90 47,5
44,3 41,0
-
-
I
10 j
58,7
63,0 60,O
> 90
> 90 > 90 > 90
> 90 > 90
52,0
49,0 44,3
-
-
11 j
69,0 67,0
> 90 > 90
> 90 > 90
> 90 > 90
56,0
53,0 48,0
-
-
Tableau 22 - Croissance radiale (mn) de Pl. oryzae, T5. virile, Cl. globosum et
verruearia sur PCA/25' en fonction de l'héméropériode et du délai
d'incubation .
- /Y -
Remarques : - Chaque valeur du présent tableau désigne une moyenne entre 3 me-
sures issues chacune d'une moyenne entre 2 evaluations determinées selon 2 di-
mensions perpendiculaires de ?a colonie.
- S'agissant de la conidiogBnèse,excepté
Cl. gtobosm pour lequel
les fructifications sont apparues vers le 6e jour, le phénomene s'est manifesté
dès le 4e jour pour les autres germes. L'intensité de la conidiogénèse est appré-
ciée visuellement et matérialisée par des croix :
+++ = excellente conidiogénèse
++ = conidiogénèse bonne
+ = conidiogénèse moyenne.
1.2.2 - Caracteres descriptifs en fonction de l'héméropériode
- 1’5. vitick : colonie poudreuse ; l'intensité de la teinte verdatre est
liée à la conidiogénèse ; la croissance se fait par "bonds" ; on distingue sur
la colonie, des bandes de coloration et de complacité variables : plus la bande
considérée est dgée (bordant extérieurement le disque inoculum), plus dense est
le rrlycélium.
- Cl. gZoboswn : nous observons une colonie régulière qui, au 4e jour est
morphologiquement identique quelle que soit l'héméropériode.
- Ml. Vermcaria : colonie d'un blanc laiteux ; les anneaux observables
sont liés a la conidiogénèse et sont d'autant plus compacts, continus et pig-
mentés que celle-ci est plus prononcée.
1.2.3 - Expression graphique
Figures 11, 12, 13 et 14.
1.3 - Comportement des qermes en fonction du pH
Nous avons opéré avec le PCA tamponné à 20 % par le tampon de
Mc Ilvaine, d 25°C et à l'obscurité ; nous avons arbitrairement choisi 3 va-
leurs : faible, moyenne et forte de pH autorisées par l'échelle Mc Ilvaine.
b'inoculum effectivement utilisé est âgé de 4 jours sur PCA ; les
disques inoculum sont prélevés à la périphérie Ides colonies.
bd
7
6
Fig. 11 - P. oryzae
: Croissance radiale (mm) en fonction de l'hémé-
ropériode et du délai d'incubation ; PCA/25"C ;
A = Lum + Obs ; B = Lumière ; C = Obscurite.
*.,““..-mm,.q’--“-*-~-~--
. . ~
__<_
--.
-.-
---_-_-__-_
-----..-
-11
_.. --.-.--
_*---
Fig. 12 - TA. virile : croissance radiale (mm) en fonction
de l'héméropériode et du délai d'incubation ;
PCA/25'C
; A = Lum + Obs ; B = Lumière ;
C = Obscurité.
1
w
2
1
b
t
&
0
J
Fig. 13 : Cl. gtobosm : Croissance radiale (mm} en fonction de
1 héméropériode et du délai d'incubation ; PCA/X"C ;
A = Lum t Obs ; B = Lumiere ; C = Obscurité.
s
3
b-
I
I
1
8
8
11 J
Fig. 14 - MI. verrucaria
: croissance radiale (mm) en fonction de l'hé-
meropériode et du délai d'incubation ; PCA/E"C ;
A = Lum + Obs ; B = Lumière ; C = Obscurité.
- 84 -
1.3.1 - Formulation des résultats
--
--
---
---
--
---
---
---
'Tableau 23
m--- - Croissance radiale (mm) de Pl. orpre, :Vs. mX&, Cl. g'lobosum et
Ml. zwrrwaria en fonction du pH. PCA/25'C/obscurité continue. Chaque
valeur est une moyenne établie à partir de 3 mesures moyennes.
1.3.2 - Caracteres descriptifs en fonction du pH apres 3 jours
d'incubation
- PJ. oryzae : cf première partie.
- PS. viride
. A pH 3,50 : la croissance est tres rapide ; autour du site d'ino-
culation, nous avons une zone annulaire large de 20 mm caractérisée par un my-
célium très fin, se confondant presque avec le milieu gélosé ; bordant extérieu-
- 85 -
rement cette zone, nous découvrons une bande large de 10 mn dont le mycelium
est plus "aérien", cotonneux ; c'est le site de P?US intense conidiogénèse ;
enfîn, a la périphérie, une plage de 5 mn d'un lmycélium très diffus.
. A pH 5,75 : wcélium enchevetré lkhement ; teinte d'un blanc
cendré.
. A pH 7,50 : rn&nes caractères qu'a pH 5,75 ; cependant la conidio-
génèse est absente jusqu'au Ile jour compris.
- Cl* g:lobosum
: le mycélium est dense, "levuriforme", d'un blanc laiteux ;
à pH 3,50 le contour des colonies ne se régularise qu'au 9e jour alors que
cette irrégularité persiste au-delà du Ile jour pour les colonies développees
à pH 7,50.
- Ml. verrumria : le disque inoculum est cerclé par de tr& fins anneaux
noirs ; le reste est d'un "blanc-hyalin" ; on observe la formation d'un anneau
caractérisé par un mycélium floconneux dense, relativement aérien par rapport
au reste et qui correspond à la zone de conidiolgénèse légèrement pigmentée.
1.3.3 - Expression graphique
Figure 15 (établie après 3 jours d'incubation).
1.4 - Synthèse
L'approche de la biologie et de la physiologie des germes concernés
nous autorise à expérimenter dans les conditions suivantes :
- Substrat nutritif : milieu à base de pomne de terre-carotte, soit sous
forme solide (PCA), soit sous forme liquide (PC) ; ce milieu facile à préparer
donne des résultats satisfaisants pour tous les microorganismes.
- Température : nous opérerons à 25°C eu élgard au fait qu'une température
-
donnée est toujours plus ou moins favorable à l'un ou à l'autre germe ; en au-
cun cas nous ne pouvons satisfaire simultanément les exigences thermiques opti-
males de tous les germes.
- Héméropériode : nous travaillerons à l'obscurité continue (hémérop&iode
nulle) compte tenu du fait que nous ne sommes pas toujours assutis de pouvoir
disposer d'un équipement adéquat (muni d'une rampe d'éclairage).
7c
(mn>
6l
!5(
40
3f
mm
---
2c
- - - - - - - - - - O I - - - . - - -
D-
-I--t+ %z
I
)
!5,75
7950 pH
Fig. 15 - Pl. oryzae (A) ; 85.z>itide (B) ; Cl. gZobosum (C) ;
Ml. verruearia (D) : croissance radiale (mm) en
fonction du pH ; PCA/25OC/3 j/obscurité.
- 87 -
- EH : deux valeurs de pH sont retenues ; l'une basse (3,O à 4,lO)et ï'au-
tre élevée (5,55 à 6,0).
La définition des paramètres expCri:mentaux parait Ctre liée à la
nature de l'équipement du laboratoire, ce qui est tout a fait logique ; mais
il nous faut dire que ce choix répond dans une certaine mesure aux exigence:;
des germes étudies ; de toute façon, nous ne pouvons retenir que des VALEURS
MOYENNES puisqu'une valeur spécifique tres favorable a un microorganisme donne
(pH de 3,50 pour Tg. uitidts) peut se montrer moins favorable pour un autre
(pH de 3,50 pour PJ. oryzae).
Ces précisions étant apportées, nous allons aborder le problème de
la mise en évidence du phénomène d'antagonisme dans les conditions expérimen-
tales préalablement définies.
II - EXPERIENCE DE MISE EN EVIDENCE DU PHENOMENIE D'ANTAGONISME in vitro :
CONFRONTATION SIMULTANEE (C.S.) DU PARASITIE AVEC LES GERMES "'ANTAGONISTES"
2.i. - Appréciation de l'inhibition (%) exe,rcee par les germes antagonis-
tes sur la croissance radiale (mm) de Pl. orgzae
-
-
-
-
Nous faisons appel a la méthode de confrontation simultanée (décri-
te dans l'annexe technique no 5 et usitée dans le criblage sélectif réalisé au
chapitre 1 de la présente partie) sous les conditions expérimentales définies ;
le tableau 24 matérialise les résultats observés après 5 et 7 jours d'incuba-
tion et pour deux valeurs de pH.
--
---.-..--.
- - -
_-_-_~
l*il,(LII,)-<l,.-.-.-l-.----.--^---.---
- 88 -
Age
(j9
----
5
Tableau 24 - Pl. oryzae : croissance (en mm9 et inhibition de la croissance
- -
(%9 radiale au cours d'une confrontation simultanée ; PCA/25"C/
obscurité continue.
2.1.1 - Caracteres descriptifs
2.1.1.1 - --_------------
Examen macroscopiqug (Planche no II 9
2.1.1.1.1. - Pl. orgzae x Fg. v-bide
- pH 3,50 : le développement de la colonie parasite est bloqué dès les
premières 48 heures en raison notamment du pH particulierement favorable au
Tgs viKde et peu favorable au PJ. orpae (cf comportement des germes vis-a-
vis du pH9 ; la zone proximale (par rapport au site d'inoculation de "l'antago-
niste") de la colonie parasite est souvent le siège d'une auréole en forme de
croissant de couleur brun jaunâtre à jaune et dont l'intensité va décroissant
jusqu'à s'annuler sur le côté distal de la colonie.
TA. vitide qui exerce principalement ici une action par contact par-
vient, dès le 7e jour, à englober la colonie parasite corwne pour "l'étouffer" ;
dès lors, le développement de Pl. oryzae est définitivement stoppé ; la colonie
du parasite envahie par "l'antagoniste" est également inapte à produire des or-
ganes de fructification.
--_-_--I___-
-_-_. ----.-.-
- --_-.- --,.
- 89 -
m. pH 5,59/: le phénomène est moins prononcé en raison du pH relativement
elevé qui "contrarie" la croissance de T5. uimk!e alors qu'il exerce sûrement
une action bénéfique sur PJ. oryzae ; ce qui impose donc au Tg. vitide un dglai
plus important pour bloquer le parasite ; ce dernier, exploitant ce sursis,
s'étale lateralement et du côte oppose au Tg. ~iz%zk.
J?emar*es : Dans les deux cas, nous observons que la pigmentation ("brun cara-
n1") est d'autant plus intense que la zone considérée de la colonie du parasi-
te est lplus soumise a l'effet inhibiteur de TA. viride.
De plus, une intense inhibition de la croissance radiale du parasite
se traduit par une croissance aérienne de celui-ci, lui conférant une épaisseur
croissante ainsi qu'une densité plus élevée a mesure que l'on se rapproche du
site d'inoculation de "l'antagoniste".
2.1.1.1.2 - Pl. oryzae x CI. ggloboswn
- pH 3,50 : en raison de la croissance rad,iale relativement faible de
CI ,. gldxwum, le contact entre les 2 colonies n)'est pas établi au 3e jour ;
pourtant, nous observons une très nette "régression" de la colonie parasite met-
tant en valeur l'intervention précoce d'une action à distance ; le contact est
bien établi au 7e jour ; nous remarquons que la zone de la colonie de Q. oryzae
contigu8 à l'antagoniste se caractérise par un très bon développement aérien,
témoignant de ce que cette zone subit une actioln inhibitrice plus intense que
celle exercée sur la zone distale. Il y a donc ici superposition d'une action
à distance et d'une action par contact.
'- pH 5 ,!55 : l'action (de Cl. gZobosm est ici très nette et la gravité de
1 'inhibition se manifeste {comme précédemment
; corrélativement à la densité
mycélienne du parasite, il se développe une pigmentation brune répartie dans la
zone épaisse en forme de woissant à la limite commune des 2 colonies.
2.1.1.1.3 - PI. oryzae x MI. verrucaria
a* pli 3 ,50 : la vitesse de croissance relativement élevée de PJ. oryzae
(par rapport à "l'antagoniste") lui permet de sle développer notamment du coté
distal et latéralement ; sa croissance n'est donc que partiellement limitée en
dépit d'une action à distance très nette dës les 3e et 4e jours.
Nous observons également le phénomeme d'épaississement dont nous
- 90 -
avons pr@cédemment fait état ainsi qu'une pigmentation (brun cendré) qui lui
est liée.
a- pH 5 ,!j5 : en dehors de la taille plus grande de la colonie parasite, nous
n'observons aucune différence particulière par rapport au pH 3,50 ; le cbté
dista'l de la colonie parasite semble nettement moins affecté par la présence de
Ml* verruca2-iia.
2.1.1.1.4 - Remarque
En aucun cas, nous n'avons remarqué une odeur particulier'? émanant
des milieux de confrontation.
2.1.1.2 - Examen microscoeigue (Planche no III)
--------w--m--- - - -
Pour tous les types de confrontation, nous avons, au 3e jour, réali-
sé des préparations microscopiques à partir des régions proximale et distale de
la co'lonie du parasite et les avons examinées par rapport au témoin.
2.1.1.2.1 - PJ. oryzae x T5. vitide
a- pH 3 ,!jO : lorsque nous examinons le mycélium parasite prélevé du coté
proximal par rapport à la colonie "antagoniste" (par souci de briéveté nous
l'appelerons "mycélium proximal" par opposition au "mycélium distal"), il se
montre contourné, pelotonne, épaissi, fortement branché et intensément colorable
par le bleu coton ; souvent, nous voyons apparaStre des morphoses rappelant un
"bala,i de sorcière".
Hormis l'épaississement observable sur certains filaments mycéliens,
tous les autres caractères se trouvent plus ou moins dilués au niveau du "my-
célium distal".
'-'< piH 5 1 55 : le "mycelium proximal" présente souvent un ensemble de filaments
fortement entrelacés longitudinalement ; nous trouvons parfois des cellules my-
céliennes isolées hypertrojphiées et situées sur le trajet mycélien à la manière
de chlamIydospores (remarquer qu'ici les cultures sont dgées de 3 jours) ; nous
observons ég,alement un épaississement mycélien,
de légères ramifications courtes
ains-i que des torsades et pelotes terminales.
- 91 -
Tous ces caractères semblent moins prononcés lorsque l'examen porte
sur le "mycélium distal".
2.I.I.2.2 - Pl. oryzae x cl. g Zoboswn
Le "mycélium proximal" issu des cultures à pH 3,510 est souvent
vrillé ou fortement torsade ; aucune déformation notable n'a été observée pour
le "mycelium distal" ou pour le mycélium obtenu à pH 5,55.
2.1.1.2.3. - PI. oryzae x Ml. verrucaria
lia seule observation positive porte sur le "mycélium proximal" issu
du pH 5,55 ; les filaments mycéliens sont vrillés deux à deux rappelant étran-
-
gement les 2 torons du DNA.
2.1.2 - Expression graphique des résultats (fig. 16 A et C) :
Interprétation
-
-
L'intensité de l'inhibition exercée sur le développement de la colo-
nie du parasite relève de 2 facteurs :
- L'effet d'inhibition relative ("relative inhibitory effect" ou RIE) étant
quantifié par la relation
Mi
= RIE = !kJ x 100
R
toute augmentation du rapport R - r élève le pourcentage d'inhibition correspon-
R
dant ; à mesure qu'augmente le délai d'incubation (passage de 5 à 7 jours), l'ac-
croissement de r s'amenuise voire s'annule du fait de la proximité du germe
"antagonjiste" ; à la limite, r devient constant puisque dans notre cas, le para-
site ne croît pas par-dessus la colonie antagon,iste ; parallelement, la croissan-
ce de R se poursuit même faiblement du côté distal ; la résultante de ces deux
phénomenes explique -partiellement du moins- l'accroissement de l'inhibition
lorsqu'on passe de 5 à 7 jours.
Dans le cas particulier du T5. uiride
à pH 3,50, nous observons une
RIE constante (55,8) du fait que le Trichodermç: enveloppe entièrement la colonie
parasite et empêche toute possibilité d'épanouissement.
- 92 -
- Le pH intervient fondamentalement ; ainsi, à pH 5,55, le Pl. oryzae se
trouvant relativement avantagé se développe rapidement, notamnent le long du
rayon distal ; parallèlement, le développement du cbté proximal de la colonie
du parasite se trouve limité par la présence de T5. virile, d'où l'augmentation
du pourcentage d'inhibition observée lorsqu'à 7' jours, nous passons de pH 3,50
(55,8 X) à pH 5,55 (73,7 X) ; il est évident que cet accroissement est forte-
ment influencé par le développement de la colonie parasite le long du rayon
distal.
Or, nous avons déjà établi que le 1'5. uitide se complait mieux à
pH bas (3,50) qu'à pH élevé (5,55) ; d'où lui viendrait donc cette subite capa-
cité d'inhiber plus intensément le parasite à pH élevé (5,55) qu'à pH bas (3,50)?
Le seul fait de poser la question pose le problème de la représen-
tativit@ de la relation
Mi
= RIE = Mo - M x 100
telle qu'elle a été jusqu'ici définie et utilisée.
D'un autre coté, lorsque le parasite est confronté avec l'un quel-
conque des germes antagonistes, nous avons observé que dans TOUS LES CAS, le
rayon de la colonie de Pl. oryzae opposé au site d'inoculation du germe antago-
niste était INFERIEUR à celui de Pl. oryzae sur "TEMOIN FRANC" ; cela signifie
que sur la bofte de confrontation, la colonie de PI. oryzae dans sa GLOBALITE
est PLUS ou MOINS affectée par le voisinage de l'antagoniste et qu'il serait
erroné de considérer le rayon distal de la colonie parasite (par rapport au
site d'inoculation de l'antagoniste) comme représentatif de la croissance norma-
le de P1. oryzae.
La c.roissance NORMALE doit être éva.luée sur la seule bofte de Petri
"TEMOIN FRANC".
De plus, en raison de la déformation de la colonie du parasite, le
phénomène sera certainement mieux apprécié sur la base de la colonie de
Pl. oxyzae confronté ou non ("TEMOIN FRANC") avec le ou les germes antagonistes.
Les surfaces sont évaluées au planimètre.
- 93 -
2.2 '- &wéciation de ll'lnhibition (%) exercée par les gens "antagonis-
u---
te~~'~~ur lis croissance en surface (cm2) de PI~ wwe
.I. II I ---_--
Le tableau 25 rëcapitule l'ensemble des résultats afférents a cette
etude.
