Parasrfrco, 1995,51(4)131-142 La maladie du...
Parasrfrco, 1995,51(4)131-142
La maladie du rabougrissement de l’arachide:
Caractérisation symptomatologique et
sérologique de nouveaux isolats du
peanut clump virus (PCV) du Sénégal 1
M. NDIAYE 2 & M. DOLLET 3
qy$tlre;s:
Institut Sénégalais de Recherches Agricoles
,g+&sw * &
LPRC CIRAD-ORSTOM
,iBibfiL,~t\\wj.k: !
A+#~
b :.. 4
Résumé
Des inventaires réalisés en 1990 et 1992 au Sénégal ont démontré la large distribution du peanut
clump virus, même dans des régions où l’arachide est cultivée pour la première fois. La distribu-
tion des plantes infectées et les symptômes varient selon les endroits. Vingt six isolats maintenus
par greffage sur arachides saines ont été caractérisés par les symptômes induits après transmission
mécanique sur diverses plantes, le type de particules virales et la réaction en DAS-, DAC- ou
InDAS-ELISA avec un polyclonal et 8 anticorps monoclonaux ami-PCV. Une grande diversité a
été mise en évidence et 6 groupes sérologiques dont 2 nouveaux ont eté définis. Il n’y a pas de
relation stricte entre le type sérologique, la possibilité de transmission mécanique, les symptômes
induits et l’origine géographique des souches. Les divers groupes sérologiques sont présents dans
la région de Bambey.
Introduction
La maladie du rabougrissement de l’arachide due au “peanut clump virus” (PCV)
cause des pertes considérables de rendement de l’arachide en Afrique de l’Ouest et
en Inde. REDDY et al., (1988) indiquent que dans certains Etats de l’Inde des
parcelles entières ont été abandonnées suite à leur infestation par le “Indian peanut
clump virus”. Au Sénégal plus de 30 % des parcelles expérimentales et semencières
sont sévèrement infestées. L’importance de la maladie en milieu paysan en Afrique
n’a pas encore fait l’objet d’une évaluation précise.
Jusque vers les années 80, le “Clump” de l’arachide était mis en évidence dans les
parcelles expérimentales et dans les champs situés autour de certaines stations de
recherche. A partir de 1986, une prospection systématique des maladies virales de
l’arachide a révélé la présence du virus dans la plupart des zones de culture de cette
légumineuse (DOLLET et al., 1993). La présence du virus dans la vallée du fleuve
Sénégal est particulièrement préoccupante, car dans le cadre des aménagements
hydro-agricoles sur le fleuve, les plans de développement prévoient la valorisation
1
R e ç u l e 1 0 août 1995. Accepté l e 3 d é c e m b r e 1995
2 ISRA. Centre National de Recherches Agronomiques, B.P. 53. Bambey, Sénégal
3
L P R C C I R A D - O R S T O M B . P . 5035,34032 Montpellier Cédex 1, France (pour les demandes de tirés à part)
-132-
des surfaces inigables avec la culture de l’arachide de bouche et la production de
semences de prébase et de base. Le développement et l’activité du vecteur PoJymyxa
graminis étant favorisés par l’humidité du sol (ADAMS & SWABY, 1988; MA-
RAITE et al., 1988) d’une part et d’autre part le virus se transmettant par graine
(THOUVENEL & FAUQUET, 1981; KONATÉ & BARRO, 1993), une propaga-
tion rapide de la maladie dans, ces terres est très probable. Le contrôle du PCV
s’avère ainsi un problème crucial à résoudre.
L’utilisation de cultivars résistants constitue le meilleur moyen de lutter contre les
viroses transmises par les champignons. Or, dans le cas spécifique du “Clump”, le
criblage de 6000 génotypes d’arachide pour la résistance au virus n’a donné que des
résultats insignifiants @EDDY et al., 19%). La lutte repose donc actuellement sur
des méthodes de diagnostic fiables, permettant .notamment le contrôle des semences,
des études épidémiologiques pouvant déboucher sur des méthodes phytotechniques
judicieuses limitant la multiplication et le maintien du potentiel infectieux du sol, sur
la création de nouveaux cultivars par génie génétique. Pour toutes ces stratégies il
est indispensable de connaître la diversité de: la population du PCV. Des différences
dans les propriétés antigéniques des souches ont été mises en évidence, avec comme
conséquence que les anticorps polyclonaux et monoclonaux développés ne recon-
naissent qu’un nombre limité d’e souches de vkus (HUGUENOT et al., 1989). La
technique de la sonde à cDNA apparaît comme une technique de diagnostic très
fiable si elle se base sur des Séq[uences de nuclkotides conservés. Pour identifier ces
séquences la caractérisation d’un grand nombre d’isolats est nécessaire.
Le présent travail s’inscrit dans cette perspective et vient en complément de l’étude
sur la variabilité du PCV initiée au Laboratfoire de Phytovirologie des Régions
Chaudes (LPRC) du CIRAD-ORSTOM de Montpellier. Vingt cinq (25) isolats de
virus collectés en 1990 et 1992 sont caractérkés sur la base des symptômes induits
sur gamme d’hôtes et sur des critères sérologiques.