2.,2.1 - Résultats
3,50
5,55
-.--
Signifi-
Mo et M
Signifi-
cation
(cm21
cation
--.-
4,63
s (U,, = 0)
46,9
3,94
s (U, = 10:
s (U, - 0)
17,4
4,78
NS
s (U, = 0)
15,1
5,58
NS
-
-
s (U, = 0)
4,29
s (U, = 0)
s tu,, = 0)
5,76
NS(U,=37,5;
s (U, = 0)
5,30
NS
-
-
9,58
s VJO = 0)
71,7
7906
s (U, = 0)
s (U, = 0)
20,6
8,14
S (U, = 6,5
NS
839
6,79
S
-
-
s tu,, = 0)
81,7
9,85
s (U, = 0)
s UJ,, = 0)
22,8
11,79
S
VS(Uo=26,5)
13,7
10,03
S
-
-
29,62
s (U, = 0)
85,8
13,25
s (U, = 0)
s UJ,, = 0)
28,l
15,89
S
s (U, = 0)
17,0
13,40
S
Tableau 25 - PJ, cîrgacte : inhibition (% par rapport au 'témoin franc") exercée par les
-w-----v
germes antagonistes sur la croissance en surface (cm2) pour 2 valeurs de
pli et en fonction du delai d'incubation ; PCA/25"/obscurité.
- 94 -
Remarpesl : - Chaque mesure de surface est une mloyenne calculee a partir de
mbortes de Petri.
-T= Sel x 0 désigne le “TEMOIN FRANC" et correspond au parasite
développés isolément.
2.2.2 - Expression numérique des résultats
Le pourcentage d'inhibition est évalué sur la base de la relation
Mi = Mo - M x 100
où
MO
MO = croissance mycélienne du parasite en surface (cm2) sur “TEMOIN FRANC"
M = croissance mycélienne du parasite en surface (cm2) sur bo9te de Petri
essai
Mi - pourcentage d'inhibition exercé par les germes "antagonistes" sur la crois-
sance du parasite.
Pour chaque pH, pour chaque délai d'incubation de chaque type de
confrontation, le pourcentage d'inhibition est calculé et consigné à la place
qui lui correspond dans le tableau 25.
2.2.3 - Signification
*
Le problème est de savoir si les pourcentages d'inhibition observés
nous autorisent à conclure a une action significative des germes "antagonistes"
sur le parasite ; en clair, nous devons voir si les différences observées entre
le développement du parasite seul ("TEMOIN FRANC")et celui du parasite confronté
à un "antagoniste" donné (ESSAI) ne sont pas duesaux seules fluctuations d'échan-
tillonnage.
Pour un pH (ex : 5,55) et un délai d'incubation (ex : 3 jours) donnés,
chaque valeur (ex : 3,94 cm2 pour la confrontati'on Sel x ITg. vitide) est compa-
rée au témoin qui lui correspond (en l'occurence 4,63 cm2) non pas sur la base
des moyennes mais des 10 composantes de chaque moyenne ; ainsi, pour juger du
degré de signification de 3,94 par rapport à 4,6.3, nous comparerons les 2 séries
statistiques :
- 95 -
x (,témoi II) -+ 4,1/5,0/4,8/~4,9/4,3/5,0/5,0/4,9/4,3/4,0
- x = 4,63
y (essai) -+ 3,9/3,9/3,5/4,1/4,4/3,4/4,0/3,9/4,4/3,9 - jJ = 3,94
Appliquant le Test U de MANN et WHITNEY à ces deux series statisti-
ques, nous trouvons :
U0 = 10 (valeur inférieure)
ddll = 10
La table nOUS donne Uo,o5 = 23 avec { ddl2 = 0
Nous avons bien U. < Uo,o5 -4 nous pouvons affirmer avec un ris-
que de 5 'Z que les deux séries x et y sont significativement différentes au
seuil de 5 % ; en d'autres termes, le pourcentage d'inhibition 14,9 % exprimé
sur la base des valeurs 4,63 et 3,94 traduit concretement une action significa-
-
-
-
ti ve de T,5. virile sur Pl. opgzae.
Il est évident, par ailleurs, que DE PAR LA STRUCTURE MEME DU TEST
utilisé, le fait d'avoir chacun des caractères de la série (y) inférieur à
chacun des caractères de la série (x) nous autorise d'emblée à conclure a une
différence significative entre les séries (x) et (y) puisque U. = 0 < Uo,05
qui vaut, soit 23 (pour un effectif de 10) soit 2 (pour un effectif de 5).
Dans cette expérience et celles qui suivent, nous exprimons la
différence significative par (S) et celle non significative par (NS) sur le ta-
bleau des résultats.
2.3 -- Expression graphique des résultats : discussion
2.3.1 - Analyse comparative des pourcentages d'inhibition relative
des croissances radiale et e!n surface de a. oryzae confronté durant 5 et 7
-11_--
-
-
jours aux-germes
"antagonistes" (cf fig. 16 :
-
diagrammes A-C et 8-D respecti-
vement)
- Cl. ghboswn et MI. vermtcatia : lorsque nous considérons le pourcentage
d'inhibition de Pl. oryzae calculé sur la base de la croissance radiale du pa-
rasite confronité avec les 'antagonistes" precédents (de m&ne que TA. vitide pour
le seul pH 5,515), nous attribuons de fait aux germes concernés un pouvoir inhi-
biteur supérieur a celui établi sur la base de croissance en surface du parasi-
te confronté avec ces mknes microorganismes ; ce qui serait absolument erroné
I *‘s-*CC.-.-*“...m
---m-
_~_.-----
__-_.-.-_----~~~~~--_~
-_~---
------
_-”
m.2
l
11.
-
M
A
-
,
II-A
D
31
Fig. 16 - Diagrammes comparatifs des pourcentages d'inhibition relative de la croissance radiale (mm ; cf A et C) et de Ia
croissance en surface (cm2 ; cf B et D) de PJ. oryzae confronté pendant 5 jours (A et B) et 7 jours (C et D) aux
T5. viride 0 ; Cl. gtoboswn m ; Ml. verruearia m et pour 2 pH/PCA/E"C/obscurité.
- 97 -
puis+:lti"a nos yeux la deuxième méthode reflète plus fidèlement le comportement
du oarasiite dans sa globalité (contrairement a l(a Premiere qui ne rend compte
du phénoml5ne que le long d'une dimension).
- Deux comportements se dessinent lorsque le parasite est confronté avec
T5. uitick
. pH bas (3,58) : le pourcentage d'inhibition exercée par l'antago-
niste est constant au-delà (d'un certain délai d'incubation lorsque l'evaluation
se ,fait sur la base de la croissance radiale (le pourcentage observe est ainsi
de 55,84 % aussi bien au bout de 5 que 7 jours d'incubation) ; par contre, le
pourcentage d'inhibition est CROISSANT avec le temps lorsque l'évaluation se
fai,t sur la base de la croissance en surface ET PAR RAPPORT à un "TEMOIN FRANC"
(le pourcentage observé varie de 71,88 à 85,80 % lorsque le délai d'incubation
passe de 5 à 7 jours).
Dans le premier cas, le 95. uitide favorisé par les conditions expé-
rimentales (pH notamnent, cf à ce propos les tableau 23 et fig. 15) parvient
très précocement à englober totalement la colonie du parasite dont les 2 dimen-
sions R s(= Mo) et r (= M) dseviennent fixes ; d'ou la constance du pourcentage
d'inhibition.
Dans le second cas, la surface de la colonie du parasite en boite
de Petri essai est constante comme précédemment a partir d'un certain délai
d'incuba,tion tandis que se poursuit le développement de la col
sur boite de Petri "TEMOIN FRANC" ; la différence Mo - M
Mo-M
--. - I ce qui explique que Mo - M x 100 augmente et à la limite tende
MO
MO
vers 100 % si la surface offerte au parasite était infinie.
Ce qui permet également d'expliquer que, pour un m&me delai d'incu-
bation (5 ou 7 jours), le pourcentage d'inhibition soit plus élevé dans le deu-
xième cas (croissance en cmf2) que dans le premier cas (croissance en mn).
. pH 5,55 : cette valeur peu Convena&ble pour T5. ur:tide est favora-
ble au parasite,qui se développe bien ' avant de subir l'action inhibitrice de
% viride ; à aucun moment donc, la croissance de la zone distale de la colonie
du parasite n'est définitivement bloquée, d'où l'augmentation moins prononcée du
pourcentage di'inhibition observé dans les deux cas lorsque nous passons de 5 à
7 jours d'incubation.
” sn-,*1IMI<I1-------I
-
--m
.__ -_.. -...
..-----
.
--____~,
- 98 -
2.3.2 - Evolution du pourcentaae d'inhibition de la croissance
en surface (cm2) de Pl. oxyzag exercée par les germes "antagonistes" en fonction
e-.--m-
du temps, PCA/25"/pour 2 valeurs de pH/obscurité continue
M - - e - -
L'expression graphique (fig. 17 et 18) des résultats figurant au
tableau 25 permet pour ce type de confrontation, de visualiser l'efficacité re-
Native des germes "antagonistes" ; T5. vitide manifeste une nette supériorité
sur les, autres germes à pH 3,50 notamment ; l'interprétation de ces courbes im-
pose que 1'~ tienne compte de 2 facteurs :
- d'une part, l'activité intrinseque du germe "antagoniste" à l'encontre
du parasite,
- d’autre part, le caractère plus ou moins favorable des conditions expéri-
mentales (substrat nutrifiif, pH, etc...) vis-à-vis des germes confrontés.
En réalité, ces 2 facteurs sont indissolublement liés tant il est
vrai que le comportement physiologique de l'un quelconque des 2 champignons est
dépendant des conditions expérimentales.
2.3.3 - Représentativitë de chacune des méthodes
L'appréciation du pourcentage d'inhibition du parasite par le germe
"antagoniste"
sur la base d'une évolution de la surface qui tient compte de l'é-
volution GLOBALE de la colonie du parasite nous paraIt plus valable que celle
fondëe sur l'évaluation de la croissance radiale.
C'est à la lumiere de ce CONSTAT que dans la suite de nos expérien-
ces, toute confrontation donnant lieu à une collonie du parasite déformee sous
quelque influence que ce soit, nous conduira a apprécier ladite influence sur
la base d'une mesure de surface ; l'évaluation fondée sur la croissance radiale
sera cependant retenue toutes les fois que la colonie mesurée croft de façon
réguliere.
2.4 - Remarques
- Repiquant sur PCA frais des disques inoculum prélevés à l'intérieur des
limites définissant la colonie de PI. oryzae âgée de 10 jours et englobée par
Tg. z'zk& à, pH 3,50, nous, observons le seul developpement de BS. vitide ; cela
Fig. 17 - Evolution du pourcentage d'inhibition de la croissance en
surface (cm2) de PJ. ozyzae par Tg. viride (A) ;
Cl. gtoboswn (B) ; Ml. verruearia (C) au cours d'une
confrontatiom simultanée et en fonction du temps ; PCA/
25"/pHo 3,50/obscurite,
Fig. 18 - Evolution du pourcentage d'inhibition de la croissance en
surface (cmz) de Pl. oryzae par TA. vitide (A) ; CI. gZoboszun
(B) ; MI. verruearia (C) au cours d'une confrontation simulta-
née et en fonction du temps ;; PCA/25"C/pHo 5,55/obscurité.
- 101 -
signifie qu'à pH 3,50, le parasite a été très précocement bloqué et envahi par
Tg. virile tiotilt :a vitesse de croissance, la précocité et Y'intensite de coni-
dîogen&se sont peu ou pas m'odifiées par le vo,isinage parasite 1) T5. virile
exerce en retour une action radicale sur.&. oryzae.
.I
A ce même pH 3,50, l'inoculum suppose de FI~ i>2?2""! se développe
--.
normalement s'il est issu d'une confrontation avec .V2. v~~rtl~a~4a cependant que,
dans le cas de L 5+ gk&osza on voit se developper une colonie dont un secteur
correspond au parasite et un autre au cI. globosum.
- A pH 5,55, l'inoculum engendre un développement normal de ?:#. o~yzae
sauf dans le cas d'une confrontation avec ~2. gl&ostGr: ot2 nous observons une
évolution sectorielle comme à pH 3,50.
- Evaluation de l'intensité de la conidiogénese de FI. cjrgzae confronté
simultanément avec les germes "antagonistes".
Nous prélevons 7 disques inoculum de daamètre standard (6 mm) que
nous introduisons dans 4 ml d'eau distillee sterile ; nous ajoutons une quinzai-
ne de billes de verre et agitons vigoureusement ; l'appréciation de l'intensité
de ?a conidiogénèse se fait à 1'hématJmetre de MALASSEZ tant du côté proximal de
la colonie de PIa opyzae que du côté dlsta 1 par rapport à la colonie "antago-
niste".
Chaque valeur du tableau 26 ch iffrant les récultatst observés est
une moyenne de 3 mesures.
----_-
_-----_
._I.
---“-3^--.-.
.---
. - - _
-.-111
---
Souches croisé
avec Pl.
. verrucaria
oryzae
-.---------
Tableau 26 - PJ. o~yzae
~
: intensité de la conidiogenèse au cours d'une confrontation
simultanée avec les germes "antagonistes" ; PCA/25"/16 jours/obscurité
continue.
- 102 -
L'absence de conidies de PI. oqrzae englobe par T5. vitide a
pH 3,50 traduit la destruction précoce du parasiite ou la perte definitive de
sa capacité de se reproduire apr& invasion par le germe "antagoniste".
- 103 -
CHAPITRE TROISIEME
ESSAI D'INTERPRETATION DU PHENOMENE
D'ANTAGONISME
in vitro
I- REMARQUE PRELIMINAIRE
A la lumière des expériences de base, nous avons établi une RESTRIC-
TION imposée a la croissance du parasite par les germes que désormais, nous appe-
lerons ANTAGONISTES (suppression des guillemets) puisque s'opposant 3 la crois-
sance du parasite ; les observations réalisées nous permettent a priori, d'affir-
mer que l'inhibition exercée par les germes antagonistes implique au moins deux
mécanismes :
- une action à distance intervenant très pri-cocement dans le cas de condi-
--
tions expérimentales favorables au MI. verrucatitz ou au Cl. gZobosum et qui serait
due à la production par les germes pr&cités, de substances tr& diffusibles pou-
vant migrer depuis leur site de production pour aller agir à distance sur la co-
lonie du parasite avant m&ne que le contact ne soit établi entre les 2 inoculats,
- une action par contact due a une barrière physique édifice par deux germes
-
-
dont les mycelia ne sont pas miscibles ; ce type d'action qui prédomine chez
-4
TA. viride s'expliquerait partiellement aussi par la production de composes inhi-
biteurs peu ou pas diffusibles, ne se manifestant donc que tr& tardivement,
- enfin, une action régie par la conjugaison des 2 modes d'actions précé-
dents ; les substances produites ayant chacune ses caract&es et son pouvoir
"migrateur" propres.
- 104 -
Dans ce qui suit, nous nous proposons d'établir l'existence de tel-
les substances sur la base d'expériences réalisées en milieux solide et liquide.
II - CONFRONTATION DU PARASITE ET DES GERMES ANTAGONISTES SUR MILIEU SOLIDE
-
-
2.1 - Confrontation différée du parasite avec les germes antagonistes
Le principe repose sur le fait que l'inhibition exercée par les ger-
mes antagonistes est régie par la production de facteurs inhibiteurs de la crois-
sance du parasite ; ainsi, lorsque le germe antagoniste se développe sur un
substrat nutritif gélosé préalablement tapissé d'une feuille de cellophane (cf
annexe technique no 5), lesdits facteurs sont sensés diffuser à travers cette
paroi "selective" et migrer dans le milieu nutritif ; l'élimination de la feuille
de cellophane ainsi que celle de la colonie antagoniste après 48 heures d'incuba-
tion et l'inoculation immédiate du parasite permet de révéler, par mesure de la
croissance radiale mycélienne du parasite, l'implication ou la non implication
de facteurs inhibiteurs vis-à-vis du parasite et ce, par rapport à un témoin.
Dans cette expérience, les inoculats sont issus de cultures sur PCA
âgées de 3 à 4 jours/25"C/obscurité continue ; les 2 valeurs de pH sont de 3,65
e
t
6,20.
2.1.1 - Résultats
--
Traitements T = Sel x C
T5’ viride
7
-4pH 3,65F 6,20
Age (j)
-
-
3
20,5 20,2
4
1 27,9 / 27,6
22,9 (s) /24,3 (S)I 14,8 (S) 1 2038 6)
a,9 (s)
30,7
(s) 21,5 (S)
2734 (S)
6
1 41,J ( 40,3
36,7 (S)
37,l (NS) 26,7 (S)
3397 (S)
44,o (s) 144,8 (M)I 33,6 (S) 1 4196 6)
Précocité
4e et
4e et
conidiogénèse
5e j
5e j
Tableau 27 - ~II. o.ryzae : croissance radiale (mm) au terme d'une confrontation dif-
férée avec les germas antagonistes ; PCA/25"C/obscurité continue ;
moyennes établies à partir de 5 boftes de Petri.
- 105 -
La signification relative de ces résultats est matérialisée par
(S) ou (MS) conformément à la convention établie ; afin de ne pas surcharger ce
tableau, nous avons volontairement omis d'inscrire chacune des valeurs de U ob-
servée et comparée à U,,,5 : 2.
??
2.1.2 - Observations
2.1.2.1 - E:xamen macroscopique :: (Planche no IV)
-*------------s- - -m
Après élimination de la cellophane et de la colonie antagoniste,
nous observons que le substrat est coloré en fonction du germe antagoniste et
du pH ; ainsi :
- le substrat est teinté en brun rbsatre pdle à ocre jaune sur PCA (a pH
6,20 notamment) pour Tg. viride,
- Cl. globoswn engendre une teinte jaunâtre à pH 3,65 et d'un blanc crémeux
à pH 6,20,
- Ml. uermtcar2a laisse une teinte d'un blanc cendré plus ou moins verddtre
pour les deux valeurs de pH.
En dehors des différences de vitesses, de croissance des colonies du
parasite en fonction de la nature du "précédent" nous n'observons aucun carac-
tère particulier concernant la colonie de PJ. oryzae.
2.1.2.2 - Examen microscopique (apres 6 jours d'incubation)
--------------- - --
(Planche no V)
- PI” ozyzae x Tg. viKde : à pH bas, nous observons un épaississement my-
célien ainsi que des filaments mycéliens fortement entrelacés donnant par en-
droit des "pelotes isolées" formées par l'enchevétrement plus ou moins globo'lde
du filapnent.
- PJ" oryzae x Cl. globoswn : certains filaments mycéliens sont fortement
épaissis :; d'autres le sont Imoins mais sont soit agglomérés longitudinalement,
soit contournés.
- PJ. oryzae x MI. vermcaria
: filaments mycéliens fortement entrelacés
longitudinalement ou contourmés sur eux-m&nes ; parfois, nous observons des
cellules m,ycéliennes fortement épaissies se désarticulant facilement et inten-
sément colorables par le bleu coton ; nous avons enfin observe des torsades.
2.1.3 - Expression numérique des resultats
Sur la base du tableau 27, nous avons évalué les pourcentages d'inhi-
bition correspondants exercés par les germes antagonistes sur le parasite en
fonction du temps et par rapport au témoin ; les rkultats sont consign& dans
le tableau 28.
Traitements
Tableau 28 - PI. oryzae : pourcentage d'inhibition exercee par les germes anta-
gonistes au cours d'une confrontation diffetie, par rapport au
témoin et en fonction du délai d'incubation ; PCA/25"/obscurité
continue.
2.1.& Expression graphique : discussion
Il nous faut préciser que la compréhension de ces rkultats exige
que nous tenions compte de la nature du substrat nutritif : le production d'an-
tibiotiques serait plus importante sur milieu riche que sur milieu pauvre
(WRIGHT, 1952) ; de plus, il y aurait une correlation entre action restrictive
des antibiotiques et competition trophique ; cela signifierait qu'une inhibition
partielle de la croissance du parasite serait imputable a un épuisement de nu-
triments du milieu ; il semble que l'implication d'une compétition trophique
soit peu probable en raison d'abord de la richesse relative du milieu (PCA),
ensuite des périodes d'incubation relativement courtes (48 heures) du germe an-
- 107 -
tagoniste. Cette hypothèse serait à fortiori à écarter quand on sait que la
stimulation de la croissance du parasite a été observée dans certains cas.
L'inhibition de la croissance du parasite serait donc le fait des
seuls facteurs diffusibles produits par les antagonistes et ayant migré au tra-
vers de la "paroi sélective" qu'est la feuille de cellophane (facteurs de crois-
sance dans le cas d'une stimulation).
Cela dit, nous allons tenter d'interpréter le tableau 28 et les
courbes (fig. 19) matérialisant les résultats établis expérimentalement :
Dans tous les cas, nous observons une décroissance du pourcentage
d'inhibition en fonction du temps ; cela signifie que le parasite, fortement blo-
qué au diipart finit avec le temps par acquérir une croissance meilleure, quasi
normale :; la différence de croissance observée par rapport au tismoin relevant à
la limite du seul retard de croissance imposé par les facteurs antagonistes dif-
fusibles impregnant le substrat trophique.
Nous pensons que cette réduction du pourcentage d'inhibition est en
relation avec le délai d'incubation (48 heures) du germe antagoniste : les fac-
teurs diffusibles produits par les germes antagonistes au bout Ide 48 heures
n'imprégnant le substrat nutritif que dans une aire définie et ,fonction de la
vitesse de migration propre aux substances impliquées à condition par ailleurs,
que chacun de ces facteurs soit doté d'une stabilité satisfaisante ; autrement
dit, des délais d'incubation progressivement plus importants des germes antago-
nistes auraient probablement eu pour corollaire, une répartition plus importante
des facteurs diffusibles sur le milieu nutritif et partant, aur'aient engendré
une décroissance moins prononcée du pourcentage d'inhibition de la croissance
du parasite :
MI. verrucar4a manifeste une très nette supériorite sur les autres
germes ; ce germe qui nous est apparu secondaire (probablement en raison de sa
vitesse (de croissance faible) au cours d'une confrontation simultanée, se révè-
le ici des plus efficace et partant serait celui qui produit la ou les substan-
ces les plus actives contre le parasite qui nous préoccupe ; à moins toutefois
que les facteurs diffusibles engendrés par Ml. verrmcatia ne soient relativement
plus stables (donc plus viables) que ceux liés à T5. triride ou cz. ~ZO~OSUVI.
f/
I
+----
/<-.
4
3
4
5
6
7
J*
Fig. 19 - Evolution du pourcentage d'inhibition exercée
par TA. uiti&. (1 et 4) ; C . globosm (2 et
5) ; MI. verrucaria (3 et 63 au cours d'une
confrontation différée par rapport au témoin
et eh fonction du temps ; PCA/25"C/obscuritë.
- 3,65 pour (1) i2)-et (3) ; PH, = 6,20
p!:,-(4), (5) et (6j..
- 109 -
2.2 - @njugaison des confrontations simultanée et différée (CS x CD) du
parasite avec les germes antagonistes (Planches no VI et VII)
A la lumière des expériences précédenwnent rapportées, nous nous
proposons d'étudier le cas d'une association entre les 2 techniques de confron-
tations ; ainsi Pl. oryzae est confronté en différé à Ml. vermcaria et en Si-
multané a CI. gZob0sm et/ou T5. viride (cf annexe technique no 5) ; l'apprécia-
tion des résultats se fait par rapport à 2 témoins, l'un (Tl) correspond au dé-
veloppement de PJ. oryzae seul ; l'autre (T2) représente le développement de
PI- oryzae en différé avec Ml. verrucaria.
2.2.1 - Résultats
-
Tl=SelxO='FRANC"
T2=(3)XSel (3)X[Selx(l.)] (3)X[Selx(Z),
-
-
4,101
6,0
4,lO
6,0
4,lO
6,O
4,lO
6,0
-
-
-
-
2,lO
2,14 0,O 0,O 0,O
0,o
0,o
0,o
090 1 090 1
- - -
m-
3,38
3,44
0,O
0,64
0,O
0,o
0,o
0,6O
5,32
5,46
0,54
1,42
0,O
0,o
0,o
0,90
- -
7,44
7,82
1,06 2,44
0,O
0,78
0,2
1,06
090 0,76
- - -
- -
10,413
10,62
1,45
3,76
0,O
1,58
0,21
1,lO -4-i
0 ,o
0,94
- -
Tableau 29 - Pl. oryzae
-
: croissance en surface (cm') au cours de la conjugaison des
confrontations différée (=X) [par rapport à Ml. verruearia (3)] et si-
multanée (=x) bar rapport à Ta. viride (l,> et/ou Cl. g2oboswn (Z)] ;
PCA/25"C/obscurité continue.
Chacune de ces valeurs moyennes est calculée sur la base de 5 boites
de Petri.
L'expression numérique des résultats, ayant été faite par rapport à
T1 et par rapport à T2, la signification statistique des résultats ci-dessus
est rattachée aux tableaux 30 et 31.
- 110 -
2.2.2 - Expression numérique des résultats
292.2.1 - Relativement au témoin : TI = Pl. oryzae x 0
--.--------------------
.----
1
I
Trai,tements
1 (3)A[SeIx(l)] 1 (3)X[Seix(2)1 ) W3elxW(2)1 I
4,lO
6,O
4,lO
6,O
4,lO
630
1 0 0 ,O
100,o
100 ,o
100 ,o
1 0 0 ,o
100 ,o
1 0 0 ,o
100 ,o
100 ,o
82,5
1 0 0 ,o
86 ,o
-
-
-
-
1 0 0 ,o
100 ,o
100 ,o
83,5
1 0 0 ,o
88,6
1 0 0 ,o
90 ,o
97,3
86,4
1 0 0 ,o
90,3
--SP
1 0 0 ,o
85,l
98,0
89,6
1 0 0 ,o
91,l
Tableau 30 - 1'1. oryzae
I-
: éyolution du pourcentage d'inhibition de la croissance
en surface (cmd-) par les germes antagonistes au cours d'une conju-
gaison des confrontations différée (=X) [par rapport à Ml. verruearia
(3)] et simultanée (=x) [par rapport à 95. uiz&& (1) et/ou
Cl. gZoboswn (2)] et par rapport au temoin T1 (PJ. oryzae X 0) ;
PCA/25'/obscurité continue.
Toutes les valeurs de U, calculées d'après le test U de MANN et
WITHNEY sont nulles ; Uo,05 étant égale à 2 --, toutes les différences observées
par rapport à TI sont significatives et traduisent une action significative des
germes antagonistes dans ce type de confrontation.
- Relativement à T2 = !Sel X (31
2.2-2-2.
- - - - - - - - - - - -
- - - m
---<_-
---
(3)0 :1x(2)1
1 (3N%x(W)J
4,lO
630 l 4Jo / 6yo
-
I
-
I
-
-
632 (NS) 1
-
1258 (NS)
I
5
~lOO,O (:S)I 100,O (SI 100,O (5) 36,6 ( S ) 1100,O (S) 156,3 ( S)
81,l (!G 56,5 ( S ) IlOO,o (s) 168~4 ( s)
85,5 (Ij) 70,7 ( S) IlOO,O (S) 175,O ( S)
Tableau 31 - Z'1. oryzae : Evolution du pourcentage d'inhibition de la croissance
en surface (cm') par les germes antagonistes au cours d'une conju-
gaison de confrontations différée (:=A) [par rapport à Ml. verruearia
(1311 et simultanée (=x) 1 par rapport à T5. uitick (1) et/ou
C?l. gZoboswn (2)] et relativement au témoin T2 [PJ. oryzae A (3)] ;
PCA/25'/obscurité continue.
-
---_------..-
“wmrm9111,~-“IIIIL1--3-
- 111 -
T-=: - Les cases matérialisées par des tirets (-) correspondent a des
va eurs indéterminées puisque ni T2 ni l'essai ne se développent ; ce qui donne
le rapport i .
- Seuls deux pourcentages d'inhibition ne correspondent pas a des
valeurs significativement différentes ; le pourcentage de 6,2 % correspond à un
= 9,5 et celui 25,0 à*= 9 ; d'où la non siglnificatio- se rattache à
UO
cesGIëüX valeurs.
- Partout ailleurs, U. = 0.
2.2.3 - Expression graphique (fig. 20) : discussion
2.2.3.1 - Par rapport à il
--e--m -w-----
Les diagrammes A, B et C comparés au témoin T1 révèlent l'action
globale des germes antagonistes ; cette action est plus vigoureuse à pH 4,lO
qu'à 6,0.
Relativement à pH 4,10, le diagramme (A) montre qu'aucune croissan-
ce du parasite n'est perceptible pendant toute la durée de l'expérience (100 %
d'inhibition)
; cela tient à la conjugaison de deux facteurs :
- une action retardatrice de la croissance du parasite exercée par les subs-
tances inhibitrices Produite:s par Ml. verruearia,
- une action régie par TA. viride qui, agissant avant démarrage de la crois-
sance du parasite intervient très précocement (en raison de sa vitesse de crois-
sance notamment) pour annihiler complètement toute velléité de développement de
la colonie du parasite.
Ceci est à fortiori valable dans le cas du diagramme (C) puisqu'à
celle de Z'(5. viride, semble s'ajouter l'action de Cl. gLoboswn ; ce diagramme
comparé à (A) et (9) révèle une action de Cl. gZoboswn plus faible que celle de
3. vitick intervenant seul (A) ou en association simultanée avec Cl. glubosm
w.
En toute rigueur, nous devrions parler de l'action exercée sur
PI. oryzas par la RESULTANTE des interactions de tous les germes associés (aussi
bien en différé qu'en simultané) y compris le parasite.
F
Fig. 20 - F. oryzae : Inhibition (%) de la croissance en surface (cm2) par les
germes antagonistes intervenant en confrontations différée (=X) bar
rapport à MI. verrucaria (3)] et simultanée (=x) [par rapport à
15. v7:ride (1) et/ou Cl. globosum (Z)] ;
A et D = (3) X pl.o~yaae x (111
A, B, C exprimés par rapport au
témoin Franc Tl = Sel X0
D, E, F exprimés par rapport au
témoin T2 = Sel X (3)
-.
-4 ~HO = 4,lO.
I-------I pH0 = 6,0
- 113 -
2.2.3.2 - Par raeeort a T2
----Mm --m--w-
- En raison des valeurs indéterminées du pourcentage d'inhibition en-
deça d'un certain délai d'incubation (4 et 5 jours pour pH 6,0 et pH 4,lO res-
pectivement), nous n'avons pu figurer les points correspondants aux abscisses
3 et 4 jours sur les diagromnes D, E et F.
- L'inhibition constante de 100 % observée en (D) et (F) pour pH 4,lO té-
moigne de la supériorité de l'action conjuguée des germes correspondants sur
l'action isolée exercée par MI. uermtccwk en T;! sur le parasite : & dernier
poussant en T2 alors qu'il demeure bloqué a 100 % dans les cas précités.
Quant Zi la chute de pourcentage d'inhibition manifestée en (E) pour
le pH 4,l.O en présence de Cl. gtoboswn , nous pensons qu'elle traduit soit un
phénomène d'accoutumance du parasite, soit plus probablement, qu'au-dela d'un
certain délai d'incubation, la synergie préalablement établie s'estompe en rai-
son du caractère relativement fugace des métabollites propres a MI. verruearia ;
CI. globmum,, agissant alors seul, devient relativement moins efficace ; cette
hypothèse nous para'it la plus probable puisque déja nous avons observé une telle
tendance sur le diagramme B.
- pH 6,D : le diagramme (D) montre une décroissance du pouvoir inhibiteur
des germes antagonistes associés ; mieux que nulle autre, cette observation
prouve encore une fois la supériorité de Ml. verruearia sur les autres pour ce
type de confrontation : au 5e jour, l'action des métabolites caractéristiques de
MI. verruearia s'estompant, Tg. viride ne parvient pas à maintenir l'action an-
tagoniste au seuil de 100 X.
Par contre, les diagrammes (E) et (f-) correspondent a un pouvoir
inhibiteur initialement faible mais qui va croissant ; cela tient à plusieurs
éléments :
. d'abord du fait que Pl. oryzae possède ici une croissance plus vi-
goureuse qu'à pH 4,10,
. ensuite en raison du pH élevé qui exclut pratiquement toute inter-
vention efficace de T5. virile,
I enfin, nous observons que la conjugaison de tous ces facteurs par-
vient à dmposer une restriction de la croissance du parasite.
- 114 -
Remarqu- : la comparaison Ides diagrammes établis par rapport a T1 et ceux éta-
blis par rapport a T2 devrait nous permettre d'apprécier l'action conjuguée
des germes Cl. gtobosm et Tu. uiride au cours d'une confrontation simultanée ;
nous aborderons ce problème par le biais de l'action du tilange des filtrats
de culture des germes antagonistes sur le parasite en milieu gélosé ; encore
qu'on puisse nous objecter qu'intervient ici non pas la somme arithmétique des
actions des germes antagonistes mais l'action résultant des germes prkités
agissant en conjonction avec Ml. verrucaria.
2.3 - Essai de mise en évidence de la production d'antibiotiques en milieu
:liquide
croissance radia'le (mm) mycélienne du parasite confronté au filtrat
ou mélange de filtrats de cultures liquides des germes antagonistes
Le principe consiste pour chaque pH à confronter, en milieu solide,
le parasite avec le filtrat brut ou autoclave et au mélange de filtrats de cul-
tures des germes antagonistes ; la méthode est décrite dans l'annexe technique
no 5.
Les cultures liquides des germes antagonistes sont ptialablement in-
cubées à. 25"/obscurité continue pendant 13 jours sur PC tamponné à pH 3,65 et
5,90.
Les cultures sont alors préfiltrées et filMes stérilement avant
de servir aux diverses préparations.
La croissance radiale (mm)du parasite est évaluée en fonction du
temps à 25"/PCA tamponné à pH 3,65 et 5,90 au bout de 4, 6 et 10 jours à l'obs-
curité continue.
2.3.1 - Résultats
Tableaux 32 et 33.
1,
i
IC
I
a.
I-+z--
-
115
-
- 116 -
Traitements
Zéro = T
(l)+(2)
(W(3)
(W3)
(l)+W+W
PHO
cuit. antagon. 3,65
5,90
3,65
5,90
3,65
5,90
3,65
5,90
3,65
5,90
4,lO
6,0
4,lO
6,0
4,lO
6,0
4,lO
6,O
4,lO
6,0
I-- 4
27,8
28,4
2Q,O
25,2
20,o
25,5
20,O
23-,8
20,8
25,0
- - 6 -
48,6
48,8
39,O
44,8
38,4
45,0
38,6
43,4
39,O
43,6
-- 10
-
71,2
70,6
60,O
68,4
58,8
69,0
59,O
65',0 , 60,O
66,l
Iableau 33 - 131. oryzae : croissance radiale (mm) au cours d'une confrontation avec
Te melange (volume iti volume) des filtrats de culture autoclaves des
germes antagonistes préalablement incubés sur milieu liquide a 25°C
pendant 13 j/pH 3,6!5 et 5,90/obscurité continue : (1) =: T5. virile ;
(2) = c . gZoboswn ; (3) = Ml. uermcatia.
L e subs Irat de confrontation est le PCA ajusté a pH 4,lQ et 6,0 et placé
2i 25'C/obscurité continue.
Chaque valeur est urne moyenne établie a partir de 5 boStes de Petri.
2.3.2 - Discussion
- L'examen direct des résultats ne révèle à priori aucune différence mani-
feste au cours de l'action Ides filtrats de culture simples par rapport au té-
moin ; nous n'avons pas, pour cette raison, jugé utile d'évaluer les pourcenta-
ges d'inhibition et la signification correspondants.
Cependant, étant donné l'action tres nette précédemment établie des
germes antagonistes sur le parasite (CS ; CD ; CD A CS) nous nous posons la ques-
tion de l'adéquation de la technique utilisée pour le type de matériel biologi-
que dont nous sommes partis ; expérimentant en milieu solide, nous ne pouvions
déposer qu'un volume limité de filtrats de cultures antagonistes dans la cavité
aknagée au milieu du substrat de confrontation ; ce volume étant fiixé de maniè-
re à ce que le disque inoculum du parasite, une fois déposé dans cette cavité,
le liquide préalablement introduit ne déborde que très lég&ement de son site,
d'où un Iretard de croissance très bref ou nul qui explique que des différences
notables ne soient pas observables par rapport au témoin.
- Quant aux mélanges de filtrats autoclavés (mélange après autoclavage),
ilssemblent induire une inhibition appréciable mais leur action est difficile
- 117 -
a interpréter ; nous ignorons en effet tout des 'actions et interactions pouvant
exister entre les composantes d'un type de filtrat et à fortiori du mélange
de filtrats.
Outre l'action inhibitrice qui devrait se manifester dans les fil-
trats de cultures,nous devrions, pour la compréhension du phénomc?ne, tenir
compte des modifications,notamment de pH, imposées au milieu par les germes ino-
culés : nous avons déteminis les pH apri% 13 jours d'incubation dans les condi-
tions expérimentales et avons observé une notable évolution (cf tableau 34).
pH0 = 3,65
Gt?lTlleS
antagonistes
4,20
Zéro = T
6,20
T5* viride
3,80
Cl. gtoboswn
6,50
Ml- vermcar&z
Tableau 34 - Devenir des pH initiaux du milieu de culture (PC) inoculé par
% viride , Cl, globoswn, Ml. verrucatia et incubé 13 jours à
25"/obscurité continue.
Le faible taux d'inhibition apparaissant sur le tableau 32 relève-
rait donc simultanément du pH0 et de la nature qualitative et quantitative
(concentration) des produits dérivés du métabolisme des germes concernés.
Dans l'expérience qu'à présent nous envisageons, nous allons inocu-
ler directement le parasite sur le filtrat ou mélange de filtrats de cultures
liquides des germes antagonistes.
I I I - CONFRONTATION DU PARASITE ET DES GERMES ANTAGONISTES SUR MILIEU LIQUIDE :
- -
croissance pondérale (Img) du parasite incubé sur filtrat ou mélange de
filtrats de cultures des germes antagonistes
Par l'expérience précédente, nous voulions expliquer le mode d'ac-
- 118 -
tion des antagonistes par la production de principes actifs inhibiteurs de
?* ozyzae et juger de l'efficacité relative des différents traitements ; au
vu des résultats, la technique ne nous a pas palrue adéquate ; nous allons tenter
dans le m&ne esprit, d'aborder le m&ne problème par une autre voie.
L'idéal aurait probablement été de réaliser une culture liquide si-
multanée des germes à confronter par l'usage d'un système d'erlenmeyer jumelés
communiquant par une tubulure latérale comportant une paroi sélective perméable
aux seuls métabolites produits par l'un quelconque des microorganismes (cf
annexe t#echnique no 6) ; en raison de contraintes matérielles, nous avons réali-
sé la culture du parasite sur le filtrat ou mélange de filtrats de cultures des
germes aintagonistes (méthode décrite dans l'annexe technique no 6) ; afin de dé-
terminer l'age optimum des cultures antagonistes induisant l'jnhibjtion maximum,
nous avons expérimenté à partir de filtrats de cultures àgëes de 5, 9 et 29 jours.
Le tableau 35 <rend compte des résultats observés.
3 * 1, - Résultats
~4,lO
6,0
4,lO
6,0
42,000
30,300
43,300
14,366
40,400
21,600
Tableau 35 - Pj. oryzae
--
: croissance mycélienne pondérale (mg) en fonction de
1 age et du type de filtrat ou mélange de filtrats de culturesli-
quidesde Tg. z;~itide (l), cl. ~ZO~OS~ (2) et MI. vexwzark (3) ;
les cultures antagonistes sont dgees de 5, 9 et 29 jours, â 25Y/
obscurité continue ; le milieu de culture est le PC dont le pH0
après autoclavage est de 4,lO et 6:,0 ; PI. oryzae inocule sur les
diverses prepairations est incubé 10 jours â 25"fJobscurité continue.
- 119 -
Chaque valeur de ce tableau est une moyenne établie à partir de
3 erlenmeyer renfermant chauzun environ 30 ml de préparation (mélange volume à
volume).
3.2 - Expression numérique des résultats
Age (ii)
Cult. liq. antago.
Traitements
- - -
Tableau 36 - Pl. oryzae
-
: pourcentage d'inhibition de la croissance mycélienne
pondérale en fonction de l'âge et du type de filtrat ou *lange de
filtrats de cultures liquides de Tg. uitide (l), Cl. gi!obosm (2)
et Mi. Vermca.ria ( 3) .
Les caractéristiques et valeurs ayant servi à la confection des pré-
sents résultats, sont consi'gnés dans le tableau 35.
3 . 3 - Expression graphique (fig. 21 et 22) : discussion
3.3.1 - Relativement au pHqo 4,lO : (fig. 21)
- De façon générale, les préparations issues de cultures antagonis-
tes âgées de 9 jours manifestent une remarquable inhibition (supérieure à 60 %
quel que soit le traitement) ; cet dge correspond donc dans notre expérience,
à 1" optimum pour lequel les germes antagonistes ont élaboré et rejeté dans le
Légende des fig. 21 (pH, = 4,lO) et 22 (pHo = 6,OJ
Pyricu Zaria orpae : pourcentage d'inhibition de la croissance ponde-
rale en fonction de 1 ',age et du type de filtrat ou mélange de
filtrats de cultures liquides de T5. uitide (1) ; CI* g2obosu.m
(2) ; Ml. vermtcatia (13).
cl
. . .
El
.
. . .
(2)
(3)
Fig. 21 - P . oryzau : pourcentage d'inhibition de la croissance
pondérale
(mg
en fonction de l'âge et du t pe de
i
filtrat ou mé ange de filtrats de cultures Y iquides
de T,+ v7~r7Xe ( 1 ) j Cl. g Iobosm ( 2 ) ; Ml y vermcaricl ;
pH0 = 4,lO ; cf legende ci-contre.
Fig. 22 - P. oryzae : Pourcentage d'inhibition de la croissance
pondérale (mg) en fonction de l'âge et du type de filtrat
ou mélange de filtrats de cul tuires liquides de T5. uiride
(1) ; Cl. gZoboswn (2) ; MI. uerrucaria (3) ; pHo = 6,0.
Prière de se reporter à la légende de la figure 21.
- 122 -
milieu des produits qui, qualitativement et quantitativement,i'rrduisent le maxi-
mum de restriction de la croissance du parasite.,
Ici également, Ml. verrucatia manifeste sa supériorité par rapport
à tous les autres traitements.
- A l'dge de 5 jours, nous observons une action faible mais positive
des germes intervenant isolément ; cependant, une légère synergie se manifeste
lorsque nous opérons avec le mélange T5. tiride + cl. gZoboswn ; par contre,
une baisse notable d'efficaicité se révèle dans tous les mélanges impliquant
Ml- ve rrucatia ; nous pensons expliquer cette neutralisation mutuelle du pouvoir
-
inhibiteur de substances individuellement actives (phénomène d'antagonisme en-
tre les produits considérés) soit par la formatlon de complexe inactif constitué
au terme des interactions des produits mélangés!, soit par une altération partiel-
le résultant de cette coexistance, soit à la limite, par l'app'alrition de nou-
veaux composés métabolisables par le parasite ; de là l'effet bénéfique concré-
tisé par une stimulation de! la croissance du parasite : c'est 'ce que nous obser-
vons dans le cas du traitement (1)+(32 incluant Tge virile et Ml, verruearia
(taux d'inhibition de -31,91 %).
- Quant aux tralitements issus de cultures âgées de 29 jours, nous
.observons une action encore "spectaculaire" de 11~. viti&: (74,1. % d'inhibition)
par rapport aux autres ; cette "remanence" seraït probablement à lier soit au
vieillissement très différe des cultures liquides du T~-Ghuü!efi~~a, soit à une
relative stabilité des substances inhibitrices propres à ce germe ; à moins que
n'intervienne la superposition des deux phénomenes.
Les activités de Ml. verruearia (52,2 %) et du mélange Tg. v&zIde +
Cl. gZ,oboswn (47,l %) demeurent encore très satlsfaisantes tandis que celles
de Cl. ghboswn (-33,3 %) et des melanges 2 à 2 faisant intervenir MI# vermcaria
semblent complètement perdues puisque les préparations correspendantes stimulent
la croissance du parasite.
3.3.2 - Relativement au pH, 6,0
- Pris isolément, les germes antagonistes montrent 2 types de com-
portements :
. le type T5. viride ou CI. globosum dont l'activité, bonne à 5 jours, pré-
- 123 -
sente un optimum à 9 jours pour ensuite decroftre,
. le type Ml. verruearia qui ptisente un maximum d'inhibition pour
29 jours.
- L'association TA. viri& + Cl. gZo2josum induit une inhibition
équivalent a priori a la resultante des actions isolées des composantes Sgées
soit de 5, soit de 9 jours 1, par contre, a 29 jours, cette association détermi-
ne une chute du pouvoir inhiibiteur voire une stimulation de la croissance du
parasite (-19,0 % pour 29 jours).
- Alors qu'il détermine une perte du taux d'inhibition par rapport
à l'action individuelle de 215. uitide et ~1. verruearia à 5 et 9 jours, le
traitement impliquant ces 2 germes manifeste un effet synergique très puissant
à l'dge de 29 jours ; il y aurait là COINW un effet non pas d'addition mais de
"facilitation" mutuelle au S#ein du mélange.
- Quant au binllme Cl. gZobosm + Ml. verrucatia, il extériorise une
synergie ,a l'age de 9 jours et une résultante tres satisfaisante pour les autres
délais d'incubation.
- Enfin, l'action conjuguée de filtrats issus des 3 germes évolue
considérablement puisqu'elle passe de (-16,l %) a (+50,6 %) lorsque nous allons
de 5 à 29 jours.
- Précisons pour terminer, que ces interprétations, comme celles qui
suivent, se fondent sur les seuls &ultats établis par nos experiences, sans
préjuger du comportement des germes pour d'autres délais d'incubation qu'il au-
rait certainement été intéressant de tester (notamment entre 9 et 29 jours).
3.3.3 - Remarques
La seule vue GLOBALE des diagrammes matérialisant ces résultats
suggère le choix du type de ,traitement en fonction de son efficacité relative ;
ainsi, nous dirions par exemIple, qu'à pH0 4,10, l'utilisation de TA. vitide,
Ml- verruc'atia ainsi que de l'association T5. virile + Cl. globosm, assure une
excellente couverture contre le parasite entre 9 et 29 jours notamment ; par
contre, toutes les autres combinaisons ne constituent une garantie contre le
développement du parasite que pour un délai d'incubation peu différent de
9 jours.
- 124 -
A pH, 6,0, cl. ,Y( loboswn et l'association Cl. gZobostm t Ml. verru&u
et a la limite Tg. viride t MI. verrucaria sont efficaces pendant toute la durée
de l'expérience tandis que !Fg. vitide et le mélange T5. vitide + Cl. gZoboswn
joueraient un rble antagoniste remarquable lorsque les cultures sont agées de
moins de 9 jours.
Enfin, l'utilisation du mélange des :3 germes n'est envisageable
qu'a partir du 29e jour.
- A la: lumièie des expikiences préliminaires, toute compréhension de
ces résultats doit tenir compte de l'évolution observée des pH de base ; le
tableau 37 rend compte de cette modification engendrée par les germes antagonis-
tes pour‘les 3 delais d'incubation.
. verrucaria
5,05
6,35
7,50
7,50
- 7,35
7,65
I
?.
4,810
6,0
4,lO
6,0
Tableau 37
- - - Evolution du pH de base du milieu liquide sous l'influence des
germes antagonistes et en fonction du temps ; PC/pHo 4,lO et
6,0/25"C/obscurité continue.
- A l'âge de 29 jours, le vieillissement des cultures antagonistes et
partant le déclenchement du phénomGne d'autolyse mycélienne doivent introduire
des modifications telles qu‘il nous est difficile voire impossible de cerner
l'origine réelle de la restriction observée ; â ce propos donc, les tisultats
correspondant à l'dge de 9 jlours nous paraissent plus fiables que ceux corres-
pondant â 29 jours.
- Après incubation de 10 jours du parasite sur les filtrats. (FC) ou mélan-
ge de filtrats de cultures (MFC) des germes antagonistes, nous avons testé le
- 125 -
pH occasionne par le développement de PJ. oryzae ; le tableau 38 donne les nou-
velles valeurs de pH.
5
9
29
4,65
6,65
4,75
6,90
- 7,35
3,45
4,65
6,80
4,60
6,90
- 6,45
7,25
4,65
6,70
5,15
6,80
- 7,80
7,65
4,90
6,75
4,90
6,80
- 7,55
7,15
4,50
6,65
4,55
6,90
- 5,90
6,65
4,55
6,70
5,15
6,50
- 6,80
7,25
4,80
6,90
5,80
6,80
- 8,00
8,05
_-
4,lO
6,0
4,lO
6,0
4,lO
6,0
Cult. antago.
Tableau 38 - Evolution du pH après 10 jours d'incubation de Pl. oryzae sur les
- -
filtrats ou mélange de filtrats de cultures antagonistes dgées de
5, 9 et 29 jours et donne les pH, sont de 4,lO et 6#,0 ; PC/25'/
obscurité continue.
IV - INFLUENCE DE L'ANTAGONISTE SUR LA GERMINATION DES CONIDIESt DU PARASITE
-
-
Le blocage du developpement du parasite peut également etre occa-
sionné pair une inhibition affectant soit l'émission et/ou le développement du
tube germinatif, soit la différenciation de l'appressorium dont on sait qu'il
joue un role primordial dans le processus infectieux ; c'est Zî ce titre que nous
nous proposons d'examiner l'action des germes antagonistes sur la germination ;
pour ce faire, nous avons procédé a une confrontation des conidies de Pl. oryzae
avec des préparations établies a partir soit de suspensions coniidiennes, soit
de filtrats de cultures des germes antagonistes.
- 126 -
La relation
jq o ù
Go = germination sur témoin (%)
= germination sur essai (X)
= inhibition de la germination (X)
permet d'exprimer les résultats en pourcentages d'inhibition de la germination
des conidies du parasite par les préparations antagonistes et par rapport aux
témoins respectifs.
4.1 - Action de la suspension conidienne (SC) et du mélange de SC (dans
l‘eau distillée) des antagonistes sur la germination du parasite
-
--
4.1.1 - Préliminaire
Les conidies (du parasite ou des antagonistes) mises en suspension
dans l'eau distillée stérile sont ici issues de cultures sur PCA incubées à
25'C/obscurité continue pendant 12 jours.
Avant d'examiner les résultats établis sur la base de ce type de
confrontation, nous voudrions attirer l'attention du lecteur sur ce que nous
avons convenu d'appeler "EFFET DE MASSE" : de façon générale, l'étude de la ger-
mination de conidies en fonction de la concentration montre qu'au-delà d'une
certaine valeur, le pourcentage de germination décroft progressivement jusqu'à
s'annuler ; ainsi donc, des conidies en nombre très élevé seraient auto-inhibi-
trices de leur propre germination ; cela signifie que lorsque nous confrontons
un volume de la suspension conidienne de l'antagoniste Ai avec un volume de la
SC du parasite (la concentration conidienne de chacun de ces germes étant préa-
lablement ajustée à 180 000 conidies/ml), nous aurons 90 000 conidies de
PJ. or'yzcze par ml de ce mélange ; nous testerons le pourcentage de germination
du parasite par rapport à un témoin T1 appelé "FRANC" de concentration égale à
90 OOO/ml ; or, de façon globale (sans distinguer les conidies antagonistes de
celles du parasite), nous avons en réalité un nombre de conidies ou encore une
masse (d'où le terme d'effet de masse que nous avons adopté) gIobale de
180 OOO/ml dont il faut que nous tenions compte pour prouver quel pourcentage de
"non germination" (= pourcentage d'inhibition) est imputable à l'auto-inhibi-
tion ; nous faisons donc un deuxième témoin T2 renfermant 180 000 conidies de
-- 127 -
PJ. oryaae/ml d'eau distillée stérile.
Encore nous faut-il ajouter qu'en toute rigueur, une rkerve s"iw
pose par le fait que l'inhibition endogène engendrêe par 180 000 conidies de
Pl. oryaae/ml n'est pas nkessairement comparable à celle régie par le mélange
90 000 conidies de Pyticuiratia oryzae et 90 000 conidies de l'antagoniste Ai.
Cela dit, les divers essais Ei (i := 1 à 7) et témoins (Tl ; T2 ;
T3 ; TG pour l'effet de masse) sont élaborés à partir de suspensions conidien-
nes ajustées à 180 000 conidies/ml d'eau distillée pour toutes les catégories
de microorganismes et conformément au diagramme suivant ; étant entendu qu'en
cas de mélange ou d'addition d'eau distillée stérile, ces opérations se font
toujours volume à volume.
- Action isolée des germes antagonistes
Essai no 1 = Pl. oryzae t T5. virk?e
Essai no 2 = PJ. oryzae t Cl. gZobosum
Essai no 3 = Pl. oryzae t Ml. verrucatia
Dans ces trois essais et pour chaque type de confrontation, il y a
globalement (= G) 180 000 conidies/ml et individuellement (= 1) 90 000 conidies/
ml pour chaque germe ; nous rëaliserons donc deux témoins :
Tl
= PJ. oryzae de concentration 90 000 conidies/ml
T2
= PJ. oryzae de concentration 180 000 conidies/ml
- Action combinée de 2 germes antagonistes
E4 = Pl. oryzae t (T5. viride t Cl. globosum)
E5 = Pl. oryzae + (T5. virile t Ml. verrucaria)
E6 = Pl. oryzae + (Cl. globosm + .Ml. verruearia)
soit
T2 = ~1. ozyztze de concentration 60 000 conidies/ml
- Action combinée des 3 germes antagonistes
-
E7 = Pl. oryzue t (T5. v+ide t Cl. globoswn t Mj. vermcaria)
soit
T3 = PJ. oryzae de concentration 45 000 conidies/ml
- 128 -
- El!, E2, E3 sont appreciés par rapport à T1
- -
E4?J5&6 par rapport à T2
Q-par rapport à T3
L'implication de l'effet de masse est dosée par intervention du
temoin masse TC.
- -
4.1.2 - Résultats et expression numérique
Tableau no 39.
4.1.3 - Expression graphique (fig, 23 et 24) : discussion
L'analyse des pourcentages de germination ou celle d'inhabation de
la gk%miFlatiCNl du parasite pi3P les antagoniste s et par rapport aux témoins res-
pectifs conduisent à la m&ne compréhension du phénomène ; pour cette raison,
nous avons1 choisi de matérialiser graphiquement les résultats par reférence au
taux de germination, par rapport aux temoins francs.
- L'expression du temoin "MASSE" par rapport aux témoins "F:RANC§" Tl, T2,
T3 révèle un pourcentage de germination relativement plus élevé que les témoins
eux-m&nes (93,7 ; 105,7 et 123,3 % pour Tl, T2 et T3 respectivement d'après le
tableau 39 et les diagranmnes A, B et C de la figure 23) ; ce constat nous auto-
rise à affirmer que le phénomène d'inhibition endogène n'est pas impliqué dans
la réduction éventuelle du taux de germination des conidies du parasite ; sur
cette base, toute réduction du taux de germination des conidies de Pl. ozyzae
doit trouver son explication dans l'intervention du traitement appliqué.
- Ml. vermtcatia (qui inhibe à 36,7 % la germination des conidies du para-
site) est le germe le plus intéressant encore une fois ; de plus, il induit un
léger retard dans la croissance du tube mycélien (30,8 11) par rapport au témoin
~1 (42,~ 1-11~
- Le mélange des conidies des trois germes détermine également une reduc-
tion du taux de germination des conidies du parasite par rapport au témoin T3
(le pourcentage d'inhibition du tube mycélien est supérieur à 30 % (33,4 p pour
T3 et 19,6! p pour E7).
Nb cocidies
germées
7 4
79
7 2
6 4
5 0
’
7 0
5 7
6 5
’
6 4
6 0
’
4 4
Nb conidies
3 6
4 0
non germées
5 6
% germination (1)
par rapport Ti (2)
U = 1, 2, 3) (3) /
93 “’
123,3 7
105,7
/
,:IO
1 9111
1 ,:o,
1
6:0,
1
7:o.
/
8114
/
,:I,
/
91,4
j
60,O
/
73,3
I
I
% inhibition (1) 6,32
par rapport T i (2) STIMULAT.
21,0
899
19 30
3637
30,o
18 96
731
896
40,o
26,7
U = 1, 2, 3) (3) STIMULAT.
% germination
par rapport MASSE
74,0
-
97,3
86,5
6736
-
77,0
87,8
86,5
-
59,4
Tableau 39 - PI. oryzae : action de la suspension conidienne ou du mélange de SC (dans eau distillée) des antagonistes
sur la germination des conidies du parasite.
Incubation pendant 5 heures/25^Cj obscurité continue.
Léaende des. fia. 23 et 24
Pourcentage de germination et longueur moyenne (u) des conidies de
Pj. oryzae soumises à l'action des suspensions ou mélange de suspen-
sions conidiennes des germes antagonistes.
Incubation de 5 h/25'/obscurité continue.
DIAGRAMME A : Intervention isolée des germes antagonistes
II TI ou témoin franc
TG ou témoin masse
I I
000
EI en présence T5. vitide
Il
***
E2 en présence Cl. globoswn
*YY
r I
‘“..‘.”
E3 en présence Ml. vermcaria
DIAGRAMME 6 : Intervention simultanée de 2 germes antagonistes
L-1
T2 ou témoin franc
TG ou témoin masse
1
+o+
E4 en présence (TA. viride + Cl. globoswn)
El
? ????
E5 en présence (TA. viride + NI. vemucaria)
+alj
E6 en présence (Cl. globosum + MI. verruearia)
DIAGRAMME C : Implication combinée des 3 antagonistes
L-J
T3 ou témo in franc
TG O U témoin masse
P
;:#g
ET en présence (Tg. viride f Cl. gZobosm + Ml. verruca;4a)
I a1 t
(1-I)
a(
c
3c
‘0’
m -
20
*
*
*
10
f
*
*x-
Fig. 24 - Longueur moyenne (p) du tube germinatif émis par les
conldies de Pl. oryzae confrontées aux SC (et MSC des
germes antagonistes ; 5 h d'incubation à 25"C/
obscurité ; cf légende de la figure 23.
- Citons enfin les restrictions moyennes induites par Cl. @abosum et par
le mglange Tg. uitide t cl. gtobosum (19,0 et 18,6 % d'inhibition respective-
ment) qui contrarient également le developpement du tube germinatif.
4.2 - .Action des filtrats "naturels" (FCN) et filtrats autoclaves de
m
cultures (FCA) des germes an,tagonistes sur la germination des conidies de
-
21. oryzae
Les germes antagonistes sont inoculés sur PC ajusté a pH 4,lO et
pH 6,0 par le tampon Mc Ilvaine
; l'incubation est faite pendant JO jours a
25"C/obscurite continue ; les filtrats de cultures sont obtenus grace a la mé-
thode décrite dans l'annexe technique no 5.
Dans un souci de synthèse et pour faciliter la comparaison des ré-
sultats ci-dessus et ceux matérialisant l'action des conidies maintenues en sus-
pension dans le liquide de culture (0 4.4), nous avons groupé toute les observa-
tions concernées dans les figures 25 et 26.
4.2.1 - Résultats et expression numérique
Tableau no 40.
4.2.2 - Expression graphique : discussion
- Excepté pour T5. virile, les FCN ou FCA issus des cultures de pHo 4,IO
exercent une action plus efficace que celle observable pour les traitements
issus de cultures de pH, 6,0 ; cette m&ne efficacité relative se retrouve au
niveau de la longueur moyenne du tube germinatif.
L'action des filtrats de Cl. g1obosu.m et de ~1. vemucaria
issus de
cultures de pH, 4,lO semble ici confirmer des résultats analogues établ is par
STEWART et HILL (1965) : ces auteurs avaient alors montré que les filtrats
de culture d'flek-rinthosporim sativwn renfermaient une substance non phytotoxi-
que mais capable d'inhiber l'a germination d'urédospores ou la formation de pus-
tules de rouille à Puccinia.
- Le FCN de Cl. globoswn (exerçant 97,6 % d'inhibition de la germination des
conidies du parasite pour pHo 4,lO) est nettement supérieur au FCN de
Ml. verrucaria (70,7 %) ; les longueurs moyennes correspondantes du tube germi-
Traitements
Nb conidies germées
N b conidies non germées
7
5
11
2 0
100
23
6 7
4 4
G.
u
% germination
Lll
par rapport T
93,0
95,0
95,7
84,2
090
81,O
35,5
58,9
% inhibition
germination
790
590
4*3
15.8
100,o
18,9
64,5
41 ,o
I
i, moyenne tube
3fj,4 1
44,s :
0,o
:
29,4
:
24,5
’
30,l
mycelien (50 conidies)
P7 97)
(25 99)
P4,l)
P5 ,lI
P7,l)
Tableau 40 - PJ. oryzae : germination des conidies sous l'influence des filtrats naturel (FCN) et autoclavé (FCA)de cul-
l
tures des germes antagonistes ; incubation 5 heures/?5°C/obscurité
continue.
w
wI
Fig. 25 - Germination (X) des conidies de Pl. opgaae incubées pendant
5 h/25"C/obscurité en présence des conidies maintenues en
suspension dans le liquide de culture (CMS) ; filtrat naturel
de cultu,res (FCN) ,; filtrat, autoclavé de cultures (FCA) des
germes antagonistes incubés sur PC/25"C/obscurité/lO j.
A- pH, descultures liquides antagonistes = 4,l.O
B- pH0 descultures liquides antagonistes = 6,O
Témoin = 100 %
1
= T5. virile
i---J CMS
II = Cl. g;lobosm
/iFGel
F
C
N
III = Ml. vf?rmcaria
lffzza
FCA
a
- 136 -
natif sont de 14,0 et 21,0 1-1 respectivement.
-
-
- Le FCA de Cl. g Zobosum issu de cultures à pH, 4,lO bloque à 100 % la ger-
mination du parasite ; il convient cependant de préciser à ce propos que, dans
cette action spectaculaire, nous ne saurions attribuer aux métabolites de
Cl. gZoboswn ce pouvoir inhibiteur puisque l'autoclavage aura tres certainement
introduit de nombreuses modifications et altérations des substances de base.
- Dans l'expérience qui suit, nous allons rechercher l'aptitude à la combi-
naison I(synergie) efficace de ces divers types de filtrats.
4.:3 - Influence du mélange de filtrats "naturels" (MFCN)-ou autoclavés
(MFCA) des cultures antagonistes dgées de 10 j/25O/obscurité continue sur la
-
germination des conidies dePI. oqaae
4.3.1 - Resultats et expression numerique
Tableau No 41.
4.3.2 - Expression graphique (fig. 27 et 28) : discussion
-
s- De m&ne que précéderrment, les préparations non autoclavees sont plus effi-
caces lorsqu'elles sont issues de cultures antagonistes liquid,es de pH, 4,lO que
lorsqu'elles proviennent de cultures de pH, 6,0.
a- Nous référant à ce pH, 4,10, nous observons que les mélanges de FCN les
plus inhibiteurs sont ceux impliquant cl. gZobo:;wn (cf diagramrnes X, Z et T de
la figure 27).
L'association E41. verrucaria + Cl. yZobosum manifeste une synergie
décisive (diagramme Z) à l'encontre des conidies du parasite alors que pris iso-
lément, les pourcentages respectifs d'inhibition sont de 70,7 et 97,6 % ; il
n'y a donc pas d'antagonisme entre les métabolites propres aux g'ermes concernés.
L'action très satisfaisante de Ml. verruearia agissant seul (dia-
gramme III, fig. 25) semble masquée voire réduite lorsque ce germe est en combi-
naison avec T5. vitide (diagramme Y de la figure 27), le taux d'inhibition pas-
sant de 70,7 à 15,l %.
Par contre, le taux d'inhibition de la germination des conidies du
Nb conidies non germGes
Nb conidies germées
Tableau 41 - Influence du MFCN et MFCA des germes antagonistes sur la germination des conidies de PJ. oryzae ;
I
(1) = Ts. uitide ; (2) = cl. gtobosm ; (3) = Ml. uemcda ; incubation 5 heures/25"C/obscurité continue.
E
UI
Fig. 27 - Germination (16) des conidies de PJ. oryzae incubé 5 h/25"C/
obscurité en présence de MFCN et MFCA de T
uiride (1) ;
Cl. gZobosum l( 2) ; MI. verrucaria (3) incuks sur PC/25OC/
obcurité/lO j,
X = (l)+(2) ; Y = (l)+(3) ; Z = (2)+(3) ; T = (l)+(2)+(3).
A = pHo cultures liquides antagonistes = 4,lO
B = pH0 cultures liquides antagonistes = 6,0
MFCA
El
te*
FCN
m
-
I-P '--"-L-"-P
- î
m
N
I
- 140 -
parasite passe de 3,6 % pour T5. vitide et 97,6 % pour cl. gtokloswn a 95,9 %
lorsque ces deux germes interviennent en association ; le phén~urn&e de masqua-
ge induit .par T5. titi& sur MI. verruearia n'est donc pas inductible par
T5’ vhide sur Cl. globoswn ; nous serions à priori autorisés Zi conclure que,
dans ce dernier type de combinaison, persiste l'action prépondtirante de
Cl. gioboswn dont les métabolites n'auraient pas une aptitude tilevée a la combi-
naison avec ceux de T5. vir+de ou ne subiraient aucune altératiion grave de la
part de ceux-ci.
L'association de Cl. globosm + !$. verrucaria (100 % d'inhibition,
cf diagramme Z) est lég&ement plus active que celle faisant intervenir les 3
germes (95,5 % conformément au diagratmne T).
- A pH0 6,0, l'autoclavage , outre qu'il semble supprimer toute activite
inhibitrice des pr¶tions,
determine parfois une certaine stimulation (ex.
le tàux de germination passe de 98,9 % a 110,6 % selon que le mélange de filtrats
de cultures de Cl. globoswn + Ml. verruearia est naturel ou autoclavé.
-II Quant a la longueur du tube germinatif (fig. 28) elle est en relation
directe avec 1 'aptitude du type de préparation a s'opposer a son émisséon.
4.4 - Influence des conidies antagonistes maintenues en +pension dans
le liquide de culture (CMS)l sur la germination des conidies du parasite
- - -
-
Les cultures liiquides des antagonistes ont éte realisées dans des
erlenmeyer de 100 renfermant environ 25 ml de PC tamponne (tampon Mc Ilvaine)
à pH, 4,lO et 6,0 ; l'inoculation est constituée par 2 rondelles de diamètre
-
-
-
6 mm i l'ensemble est incube 10 jours a 25O/obscurité continue.
Les conidies du parasite sont issues d'une culture sur PCA incubée
a 25"/obscurité continue pendant 12 jours ; la concentration de base est de
180 000 conidies/ml d'eau distillee stérile.
A la date de confrontation, les concentrations conidiennes des ger-
mes antagonistes (nombre de conidies/ml) étaient les suivantes :
- 141 -
I
PH, 4910
I
Germes
I
pH0 El,0
1
(~1) A la date de confrontation, les cultures de cl. g2obos.m étaient dépour-
vues de conidies dont l'apparition est souvent différ+Se en culture liquide.
4.4.1 - Résultats et exoression numérique
--,-
---
:
,
Traitements
Zéro = T
viride
I Cl. globosm Ml. verruearia
I
I
PH0
4,10 6,0
4,lO
6,O
4,lO 6,0 1
\\
Cult. antago.
4,:tO 6,0
/
EvhluatiMns\\
I
Nb conidies germées
1 86 ) 90
75 1 75 1
2 1 17 j
0 /
0 /
Nb conidies
non germées
25 1~ 25
25 25 98 83
9 8
8 3
100 j 100 /
% germination
par rapport T
0 87,2 1 83,3 1 2,3
2,3 1 18,,9 1
0 j
1
% inhibition
par rapport T
12,8 1 16,7 / 97,7 1 81,.1 1 1 0 0
100 j
Long. tube germinatif
26,6 1 19,6
(r-1)(20 conidies)
(*4,7)) (2393)
(-1
Tableau 42
-- - Influence des conidies des germes antagonistes maintenues en sus-
pension dans le liquide de culture sur la germination des conidies
de PJ. oryzae ; incubation 5 h/25'/obscurité continue.
- 142 -
4.4.2 - Expression graphique : discussion
Dans un but d'analyse comparative, ces résultats sont rassemblés
dans les diagrammes 1, II et III des figures 25 et 26 avec la legende qui leur
est attribuée (CMS).
- Ml. verruearia induit un blocage total (100 % d'inhibition) de la germi-
nation des conidies du parasite et ce, pour les 2 valeurs de pH,,.
- Cl. globoswn, tres efficace à pH0 bas (97,7 % d'inhibition), demeure
très satisfaisant à pH, élevé (81,l %).
- T5. uitide par contre, ne contrariant que très peu (12,8 % et 1#6,7 %
d'inhibition à pH, 4,lO et 6,0 respectivement) la germination du parasite ne
présente pas un intéret particulier pour ce type de contrOle.
- Parallèlement, l'exarnen de la figure 26 finit de nous convaincre de la
supériorité incontestable de Ml. vermLcaria, de l'intéret minime de ing. vim&k
(42,0 et 39,2 1-1 pour la longueur du tube germinatif à pH, 4,lO et 6,0 respecti-
vement) s de la position intermédiaire de C1. ghbosum qui, quoiqu'il réduise
considisrablement le taux de germination , ne limite que moyennement la longueur
du tube germinatif (36,7 et 48,9 % de réduction du tube germinatif par rapport
aux témoins respectifs).
Les travaux réalisés à ce jour, en dépit de la disparité de leurs
conclusions, nous autorisent néanmoins à ne pas sous-estimer lai concentration
conidienne des germes antagonistes impliques dans une methode de lutte biolo-
gique ; ainsi, pour Aureobasiclium pul'lulans agissant contre AZtmwaria zinniae,
le maximum d'inhibition de la formation des lésions a été observé pour les
concentrations les plus élevées ; par contre, la restriction malximale des mani-
festations du parasite est obtenue à partir d'une concentration optimale
(7,5 x l@ spores/ml) lorsque l'auxiliaire utilisé est AZtemau6a tenuissima
(VAN DEN HEUVEL) ; ces observations devraient également, dans le cas particulier
qui nous préoccupe, permettre une meilleure appréciation relati,ve des actions
de T5. vi:&& et de Ml. vermcaria.
4.5 - Remarques
La connaissance des mécanismes impliqués dans la réduction de la
- 143 -
"
croDssance mycélienne ainsi que du taux de germination des conid'ies du parasite
par 'les germes antagonistes est une composante fondamentale dans l'élaboration
d'une mëthode de lutte biologique :
- Des recherches nombreuses permettent désormais d'affirmer que la germina-
tion des s#aprophytes foliaires est un préalable a toute manifestation de proprié-
té antagoniste ; la seule germination ne conférant pas nkessairement
-
cette pro-
-
priété.
- La capacité d'un antagoniste à s'opposer a "l'épanouissement" du parasite
seraft (igalement en étroite relation avec la vitesse de germination ; ainsi,
l'isolat A-133 de Cladosporium, germant plus vite que celui A-55 est corrélati-
-
-
-.
vement ~J~US efficace pour réduire les lésions foliaires inductibles par
A. zinniae sur fève (VAN DEN HEUVEL, 1970).
En outre, le nombre de spores de l'antagoniste en germination (donc
la concentration sporale) jouerait un rble significatif ; les isolats Hwma A-105
et CZadcmporiwn A-55 inhibent aussi bien la germination in vivo que la germina-
tion et la croissance mycélienne de A. zinniae in vitro ; seul cependant le pre-
mier inhibe la formation des lésions foliaires de la feve en raison probablement
de sa concentration 4 fois plius élevée (VAN DEN HEUVEL, 1970).
- Certes, l'état actuel des recherches ne permet pas de cerner le mécanisme
intime de l'inhibitïon de la germination ou de la croissance wcçilienne du para-
site ; l'expérimentation in &Vo, de par les actions et interactions inhérentes
au materie biologique, n'est pas pour faciliter la définition des mécanismes
impliqués ; cependant, de nombreux résultats nous autorisent a diire tout l'inté-
r+t des recherches in vitro : deux exemples suffisent pour nous en convaincre :
* Rhizopus nigmkans, qui réduit in vivo le nombre de lésions foliai-
res provoquées par AZternaria sotani sur pomme de te,rre, inhibe tigalement in
vitro la germination des spores ainsi que la croissance mycélienne du parasite
(DAS et al., 1968).
La formation de lésions foliaires par I?uccinia penniseti sur le
I
millet perlé est tiduite par des saprophytes dont C. globoswn, AspergiZlus
japon.icus, Fusariwn oxyspomm qui inhibent également in vitro, la germination
des urédospores du parasites.
- 144 -
CHAPITRE QUA'TRIEME
ELEMENTS DE REFERENCE : ACTION DE WELQUES
FONGICIDES SUR LA CROISSANCE MYCELIENNE DU PARASITE
Le but de ce chapitre n'est pas l'étude approfondie de l'action des
fongicides sur Pl. oryzae ; de nos jours, la chimiothérapie demeure encore une
arme tri% étudiée et très usitée contre la pyriculariose ; en conséquence, nous
nous proposons de donner seulement un élément de reférence permettant aux uti-
lisateurs des fongicides de se faire une idée sur l'efficacite relative de ces
-
produits par rapport aux auxiliaires naturels.
Nous nous bornerons présentement a examiner l'action de 4 fongici-
des s~ystémiques sur la croissance mycélienne du parasite.
Les produits utilisés sont les suivants :
- BENOMYL = Butyl carbamoyl .l benzimidazole carbamate de méthyle
- CHLORONEBE = Dichloro 1,4 diméthyl 2-5 benzène
- EL.291 = Tricyclazole
- TRIDEMORPHE = N tridécyl 2,6 diméthylmorpholine.
1 - EXAMEN MACROSCOPIQUE (cf planches VIIIA et VIIIB)
- -
1.1 - Bénomyl
Aux concentrations de 10N6 et 10” Mole/l, les cultures prkentent
un aspect semblable a celui sur témoin ; 3 10,s M/l; aucun développement du pa-
- 145 -
rasite n'est observable pendant la durée de l'expérience.
‘J 9
* L.
- Chloronèbe
SI
110-3 M/l : teinte rosktre claire ; colonie recouverte d'une couche cré-
meuse qui s'estompe a mesure que l'on va vers la périphérie.
Nous remarquons la présence de nombreuses conidies relativement
courtes (base arrondie) par rapport au témoin et a celles développées sur
bénomyl.
-- iO-4 M/l : teinte cllaire, colonie moins épaisse que précédemment g conl-
dies comparables à celles formees à 10-3 M/l.
.,a
10-S M/l : aucune diifférence significative n'est perceptible par rapport
au témoin.
3,..3 - EL-291
- iO-5 M/l : la coloraltion observée est nettement plus marquée que celle
décrite pour le chloronèbe ; ici en effet, la zone centrale (la plus dgée) de
la colonie est franchement rosâtre ; celle marginale est plus fine, se confon-
dant pratiquement avec la couleur du PCA.
- 10-G et 10-T M/l :
- -
en dehors de la teinte rosâtre plus diluée, nous n'ob-
servons aucune particularité.
1.4 - Tridémorphe
- ~ID-4 et 5 x 10-5 M/l : autour de la ronde1 le inocul um et à m@me le subs-
-
-
trat, se développe un anneau épais, quasi-levuriforme et de teinte brunatre ;
les conidies sont trés arrondies.
- -3-5 M/l : la colonie parasite se développe avec un retard prononcé par
rapport au témoin ; la conidiogénèse ne semble pas affectée ; les conidies ob-
servées sont plus courtes et plus arrondies a leur base que ce'lles observées
sur témod n .
7
Chloronèbe
EL-291
Tridémorphe
10 -5
10 -6
1 0 -7
10-J 15x!O-51 10-5
20,3
0,o
0,O
19,4
20,o
13,l
14,5
20,o
19,l
18,6
18,8
0,O
0,O
7,2
3
0,5
0,O
0,6
0,O
0,5
0,O
O,O-
098
130
039
0,o
0,o
0,3
27,9
0,o
26,8
27,0
19,3
20,O
27,2
25,5
24,7
25,3
0,o
0,o
16,2
4
I 0.4 1 0'0
0'7
0'0
0.3
0'0
1'5
0,6
0,6
0.6
0,o , 0,o , 0,3
l
l
I
l
I
34,8
0,O
35,2
36,0
24,0
26,2
34,8
33,4
32,0
32,4
0,o
0,o
20,5
5
0,4
0,o
1,2
0,o
0,o
0,5
0,5
036
090
036
0,o
0,o
0,5
38,9
0,O
42,2
42,0
30,O
32,2
39,5
39,8
38,6
6
0,9
0,o
0,9
0,o
0,o
1,5
0,3
13
130
46,2 l 0,O I 49,0 I 50,O I 35,6
38,6
46,7
47,0
46,7
45,8
I
8,0 9,0
26,O
7
0,3
0,O
1,6
0,O
0,6
1,7
0,3
L8
18
095
0,O
o,o
0,6
Tableau 43 - PI. oryzae : croissance radiale (mm) en fonction du type et de la concentration du fongi-
cide incorporé ; chaque valeur est une moyenne étabiie a partir de 8 boftes de Petrij
PCA/25OC/obscurité continue.
I\\ Fnnoicides
Tridemorphe
. ---a
1
Bénomvl
Chloronèbe
EL-291
Zéro
Age (J)
1()'5M/l II+ 1 ' 1G-7 1G-3
I 10-5 1 10-6 iI 10-7
lG-4
l-4
-
3 1 G,G 1100 1 4 f 1 1 35 128 11 / 5 1 8 f 7
100
!
t
4
G,G
100
3
3
30
28
G,7
8
11
9
100 l 100 I 41
5
j G,G j 100 / (-1) 1 (-3) / 31 / 24 j G,G j 4 / 8 j 6
100 l 100 I 41
6
/ G,6 1 100 / (-8) j (-7) / 22 j 17 j (-1) 1 (-2) IW) /(-WI
'
7
/ G,G / 1GG / t-6) j (-8) j 22 / 16 / (-1) j (-1) I(- 1) /(-0~3)
I
Tableau 44 - PJ. orpue : Pourcentage d'inhibition de la croissance radiale en fonction du type et de
la concentration (M/l) du fongicide incorporé et par rapport au Smoin ; 25"C/PCA/
obscurité continue.
- 148 -
Dans le cadre de l'expérimentation in u&ro et compte-tenu de la
formula,tion nutirique des résultats (% d'inhibition de la croissance mycélienne
du parasite par chaque type de traitement
: que ce dernier impllique un fongi-
cide ou un germe antagoniste), l'analyse des données relatives aux fongicides
est réalisee de manière comparative ; cette démarche devrait nous permettre de
juger l'efficacité relative 'des auxiliaires naturels par rapport aux fongicides
utilisés.
- Seuls le Benomyl à la concentration 10m5 mole/1 ainsi que les traitements
(Ml. ve.:rmrcaria) X (PJ. orpae x T5. viride ) et (Ml. verrucarSa 11 X (PJ. oryzae X
T5. virtdtz et Cl. g Zobosum) exprimés par rapport à T1 à pH0 4,10, garantissent
--.
.à 100 % contre le parasite pendant toute la dur&e de l'expérience.
- iLes autres traitements conjugant les confrontations diffikée et simulta-
née, de tirne que celui impliquant le Tridémorphe 10w4 et 5 x 10’15 mole/1 notam-
- -
ment, procurent des tisultats quasi-équivalents puisque le plus faible pourcen-
tage d'inhibition de la croissance du parasite est de 82,5 % (induit par l'asso-
ciation Mi. verruearia, Pl. ozyzae et Cl. gZoboswn après 4 jours d'incubation
à pH0 6,0).
--.
- Le Chloronèbe et EL-291 à toutes les concentrations usiti?es, le Bénomyl
à 10B6 et 10-T mole/l, manifestent une TRES NETTE INFERIORITE vis-à-vis des ger-
- -
mes antagonistes impliqués au cours d'une confrontation simultanée :
. d'abord, en raison de la DECROISSANCE CONTINUE du taux d'inhibi-
tion exerce par les fongicides précités alors que les antagonistes extériori-
sent un ACCROISSEMENT CONTINU de leur pouvoir inhiblteur,
. ensuite, du fait que le taux d'inhibition réel est nettement supé-
rieur pour les antagonistes que pour les fongicides considérk : ainsi par exem-
ple, T5. virile exerce un pourcentage d'inhibition MINIMAL de 46 9 après 3 jours
-A
d'incubation à pH0 3,50 alors que pour tous les traitements fongicides concer-
nés, la valeur MAXIMALE observée est de 35,0 % seulement (induite par le Chloro-
nèbe 10m3
-,- mole/1 au 3e jour).
- La décroissance observtfe du taux d'inhibition exercee par ces traitements
fongicides -comme du reste celle exercée par les germes auxiliaires au cours
d'une confrontation différée- tiendrait soit à un phénomene d'accoutumance du
parasite, soit à une faible rémanente des produits, soit enfin, à la superposi-
tion de ces deux phénomènes.
- 149 -
- L'action inhibitrice exercée par les filtrats ou mélange de filtrats de
cultures liquides des germe s antagonistes âgés de 9 jours a 25*C/obscurité
continue sur la croissance mycélienne pondérale du parasite est également SUPE-
RIEURE Zi celle du Chloronebe (10-S ; 10-4 ; 10-s>, EL-291 (10-S ; 10B6 ; 10’7)
-
-
-
-
- -
-
'et du Elénomyl (10-6 et 10m7)~, a l'exception toutefois du tilange des filtrats
-
-
des 3 germes antagonistes qui exerce un effet dépressif (puisque l'action conju-
guée des 3 filtrats de culturesn'engendre qu'une inhibition de Il,6 % de la crois-
sance mycélienne pondérale du parasite à pH0 6,0).
a
- 150 -
CONCLUS1 ON GENERALE
PyricuZaria oryzae peut infecter pratiquement tous les organes
aériens (du riz :
- Sur variété h8te récepti,ve, la pyriculariose foliaire di?termine souvent
la dessication de la gaine ainsi que le grillage de l'ensemble de l‘appareil
foliaire ; quand on sait le rôle primordial que joue la photosynthèse dans la
vie des végétaux verts, on mesure toute la portée d'une telle manifestatfon.
- &es noeuds de la tige (situés au-dessus de la lame d'eau pour des riziè-
res éventuellement inondées) sont autant de sites d'infection (pyriculariose
nodale) ; lorsque c'est le dernier noeud qui est concerne, nous observons les
symptbmes de "NECK ROT" caractérisés par une profonde altération du systi3me
d'approvisionnement des grains dont la constitution est qualitativement compro-
mise ; de plus, une attaque grave détermine une pourriture du cou, aboutissant
à terme a la chute de la panicule.
- L'altération des graines peut également provenir d'une jnfection directe
--
de la panicule ; comme précédemment, la fertilité du paddy se trouve affectée
-
-
voire annulée.
Dans la première partie de la présente étude, nous avons établi une
culture pure et monoconidienne du parasite à partir de la variigté 302 G ; les
observations microscopiques permettent de caractériser P. oryme par la présence
d'un conidiophore à base renflée, fuligineuse et dont la portion terminale est
généraitrice des conidies ; les conidies (mesurant 19 à 23 x 7 ;3 9 microns) de
Mme qlue les caractères macroscopiques culturaux sont fortement influencés par
les conditions du milieu.
- 151 -
Trois volets importants ont retenu notre attention quant a la bio-
logie et a la physiologie du parasite :
LA CROISSANCE MYCELIENNE DU PARASITE
-
- Q? substrat nutritif
Tous les milieux testés (orge/agar ; paddy/agar ; PCA ; PDA ;
MISAT0 6,,.5) ont donné des résultats satisfaisants.
- .&k température
La fourchette thermique théorique étant bornée par les valeurs
8-9*C et 37°C avec un optimum à 28"C, nous avons expérimenté sur PCA entre
10,5OC et 37°C.
L'optimum thermique expérimental est de 30°C ; a 3T'VZ, nous obser-
vons un Puissant blocage du développement de la colonie du paraisite qui manifes-
te une reprise d'activité apres 4 jours d'incubation à 25°C/obs,curite.
- chémkopériode
L'alternance lumiére-obscurité présente un léger avantage ; la lumie-
re continue est moins favorable que l'obscurité continue.
- Le DH
Excepté pH, 2,3!j et a la limite pH, 2,95, toutes les valeurs de pH
- -
expérimentées (milieu PC tamponné à 20 % par le Mc Ilvaine) pralcurent une bonne
croissance pondérale de PI. ozyzae ; cependant, il est difficile, voire impossi-
ble de dissocier l'action strictement imputable au pH de base (pHo) de celle
matérialisant la régulation du pH sous l'action du parasite ; en effet, hormis
le pHo 2'35, peu favorable au parasite, tous les autres pH0 saint rehaussés vers
une valeur limite voisine de 8,20 a 8,30 ; cette régularisation du pH est d'au-
tant plus intense que le pH,, est voisin de l'optimum qui se situe entre 3,95 et
et 5,95 1; parallélement, l'lautolyse mycélienne (qui traduit le vieillissement
des cultures) est d'autant lplus précoce que pHo est favorable.
- 152 -
LA CONIDIOGENESE
La variété hote, le type de lésion, l'humidité relative, la tempé-
rature, la nature du substrat nutritif, le pH, etc..., autant de paramètres
affectant la morphologie et sans doute la physiologie du parasite ; sous cet
aspect, nous avons examiné l'action du milieu, de la température et du pH sur
la conidiogénèse.
- Le PCA, le MISAT0 6.5 induisent l'apparition precoce (5e jour) d'organes
-
-
de fructification ; le PDA, l'ORGEOSE, en raison de leur richesse, favorisent
une végétation luxuriante au détriment de la conidiogénèse perceptible au
12e jour seulement.
- La température : l'optimum expérimental est de 30°C tant pour la précoci-
te que pour l'intensité de la conidiogénese.
- Le pH : la bande optimale des pH est encadrée expérimentalement par les
valeurs pH0 4,60 et pH0 6,45 ; nous avons observé une forte corrélation négati-
ve (r = -0,73) entre le pH et la longueur moyenne des conidies de Pl. owzae ;
aucune variation significative n'affecte la largeur moyenne des conidies.
LA GERMINATION DES CONIDIES
- La réduction du taux de germination observée aux fortes concentrations
conidiennes (30 125 conidies/ml) est liée au ph?nomene d'auto-inhibition.
- La température optimale expérimentale est de 25°C ; l'incubation a 40°C
détermine la mort des conidies.
-e La zone optimale des pH est comprise entre 4,60 et 5,45.
-
P.
-' La lumière continue est défavorable (8 % contre 90 % de germination sous
alternance lumiere-obscurité) à la germination des conidies.
Sur la base de ce PREALABLE PROSPECTIF, nous avons envisagé la neu-
tralisation in vitro du parasite par le biais soit d'auxiliaires naturels, soit
de 4 fongicides systémiques ; pour ce faire, nous avons, au terme d'un criblage
sélectif, retenu les 3 germes Trichodem~ viride, Chuetomiwn~ globosum,
Myrothecium~ verrucatia dont il a fallu cerner les exigences par rapport à celles
du parasite ; c'est à la lumi&e de cette étude préliminaire que nous avons fixé
- 153 -
les parametres expérimentaux pour la suite de nos travaux : milieu a base de
carotte-pomme' de terre ; temperature de 25OC ; obscurité continue ; pH compris
-
-
m-
soit entre 3,o et 4,lO soit entre 5,55 et 6,o.
De plus l'analyse comparative des pourcentages d'inhibition relati-
ve des, croissances radiale (mm) et en surface (cm*) de Pl. orym:aé confronte
simultanément pendant 5 et 7 jours avec les germes antagonistes nous a conduit
a admettre une meilleure représentativité du taux d'inhibition évalué sur la
base de la croissance en surface que celui évalué en fonction de la croissance
radiale et ce, en raison principalement de la déformation affectant la colonie
du parasite dont l'épanouissement est contrarié par la contigu'ité avec le germe
antagoniste ; cependant, les deux méthodes gardent toute leur valeur lorsque le
type de confrontation n'altère en rien la régularité de la colonie du parasite
(confrontation différée ; confrontation avec les fongicides).
Portées ces precisions , nous avons tenté d'interpreter le phénomène
d'antagonisme préalablement mis en évidence en faisant appel aux influences
exercees par les germes antagonistes soit sur la multiplication végétative,
soit sur le phénomene physiologique qu'est la germination des conidies du para-
site.
INFLUE:NC:E DES GERMES ANTAGONISTES SUR LA CROISSANCE MYCELIENNE DU PARASITE
-
-
-
Le test U de MANN et WHITNEY nous a permis de juger de la significa-
tion des différences de croissance observées par rapport au tCmoin.
-- i'excellents résultats (100 % d'inhibition de la Croiss#ance mycélienne
pendant toute la durée de l'expérience) sont obtenus avec les traitements effec-
tues ei pH0 4,lO et associant le binbme PJ. oryzae X !Q. uermcotxtia avec
175. u~kzXe seul ou en conjugaison avec Cl. gtobosm (évaluations realisées par
rapport au témoin TI) ; ces mémes résultats sont observés avec le seul bénomyl
10w5 mole/1 (cf tableaux 28, 30, 36, 40).
-- le tridémorphe 10-4 et 5 x 10-5 mole/l, de m&ne que les autres traite-
ments associant le binome 1)~. oryzae X ~1. verruearia avec l'un ou les deux au-
tres germes antagonistes procurent également de très bons résui’ltats (les plus
-
-
faibles taux d'inhibition sont en effet de 82,5 % et 80,O % pour les germes
auxiliaires et le fongicide respectivement).
- 154 -
- Les résultats fournis par les germes antagonistes au cows d'une confron-
tation simultanee s'avCrent nettement supérieurs 3 ceux observéss avec : le
bénomyl 3.0'6 et 10B7 , les 3 concentrations du chloronèbe et du EL-291. Cette
-
-
-
meilleure efficacité revet une double signification :
. La valeur du taux d'inhibition induite par les germes auxiliaires
est plus élevee que celle engendde par les fongicides concernés ;
. Le taux d'inhibition exerce6 par les germes antàgonistes est
CROISSANT avec le temps (excepté pour la confrontation différ& en raison pro-
bablement soit de la"f&ible rémanente des substances caracteristiques des germes
antagonistes, soit d'une ACCOUTUMANCE du parasite, soit enfin de la superposi-
tion de ces deux phénomènes) ; ce qui leur confère une aptitude! prolongee de
contr8le du parasite ; par contre, les fongicides (comme les substances inhibi-
trices impliquées au cours d'une confrontation differi5e) exerçaint une action qui
s'estompe a mesure, ne parviennent plus a restreindre la croissance du parasite.
Les germes antagonistes interviennent par une action soit a distance
(production de substances inhibitrices diffusibles agissant sur le parasite),
soit Pr contact (les substances eventuellement émises ayant alors une faible
-
vitesse de migration et/ou une faible stabilité) soit enfin, a (distance et par
-"
contact.
INFLUENCE: DES GERMES ANTAGONISTES SUR LA GERMINATION DES CONIDIES DU PARASITE
-
-
- Sejpt traitements ont éte utilises
: suspensions et mélange de suspensions
conidiennes des germes antagonistes dans l'eau distillee stérile : filtrats et
- -
mélange de filtrats naturels de cultures ; filtrats et mélange de filtrats auto-
-
clavés de cultures ; conidies antagonistes maintenues en suspension dans le li-
- -
quide de culture.
- Les traitements suivants : le filtrat autoclave issu d'une culture liquide
de Cl. gZobosum pH, 4,lO (cf tableau 40) ; le mélange de filtratz non autocla-
vés de Cls. globoswn t Ml. verruearia pH, 4,lO (cf tableau 41) ainsi que celui
autoclave impliquant Tg. vir<de t Cl. gtoboswn pH, 4,lO (cf tableau 41) ; les
-
conidies de MI. verrmc&a maintenues en suspension dans le liquide de culture
-
pH, 4,lO et pH, 6,0 (cf tableau 42), inhibent à 100 % la germination des coni-
dies de PI. oryzae.
- De très bons résultats sont également observés avec les filtrats non au-
- 155 -
toclavés de Cl. gZoboswn pH, 4,lO (97,6 % d'inhibition de la germination des
conidies du parasite) et Mi. uerrucaria pH, 4,lO (70,7 %) ; les mélanges de
filtrats naturels de culture du bin8me Tg. viride t Cl. globoszm pH, 4,lO
(95,9 % d'inhibition) ainsi que du trinbme 1'5. vitide t Cl, ghbosm t
Ml. verrucaria (95,9 % d'inhibition).
Au terme de nos investigations, nous pensons avoir demontre la vali-
dite du1 contrble in vitro de P. oryzae par des germes antagonistes ; cependant,
cet acquit, s'il permet d'évaluer l'importance du chemin parcouru, n'a d'inter&
pratique qu'au travers de ses prolongements in &VO ; à ce proposS toute tenta-
tive de vulgarisation de la lutte biologique devra nécessairement tenir compte
de deux principes fondamentaux :
- maintien de l'auxiliaire dans le milieu naturel,
- cownpatibilité des exigences culturales du parasite et des germes anta-
gonistes.
C'est a ce titre et a la lumière des resultats établis par nos expé-
riences que nous qualifierons de RELATIVE, l'efficacité de chacun des germes sé-
lectionnés : chaque germe pouvant manifester sa supériorité pour peu que les
conditions qui prédominent dans le milieu co'ïncident avec ses exigences propres ;
en l'occurence, nous préconiserons l'emploi de Ml. uerrucaria pour circonscrire
le parasite lorsque le facteur de tiférence est le pH ; il est evident par ail-
leurs, qu'? T5. viride qui requiert un pH relativement bas est inapte à garantir
une couverture satisfaisante contre le parasite dont on sait qu'il rehausse trGs
précocement le pH, vers des valeurs optimales défavorables au Tr%dzmierma.
Lorsque l'ensemble des conditions de milieu cofncident avec les
optima requis par le parasite (ex. 30°C ; pH moyens de 3,95 à 7,,0, etc...),
Ml. ver:rucaria serait très certainement le germe dont l'usage individuel indui-
rait le meilleur contrale du parasite.
Cependant, eu ég,ard à la persistance et au développement "convena-
bles" de P. ozyzae lorsque les paramètres du milieu fluctuent au sein d'une
fourchette relativement large (pH, 2,95 à 7,50 ; température de 20 à 30°, etc...),
seule l'association TA. viride t Cl. globoswn t Ml. verruearia permet de juguler
le parasite ; le germe antagoniste le plus favorisé sur le moment parvenant à
supplée,r Ci la déficience du ou des autres : T5. viride joue le r6le pri?pondérant
à pH bas (3,50 ; 4,lO) puis sera relayé par Cl. globosm et/ou Ml. verracar4a
- 156 -
3 mesure que le pH est rehaussG vers 6,20 et 7,50.
k méme, Ts. uirride sera relayé par Cl. gZoboswn et,'ou Ml. vermcatia
lorsque la température passe de 20-25°C a 28-30°C ou inversement ; l'associa-
tion des germes antagonistes permettant d'exploiter le phéno&ne de recouvrement
du spectre d'action caractéristique de chaque germe auxiliaire.
Au vu des résultats obtenus avec les preparations fournies par les
germes antagonistes (filtrats de cultures, mi?lange de filtrats de cultures, CO-
nidïes maintenues en suspension dans le liquide de culture, etc..) sur la crois-
'sance mycélienne et la germination des conidies de P. oryzae), compte tenu par
ailleurs de la synthèse bibliographique Idéalisée, nous serions autorisés a prko-
niser -dans une perspective pratique- soit un trempage de semences ou de jeunes
plants de riz, soit une pulvérisation au niveau de l'appareil foliaire, étant
entendu que l'application PREALABLE des germes antagonistes PREMUNIT l'hdte et
partant; lui confere une meilleure r&istance vis-à-vis du Paras:ite.
SYNTHESE DES ABREVIATIONS
CD = Confrontation différée du parasite avec les germes antagonistes
CD x cs = Conjugaison des confrontations différée et simul,tanée du parasite
avec les germes antagonistes
CM1 = Commonwealth Mycological Insti tute
CMS - Conidies (antagonistes) Maintenues en Suspension (dans le liquide de
CU1 tut-e)
(y; = Confrontation Simultanée du parasite avec les germes alntagonistes
D= Distal (e)
F'c z Filtrat de Cultures des germes antagonistes (= FCN)
FCA = Filtrat autoclavé de cultures des germes antagonistes
FCN = Filtrat naturel (:Par opposition à autoclavé) de cultures des germes
antagonistes
H;iODS = Eau distillée stérile
IKP = variété IKONG-PAO
IHAT = Institut de Recherches Agronomiques Tropicales et de Cultures Vivrières
IRRI = International Riice Research Institute
j = Jour
L 2: LUM = lumière
MFCPI = Mélange (volume à volume) de FCA
MFCN = Mélange (volume à volume) de FCN
M/l = mole/litre
MS C = Mélange de SC dans l'eau distillée stérile
o = OBS - obscurité
ORGEJA = Orge-Agar (cf annexe technique no 1)
P
Proximal (e)
??
PADDY/A = Paddy-Agar (cf annexe technique na 1)
PC -.: Poromés de terre-Agar (cf annexe technique no 1)
PCA - Pomme de terre-Carotte-Agar (cf annexe technique no 1)
PUA .= Potatoe-Dextrose-Agar (cf annexe technique no 1)
pH, - pH initial, observe après autoclavage.
cl;[, ::y Diw%tre de la ronde!lle inoculum (6 mm)
!& z.: Variété Sefa
U;eI = Ilî. om~zae (souche I de P. oryzae provenant de la varieté Se 302 G)
1 = Témoin (ZERO)
TG -:: Témoin Global (traduisant l'effet de masse)
FU'B m. RESISTANCE VERTICALE : regroupement de gènes choisis de façon à conférer
à la variété hôte une RESISTANCE ELEVEE vis-à-vis d'un nombre RESTREINT
de races phytopathogènes.
"v RESISTANCE HORIZONTALE : regroupement de gènes choisis de manière à confé-
rer à la variété hdte un LARGE SPECTRE DE TOLERANCE vis-à-vis d'un nombre
ELEVE de races phytopathogènes.
- 159 -
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. _ - _ _ . .
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ANNEXES
ANNEXE TECHNIQUE no 1
COMPOSITION DES SUBSTRATS NUTRITIFS UTILISES POUR LA
CULTURE DES GERMES CRYPTOGAMIQUES
1.1 - LE MISAT0 pH 6.5
- Amidon soluble..............
10 9
- Extrait de levures..........
39
- Gélose (éventuellement).....
15 g
- Eau distillée q.s.p.........
1 000 ml
Le pH observé après autoclavage est de 6,5.
1.2 - MILIEU A BASE D'ORGEOSE
- Orgéose................,....
15 9
- Gélose (éventuellement).....
15 9
- Eau distillée q.s.p.........
1 000 ml
L'orgéose est un produit commercialisé par JAMMET et dont les com-
posantes sont : orge, dextrine, maltose, malt, germes de blé, levure, sel.
1.3 - MILIEU A GRAINS D'ORGE CUITS A LA VAPEUR
Sa préparation est rigoureusement identique a celle du milieu a
base de paddy que nous décrivons au paragraphe suivant.
1.4 - PADDY/AGAR
A défaut de chaume de riz, le milieu spécifique par excellence de-
-2-
vrait Hre celui fabriqué avec du paddy ; l'essentiel des substances nutriti-
ves étant fourni par les grains de riz enveloppes par les pieces florales (glu-
mes et glumelles) ; l'ensemble portant le nom de paddy.
Le paddy est trempé une dizaine de minutes et lavé abondamnent à
l'eau distillee afin d'en eliminer les traces de fongicides de conservation.
Il est alors réparti a raison de 150 grains par bo4te de Petri de
diametre intérieur 110 mm.
Parallelement, nous préparons de l'eau gélosée (20 g de gelose par
litre 'd'eau distillée). Apres gonflement, l'eau gélosée est coulée dans la
bo4te de Petri jusqu'au niveau supérieur des grains. Nous portons alors les
boftes de Petri dans l'autoclave réglee à 120" pendant 20 minutes.
L'inoculation des bo4tes a lieu apres refroidissement et solidifi-
cation de la gelose.
1.5 - POMME DE TERRE-CAROTTE-AGAR ou PCA
- Pulpe rapee de carotte........
20 9
- Pulpe rapee de pomme de terre.
20 9
- Gelose (éventuellement).......
20 9
- Eau distillée q.s.p........... 1 000 ml
Ce milieu est preconisé par LANGERON ainsi que le C.M.I.
(Commonwealth Mycological Institute).
l-6 - "POTATOE-DEXTROSE-AGAR"
ou PDA
- Pulpe rapée de pormne de terre.
200 g
- Glucose ........................
20 g
- Agar (eventuellement) .........
20 g
- Eau distillée q.s.p ...........
1 000 ml
1.7 - EXTRAIT DE PADDY
- 20 g de paddy à cuire pendant 30 mn ; broyer et filtrer,
- ajuster le volume à 1 000 ml par de l'eau distillée,
- ajouter 1.5 g de glucose,
- 3 -
- agar = l!j g (éventuellement).
Stériliser 20 mn a 120°C.
1.8 - FORMULE A DU MILIEU SYNTHETIQUE DE TANAKA et KATSUKI (1965)
-
\\--
- Sucrose ........................
1530 9
- NH4 NO3 .......................
190 9
- KH2 P04 .......................
035 9
- K2H P04 .......................
035 g
- MgS04.7 H20 ...................
Os25 9
- CaC12.6 H20 ...................
Os05 g
- FeS04.7 H20 ...................
0,75 mg
- MnS04.5 H20 ...................
0,22 mg
- c u s o 4 . 5 H20 . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
0,60 mg
- ZnC12 .. ..m .....................
7,50 mg
- (NH& Mo7; 024.4 H20 ..........
0,06 mg
- H38O4 .........................
0,09 mg
- Biotine
... ....................
550 IJg
- Thiamine ......................
2,5 mg
- H20 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1 000 g
Au début de nos expériences seulement, nous avons dCi utiliser ce
milieu qui, outre sa complexité, ne présente aucun avantage excleptionnel par
rapport aux milieux naturels 8; pour cette raison et compte-tenu du fait que
notre travail n'est pas spécifiquement axé sur la determination qualitative et
quantitative des exigences trpphiques du parasite, nous n'avons pas jugé uti-
le de le garder.
1.9 - AUTRES MILIEUX PRECONISES DANS LA BIBLIOGRAPHIE
- Solution de TOCHINAI t 1 % de décoction de chaume de riz
- Feuilles de Brachiaria mutica
- Milieu de OGASA-WARA glucosé
- feuilles stérilisees de Pennisetm typhoG%mm STAPT. et
HUBBARD
-4-
ANNEXE TECHNIQUE no 2
COMPOSITION DE LA SOLUTION NUTRITIVE DE KIMURA
S04(NH4)2 ...................
48,2 mg
S04K2 .......................
15,2 mg
SO4Mg .......................
65,9 mg
N03K ........................
18,5 mg
(NOS)2Ca ....................
59,9 mg
P04H2K ......................
24,8 mg
Sesquicitrate de Fe .........
15,0 mg en paillettes
B ..........................
020 ppm
Mn .........................
Os40 ppm
Zn ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?
081 ppm
C U .........................
O,Ol r-m
Mo .........................
W1 ppm
Remarques ::
-
-
-
- il est possible d'ajouter du silicate de sodium,
- 100 plants de riz bons a repiquer exportent environ 1,20 g
d'azote, 0,19 g de phosphore et 0,94 g de potassium.
[cf travaux de la station d'Agronomie de Montfavet, cités par le Professeur MARIE ;
station d'amélioration des plantes, I.N.R.A. Montpellier].
-5-
ANNEXE TECHNIQUE no 3
TEMPERATURE, HIJMIDITE RELATIVE ET HEMEROPERIODE MOYENNES
RELEVEES EN SERRE
Mois Novembre Déc:embre Janvier
Température
- . - -
-
-
-
Humidite
L--------------'--------------
_------------------..
1-..-------*--1
relative
.--
Intensité
Intensif$
héméroperiode,
3 5 000
35 000
3 5 000
3 5 000
3 5 000
héméropériodc
'4h6 pfgy'
lux
'1 ux
lux
l u x
lux
$lCh ";yh
-
-6-
ANNEXE T~~IQUE no 4
TECHNIQUE D'ISOLEMENT DES GERMES CRYPTOGAMIQUES DU RIZ
4.1 - ISOLEMENT DIRECT
4.1.1 - Sans désinfection pr+alable
La m6thode consiste a placer les fragments végetaux (feuille, cou,
grain) en chambre humide disposée a 25°C ou a la température ambiante de labo-
ratoire ; l'examen direct a la loupe binoculaire permet de détecter des colo-
nies que l'on repique isolément et que l'on purifie progressivement.
4.1.2 - Avec désinfection préalable
Avant incubation en chambre humide, le matériel végétal est désin-
fecte soit par le chlorure mercurique 1 %, pendant 3 mn, soit par l'hypochlori-
te de sodium 10 % pendant 10 mn, soit enfin par immersion dans l'alcool éthyli-
que 50 % pendant 3 mn, puis rincé abondamment à l'eau distillée stérile avant
d'&tre séche dansune double epaisseur de papier filtre stérile ; l'incubation
est alors réalisée sur substrat nutritif gélosé à 25'C/obscurité continue.
L'obtention de cultures pures se fait comme précédetmwnt.
4.2 - METHODE DE LAVAGE
Le matériel végétal est agité pendant une heure dans une quantité
définie d'eau distillée stérile ; les organes végétaux serviront à isoler les
germes non détachés par lavage, ; la fraction liquide est diluée plusieurs fois,
chacune de ces dilutions est étalée sur substrat nutritif solide que l'on incube
-7-
a 25"C/obscurité continue.
Il suffit alors d'en suivre l'évolution pour isoler les colonies
pratiquement pures au tout début de leur développement. Il nous faut signaler
l'inconvénient que constitue' pour cette méthode, la présence de germes bacté-
riens difficiles a éliminer.
4.3 METHODE D’IMPRESSION
-
Les organes végétaux sont disposés au fond d'une bo'lte de Petri
stérilisée dans laquelle le milieu gélosé ramené a 40°C est coulé. Apres soli-
dification du milieu, les portions de gélose porteuses d'échantillons sont pré-
levées aseptiquement par decoupage et incubées 2 heures à 25°C ; les fragments
sont alors éliminés et le milieu ainsi inoculé est maintenu à 25°C.
-8-
ANNEXE TECHNIQUE no 5
METHODES DE CONFRONTATION DE P. oryzae AVEC LES GERMES
ANTAGONISTES SUR SUBSTRAT GELOSE
5.1 - CONFRONTATION SIMULTANEE
Le parasite est~directement confronté avec le germe antagoniste.
Dans une bofte de Petri renfermant environ 30 ml de milieu gélose, les 2 inocu-
lats sont disposés a la distance d l'un de l'autre @ = 30 mm dans le cribla-
ge sélectif et d = 20 mm dans les expériences ultérieures] et symétriquement
par rapport au centre de la'bo'lte de Petri.
Le degré d'inhibition de la croissance Riycélienne (du parasite par
le germe antagoniste est évalué par la relation :
MT = croissance mycélienne (définie en cm2 à l'aide du planimetre) du parasite
sur botte de Petri "témoin franc" (= T)
M E = croissance mycélienne (cm2) du parasite confronté avec le germe antagoniste
Mi = pourcentage d'inhibition de la croissance mycélienne du parasite par le
germe antagoniste et par rapport au "témoin franc".
Remarques : - Dans ce type de confrontation, l'inhibition du parasite par le
germe antagoniste fait intervenir tant les dérivés métaboliques de l'antagonis-
me que la non miscibilité éventuelle des mycélia des germes en présence.
- Pour confronter simultanément le parasite avec 2 germes antagonis-
tes, nous avons disposé le P. oryzae au centre de la boite de Petri et les ger-
-9-
mes antagonistes sur un time diametre et symétriquement par rapport au para-
site.
- Pour impliquer simultanement les 3 germes antagonistes, nous
avons disposé le parasite au centre ; les antagonistes étant placés sur 3 rayons
définissant 2 a 2 un angle de 120".
- L'intervention simultanée de 2 ou plus de 2 germes permet de révé-
ler un antagonisme ou une synergie dérivant de la nature des interactions eta-
blies entre les germes en présence.
5.2 - CONFRONTATION DIFFEREE
Le germe antagoniste n'agit que par ses dérivés métaboliques, aucun
contact n'étant établi entre mycelia.
5.2.1 - Préparation du substrat
Le milieu gélosé est tapissé stérilement d'une feuille de cellopha-
ne (no 600 du commerce) découpée à la dimension interne de la bofte de Petri
de 90 mm, La pose de la cellophane, en dépit de sa simplicité apparente est re-
lativement délicate ; en effet, la cellophane se contracte et s'enroule sur
elle-m&ne des son contact avec le substrat gélosé ; le fait de laisser reposer
l'ensemble pendant 5 a 10 mn suffit pour homogéneiser l'hydratation de la cello-
phane et partant, de parfaire l‘étalement.
Il faudra particulierement veiller a expulser la moindre bulle d'air
entre cellophane et milieu nutritif afin d'une part, de ne pas nuire à la régu-
larité du développement de la colonie antagoniste, d'autre part, d'assurer une
répartition homogène des substances diffusibles produites par les germes anta-
gonistes et migrant au travers de la paroi de cellophane pour imprégner le mi-
lieu gelosé.
5.2.2 - Inoculation par le germe antagoniste
Le substrat ainsi préparé est inoculé en son centre par le germe
antagoniste.
L'incubation est réalisée à 25"/obscurité continue pendant
*
48 heures.
- 10 -
5.2.3 - Inoculation par P. oryzae
Au bout de 48 heures, la cellophane ainsi que la colonie antagonis-
te sont éliminées aseptiquement ; l'inoculum parasite est alors disposé à l'en-
droit précis du site d'inoculation du germe antagoniste ; l'incubation est faite
a 25'/obscurité continue.
5.2.4 - Evaluation du pourcentage d‘inhibition
L'inhibition de la croissance en surface du parasite est évaluée
conformément a la relation utilisée au paragraphe 5.1 et par rapport au témoin ;
cependant, étant donné la régularité des colonies, l'inhibition peut @tre esti-
mée en tenant compte de la croissance radiale (mm) du parasite confronté en
différé avec l'antagoniste.
5.3 - CONJUGAISON DES CONFRONTATIONS DIFFEREE ET SIMULTANEE;
Cette technique permet d'associer les deux méthodes précédentes.
Sur un même substrat nutritif, le parasite est confronté en DIFFERE à
Mpothecizunl verruearia et en SIMULTANE à Trichoderma5 viride et/ou Chaetomiwnl
gtoboswn.
5.4 - CONFRONTATION SUR SUBSTRAT GELOSE DU PARASITE AVEC LE FILTRAT DE
- -
CULTURE (naturelou autoclave) OU UN MELANGE DE FILTRATS DE CULTURES LIQUIDES
-
-
DES GERMES ANTAGONISTES
5.4.1 - Obtention de filtrats et mélanges de filtrats de cultures
- -
liquides des germes antagonistes
- Préfiltration : les cultures liquides des germes sont débarrassées des
feutrages mycéliens par préfiltration sur papier filtre PRAT-DUMAS no 1.
- Filtration stérilisante : le filtrat limpide précédemment obtenu est fil-
tré sous vide soit sur BOUGIES CHAMBERLAND 5L5, soit de préférence sur un dispo-
sitif mis au point par la "GELMAN INSTRUMENT COMPANY" ; ledit système comporte
d'une part un entonnoir inox, d'autre part deux membranes filtrantes dont les
pores ont respectivement une dimension de 1,2 microns (membrane supérieure) et
0,2 micron (membrane inférieure). Ces membranes donnent de.meilleurs résultats
- 11 -
lorsqu'elles sont inversées (face supérieure en bas) sur l'ento!nnoir inox.
Les conditions de travail aseptiques garantissent l'obtention d'un
filtrat de culture exempt de tout germe exogène et rigoureusement sterile.
Les liquides recueillis sont utilisés soit isolément, (filtrat de
culture ou FC) soit mélangés volume a volume (mélange de filtrat de culture ou
MFC) ; dans tous les cas, le volume final de chaque type de preparation est
fixe et égal a 12 ml ; chacune de ces préparations est utilisée sous forme na-
turelle ou apres autoclavage (20 mn à 120").
5.4.2 - Préparation du substrat de confrontation
A l'aide d'un emporte-piece sterilisé et de diamètre intérieur 6 mn,
nous aménageons au site d'inaculation (centre de la bofte) une cavité dont la
dimension est telle que la rondelle inoculum du parasite en épouse exactement
la forme.
5.4.3 - Confrontation
Nous plaçons 2 à 3 gouttes du FC ou MFC dans la cav$té que nous re-
couvrons par la rondelle inoculum du parasite (mycelium en haut) ; le liquide
ne doit alors déborder que très peu autour du site d'inoculation ; l'incubation
est réalisée à 25"/obscurite continue. Nous avons suivi l'évolu'tion de la crois-
sance radiale pour divers délais d'incubation.
" 12 -
ANNEXE TECHNIQUE no 6
METHODES DE CONFRONTATION DU PARASITE AVEC LES GERMES
ANTAGONISTES SUR MILIEU LIQUIDE
6.1 - CULTURE DU PARASITE SUR FILTRAT (FC) OU MELANGE DE FILTRATS (MFC)
DE CULTURES (C) LIQUIDES DES GERMES ANTAGONISTES
La préparation des FC ou MFC jouant le role de substrat liquide
pour le parasite obéit aux m&nes règles que celles énoncées au paragraphe 5.4.1
(annexe no 5) ; pour chaque type de préparation, le volume final est fixe et
égal è 30 ml placés stérilement dans un erlenmeyer de 100 ml préalablement sté-
rilisé (20 mn au Four ,Pasteur réglé a 18OOC).
Après inoculation par le parasite, nous incubons a 25"/obscurité
continue pendant 10 jours et évaluons la croissance pondérale en fonction de
la composition de base du substrat liquide.
Afin de détecter l'âge optimum des cultures antagonistes correspon-
dant au maximum d'inhibition de la croissance pondérale de P. o;rgza:e, celles-ci
sont incubées pendant 5, 9 et 29 jours.
6.2 - TECHNIQUE DES ERLENMEYER JUMELES
Il eut été intéressant de tester cette technique qui, mieux que tou-
tes les autres, devrait révéler la dynamique du phénomène ; en raison des con-
traintes matérielles, nous n'avons pu l'expérimenter et nous nous bornerons à
en donner le principe : les deux erlenmeyer sont jumelés par les extrémités ro-
dées de tubulures latérales émergeant à leur base.
Un dispositif de filtres millipores occupant la section des tubulu-
- 13 -
res latérales joue le rble de crible de sélection ne laissant transiter que
des molécules de faible dimension (métabolites notamnent).
Introduire le liquide de culture et inoculer l'un des erlenmeyer
par le germe antagoniste et l'autre par le parasite ; les germes, se développent
chacun dans l'erlenmeyer qui lui correspond ; les métabolites des germes antago-
nistes sont sensés migrer au travers des filtres millipores et imprégner le subs-
trat de culture du parasite dont la croissance ponderale est plus ou moins af-
fectee.
Il serait intéressant de pouvoir associer à ce dispositif un syste-
me d'agitation permanente pour faciliter le flux des substances diffusibles
ainsi que 1"homogénëisation du contenu de chaque erlenmeyer.
Cette methode revient donc à confronter 'kimultanément" antagoniste
et parasite sur milieu liquide.
6.3 - CULTURE DU PARASITE SUR FILTRAT DE CULTURE DE L'ANTAGONISTE
CONFRONTE "SIMULTANEMENT" AVEC LE PARASITE SUR MILIEU LIQUIDE
Dans l'expérience pr&édente, il faut recueillir le liquide de cul-
ture du germe antagoniste ; ce liquide est prefiltti, filtré sterilement et
inoculé par le parasite ; le comportement de ce dernier sur un tel substrat de-
vrait donner une idée des modifications (bénéfiques ou non pour le parasite)
exercées par le parasite sur la culture antagoniste au cours de la confrontation
simultanée.
- 14 -
ANNEXE TECHNIQUE no 7
COMPOSITION DU TAMPON MC ILVAINE
Acide citrique
Phosphate
dissodique
H20
PH
M/l0
12 H20
Ml5
-
196,00 ml
4,00 ml
2 ,2
158,90 ml
41,lO ml
3 ,o
122,90 ml
77,lO ml
4 ,o
106,50 ml
93,50 ml
4 ,6
92,80 ml
107,20 ml
5 ,2
79,lO ml
120,90 ml
5 ,13
61,50 ml
138,50 ml
6 ,4
35,30 ml
164,70 ml
7 ,o
5,50 ml
194,50 ml
8 $0
-e
” 15 -
A N N E X E T E C H N I Q U E no 8
LISTE DES VARIETES HOTES RECOLTEES SUR LE TERRAIN
1 -
ACORN 1
2
-
ARPA SALY
3 -
BALA
4a2a-
BOUAKE Notées Pl a P23
2 7
BRANSA
2 8
CKC
2 9
DELTA
3 0
DJIBELOR-346 D
3 1
DJIBELOR 72-2-74
3 2
DJIBELOR 72-2-75
3 3
DJIBELOR 72-2-76
34
DJIBELOR 72-2-84
3 5
DOURADO PRECOLE
3 6
DUBOVSKY
37
EVIOUKOUE
38
GETU
3 9
IKP
40
IR 442
4 1
IR 528
4 2
KOUELOUAI
4 3
KPF-6
4 4
L-5-26
4 5
L-11-14
4 6
MblR 67-13 a1
- 16 -
4 7
NORIN 21
4 8
SAUNTANE
4 9
SEMBON ASAH 1
5 0
SEFA 302 G
5 1
SEFA 319 G
5 2
SEFA 319 G2
5 3
SEFA 319 G7
5 4
SEFA 322 Glg
5 5
SEFA 272 G
5 6
SEFA 301 D
5 7
SEFA 365 G
5 8
SEFA 66-31-19
5 9
SEFA 497 G
6 0
SEFA 249 D
6 1
SEFA 288 D
6 2
SEFA 314 G
6 3
SEFA 363 G
6 4
SOAVINA
6 5
SR-26 b
6 6
SHINRIKI 11
6 7
TC-1-49
6 8
TAZ'NUNG CHUEN 2 S
6 9
TEP-TEP
7 0
TCHAOYANG no 1
71
TTW
72
UZ ROS 269
7 3
ZEN IT
7 4
6044
75
63-104,XLS/117 B
76
63-104 YLS/160 B
7 7
13 a2X IGC/334
- 17 -
c!\\NNEXE TECHNIQUE no 9
DES 71 PAYS ET ETATS
AFFE 'ES PAR LA PYRICULARIOSE
D'après C.M.I. 1961
AFRIQUE (18)
ASIE (19)
Cbte d'ivoire
Birmanie
Ghana
Borneo
Guinde
Ceylan (Sri-Lanka)
Kenya
Chine
Madagascar
Corée
Malawi
Hong-Kong
Maroc
Inde
Mauritaine *
1 rak
Nigeria
Japon
Ouganda
Java
Republique du Soudan
Malaisie
République Sud Africaine
Pakistan
Rhodésie
Philippines
Sénégal
Sarawak
Sierra Leone
Taiwan (Formose)
Tanzanie
ThaClande
Za'ire
Turquie
Zambie
U.R.S.S. (Asis Centrale)
Viet Nam
* Suite à nos observations : . le terrain, nous avons dû ajouter la République
Islamique de Mauritanie.
- 18 -
AUSTRALASIE - OCEAN1
(5)
AMERIQUE CENTRALE (10)
Australie Occidentale
Costa'Rica
Australie du Nord
Honduras britannique
Queensland
Guatemala
Fidji
Jama'Fque
Hawa'i
Nicaragua
Panama
Porto-Rico
EUROPE (8)
République dominicain,e
Salvador
Bulgarie
Trinite et Tobago
France
Grèce
Hongrie
AMERIQUE dlu SUD (9)
Italie
Arqentine
Portugal
Br&.il
Roumanie
Colombie
Yougoslavie
Guyane britannique
Paraguay
P&rou
AMERIQUE du NORD
Surinam
Uruguay
Mexique
Venezuela
U.S.A.
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PLANCHE no IA - CRIBLAGE SELECTIF
Confrontation (âgee de 7 j, sur PCA/25"C/obscurité continue) de
PI. o;ryzae avec les germes dont on recherche l'activité antagw
nlque.
En haut de la bolte de Petri, la colonie de PJ. oryzae ; en bas,
celle du germe testé.
1 - PJ. oryzae seul = Témoin
oryaae x Chaetomium gZobosum
oryzae x Trichodema viride
4 - Pl. oryzae x Gonatobotrys sinplex
6 - Pl. ozyzae x PeniciZZium frequentans
7 - Pl. oryzae x Myrothecium verruearia
PLANCHE no IB - CRIBLAGE SELECTIF
-
-
Confrontation (agée de 7 j, sur PCA/Z"C/obscurité continue) de
Pl. oryzae avec les germes dont on recherche l'activité antago-
nique.
En haut de la bofte de Petri, la colonie de Pl. oryzae ; en bas,
celle du germe testé.
a - pl. oryzae x Gonatobotryum macuZicoZum
9 -Pj. oryzae x i?picoccwn purpurascens (Extra.)
10 - PJ. oryzae x Epicoccwn purpzwascens (ITO.)
11 - Pl. oryzae x Altemuria duuci
12 - Pl. oryzae x GZiocZadiwn roseum
13 - Pl. oryzae x PuZZuZaria (Aureobasidiwn) pu1 ZuZans
_- ._._-
----^
. . . . . . .
--‘lll)llfur
--.-17--
PLANCHE n" IC - CRIBLAGE SELECTIF
Confrontation (âgée de 7 j, sur PCA/25°C/obscurité continue) de
Pi. oryzae avec les germes dont on recherche l'activité antago-
nique.
En haut de la botte de Petri, la colonie de PI. oryzae ; en bas,
celle du germe testé.
1 - Pl. oryzae X CumZaria lutta
2 - Pl. oryzae X CurvuZaria c’lavata
oryzae X Fusar-ium roseum
; 1;;: oryzae X Coniothyrium minitans
5 -Pp oryzae x Asper&Zlus niger
6 - PJ. oryzae x DrechsZera rostrata
7 - Pl. oryzae x Coniothyrim minitans
8 - Pl. oryzae x Starkeyomyces koorchaZomo$des
PLANCHE no II - PyticuZaK~tloryzae
Confrontation simultanée (agée de 7 j, sur PCA/25*C/obscurité
continue) avec les germes antagonistes.
En haut de la botte de Petri, la colonie de PJ. ozyzae ; en bas,
celle du germe dont on évalue l'activité antagonique.
A - pHo 3,50
B - pH0 5,55
w - obscurité continue
1 - PI. oryzae x 0 - Témoin
2 - PI. o r y z a e x T5. viraide
3 - PJ. oryzae x Cl. gtoboswn
4 -"Pl. oryzae x Ml. verrwaria
PLANCHE no IIIA -
-
Pyricu Zarial oryzae
Morphoses affectant le mycélium au cours d'une confrontation simul-
tanée (dgée de 3 j/250C/PCA/pHo 3,50/obscurité continue) avec les
germes antagonistes ; les préparations sont issues de la région
proximale de la colonie du parasite.
A - Pl. oryzae x T4. uiride (GX 1440) : cellules rrlycéliennes
fortement épaissies , se désarticulant facilement, intensé-
ment colorables par le bleu coton ; faciès global de '"bal(ai
de sorcière".
B- Pl. oryzae x T5. uiride (GX 1440) : filament mycélien
contourné.
C - PJ. oryzae x Cl. gZoboswn (GX 2160) : hélice
D - Pl. oryzae x CI. gZoboswn (GX 2160) : torsades
PLANCHE no IIID - PyricuZatial oîyzae
Morphoses affectant le mycélium au cours d'une confrontation simul-
tanée (agée de 3 j/25*C/PCA/pHo.5,55/obscurite
continue) avec les
germes antagonistes.
Les préparations microscopiques sont issues de la région proximale
de la colonie du parasite (par rapport a celle antagoniste).
E - PJ. oryzae x TT~. titi& (GX 1440) : filament mycelien
contourné sur lui-m&ne
F - .PI. oryzae x Tg. uitide (GX 2160) : "torsades"
G - RI. oryzae x T5. uitide (GX 2160) : hélice
H
Pl. oryzae x T5. vitic?e (GX 2160) : filament mycélien
enroulé en pelote terminale
1 - PJ. oryzae x Ml. oermcm-ia (GX 2160) : filaments mycéliens
dont la configuration rappelle étrangement les torons du DNA.
PLANCHE no IV - PyricuLutial oryzae
Confrontation différée (8gee de 7 j/25"C"PCA/obscurité
continue)
avec les germes antagonistes.
A = PH, 3965
B = pH, 6,20
1 = Pl. 02yzae seul (témoin)
2 = PJ. oryzae en différG avec T5. virile
3 = PJ. oryzae en différé avec Cl. globoswn
4 = PJ. oryzae en différé avec Ml. vermcaria
PLANCHE no 'v - Pyr-icuZaria~ oryzae
Morphoses affectant le mycélium au cours d'une confrontation dif-
férée N(agée de 6 j/PCA/25OC/pH, 3,65/obscurité continue)
A - PJ* ozyzae en différe avec T5. vh-ide (GX 1440) :
cellule mycélienne intermédiaire hypertrophiée.
B - Pl. oryzae en différé avec Cl. globosum (GX 1440) :
fillament mycelien contourné sur lui-m&ne en "jambe de chien".
c - Pl. oryzae en différé avec Ml. verruearia (GX 1440) :
faciès de "balai de sorcière".
PLANCHE no Y1 -
Action Conjugu&e de confrontations différée (= X) (par rapport a
Ml. ue~ywxw&z) et simultanée (=X) (par rapport a Tg. uitide S/ou-
CI. globoswn) sur la croissance wcélienne de Pl. ozyzne.
-
7 jours d'incubation sur PCA/25*C/pH, 4,lO/obscurité continue.
T1 = "témoin franc"
T2 = Pl. orpae en différé avec Ml. verrucaria
El = Essai comportant (M . verruc~a) X (Pl. oryzae x T5. viride )
E2 = (Ml. uerrucaria) X tPl. ozyzae x Cl. gZobosum)
E3 = (E41. verrucaria) X (Pl. oryzae x T5. tdtide et Cl. glaboswn)
PLANCHE no VII -
Action conjuguée des confrontations différée (= X) (par rapport d
MI. verracaria) et simultanée (= X) (par rapport a T5. uiy~isde et/ou
Cl. ghboswn) sur la croissance de Pl. oryzae.
-
-
7 jours d'incubation sur PCA/25"C/pHo 6,0/obcurité continue.
T1 = "témoin franc"
T2 = PJ. oryzae en diff&+ avec Ml. vermccaz-da
El = essai comportant
verrucatia) X (PI. oryzae x T5. viride)
E2 = (Ml. verwmzria) X Pl. oryzae x Cl. gtoboswn)
E3 = (Ml. verrucaria) X
oryzae x T5. viride et Cl. gLoboswn)
PLANCHE no VIIIA - Pp-icularial oqzae
Confrontation fongicide-tqycélium ; 7 jours d'incubation sur PCA/
25"C/obscurité continue.
A - Croissance qycélienne en présence de BENOMYL
B - Croissance mycélienne en présence de CHLORONEBE
NB - les concentrations sont exprimi?es en nombre de mole/l.
MCHE no VII IB - PyricuZari~ orpae
Confrontation fongicides-mycelium
; 7 jours d'incubation sur PCA/
25"C/obcurité continue.
A - Croissance mycélienne en prhence de EL-291
B - Croissance mycélienne en prhence de TRIDEMDRPHE
NB - Les concentrations sont exprimees en nombre mole/l.
PLANCHE na Ix - PYRICULARIOSE DU COU
Une,att+que grave de la base de la panicule perturbe l'appro-
visionnement des grains qui se trouvent soit vidés de leur conte-
nu, soit sous-développés.
A et B - varieté IKP
C
- variété ROS 269
Remarquer l'aspect "blanc crémeux" des panicules.
PLANCHE no XA - D'après SH OU : “RICE DISEASES”
A - Observation (après élimination des bordures) de pyriculariose
sur variétés résistantes et sensibles plantées en pépinière.
B- Lésions foliaires observées sur variété résistante (a gauche)
moyennement résistante (au milieu) et sensible (à droite).
C - Pyrîculatia oryzae Cav. : conidies et conidiophores (GX 500).
PLANCHE no XB - D‘après S.H. OU : "RICE DISEASES"
A- Réaction prkoce d'une variété résistante (GINNEN) contre
l‘infection par P. oryzae.
B '- Réaction tardive d'une variété sensible (KAIRYOSHINRIKI) contre
l'infection par P. oryzae.
C a- Apparition de substances apparentées aux résines dans les
tissu:5 nécrotiques d'une variété résistante après infection.
D - Cas des tissus d'une variété sensible.
E- Conidie de P. owzae vue au microscope électronique (GX 10 000).
Chaque cellule possède un noyau comportant 2 types de granu-
lés dont le type gros correspond aux nucléoles ; le pore, les
mitochondries et d'autres organites sont également visibles.
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