Matériel et méthodes
SOUCHES DE VIRUS
Des plants fiais d’arachide présentant des symptômes de “clump” (pieds raboufis
avec de petites feuilles vert-foncé, mais aussi des pieds présentant des symptômes
foliaires associés ou non à un nanisme) ont tSté prélevés dans diverses zones de
culture de l’arachide du Sénégal en 1990 et 1992 (figure 1). Ils ont ensuite été
acheminés immédiatement au LPRC du CIRAD-ORSTOM de Montpellier où les
virus ont été multipliés et maintenus par greffage sur la variété 69-101 en cellules
climatiques (26 - 29’C). A ces différents isolats; ont été attribués des noms d’identifi-
cation qui indiquent l’année d’khantillonnage, la zone de provenance et le numéro
de l’échantillon.
DR
OCEAN
ATLANTIQUE
ALI
GUINEE BISSA0
GUINEE CcSNAKR’f
Fig. 1: Régions du Sénégal et sites de provenance des échantillons d’arachides atteintes du PCV
of Senegal and sifes of collecfion of grounchut samples with PCV
MICROSCOPIE ELECTRONIQUE
La méthode de “leaf dip” a été utilisée pour le diagnostic microscopique des échan-
tillons d’arachides malades. L’échantillon (environ 3x3 mm) placé sur un film de
parafilm et recouvert d’une goutte de NaC19 s,, est découpé en morceaux à laide
d’une lame de rasoir. Le liquide est récupéré à l’aide d’une pipette Pasteur effilée et
déposé sur la grille. Après 2 minutes de dépôt, il est éliminé et les particules virales
adsorbées à la surface de la grille sont contrastées pendant une minute avec une
solution aqueuse de 2 % d’acétate d’uranyle. L’observation des grilles a été effectuée
au moyen d’un microscope électronique JEOL JEIVI-1OOCX II.
GAMME D’HOTES
Des tissus congelés de plantes infectées ont été broyés dans une solution “tampon
Clump” (KJFIPO, 15 g, KH,PO, 2,5 g, chlorhydrate L-cysteine 3,5 g, bentonite 2,5 g
et H,O distillée 11 ) pH 7,l ou dans une solution “tampon stripe” (K,HPO, 15 g,
Kl&PO, 2,5 g, Na,SO, 1 g, célite 1 g et H,O distillée 1 1) pH 7,5 dans les propor-
tions 1:5 (p/v). Les extraits de plantes ont été inoculés mécaniquement à des plantu-
les de Chenopodium amaranticolor et de Nicotiana benthamiana et/ou de Datura
stramonium, Glycine max cv. IA-C8, N. clevelandii, N. tabacum xanthi, Phaseolus
vulgaris cv. Top Crop et cv. Contender et Vigna unguiculata cv. Black eye et cv.
C-152. Les plantes inoculées ont été incubées en serre à 24-33°C ou en cellules
climatiques à 2629°C.
-13%
SEROLOGIE
Des échantillons de tissus d’arachide et de Chenopodium infectés par les différents
isolats sont analysés en InDAS-ELISA (indirect double antibody sandwich-enzyme
linked immunosorbent assay) avec les anticorps monoclonaux de PCV (isolat 86
K,,) en DAC (direct antigen coating) et en DA.S (double antibody sandwich)-ELISA
avec des anticorps polyclonaux anti-isolat 86K,,.
Afin de pouvoir comparer les; résultats des expériences menées sur ce virus, le
protocole, les tampons et les ré.actifs décrits par MANOHAR et al. (1994) sont ceux
utilisés pour le test InDAS-ELISA. Des ‘témoins positifs sont choisis parmi les
membres des différents sérogroupes établis par ces auteurs.
L’antisérum anti 86 K,, est testé en DAC-ELISA (HAMPTON et ul., 1990; Hobbs
et al., 1987) et en DAS-ELISA (CLARK & ADAMS, 1977; CONVERSE & MAR-
TIN; 1990).
Résultats
DIAGNOSTIC EN MICROSCOPIE ELECTRONIQUE
L’observation au microscope électronique des extraits de tissus infectés a permis
d’identifier les virus qui possèdent deux types de particules en bâtonnet, de longueur
inégale et de diamètre compris entre 24 mn et 27 mn. Ces paramètres sont caracté-
ristiques du PCV. Les extraits de plantes infectées par l’isolat 90 Ba,,; ont montré la
présence de plusieurs particules filamenteuses en plus de quelques particules en
bâtonnets. Tous les échantillons ne montrant p;ss des particules virales de type PCV
ont été éliminés (tableau 1).
GAMME D’HOTES
Les symptômes observés sur arachides en champs sont très variables (tableau 5) et
ceux obtenus par greffes sur arachide 69- 101 montrent une évolution.
Hormis 90 Ba,, 90 Ba 20a et 90 Jica ,tous les isolats ont induit sur Chenopodium
amaranticolor des lésions locales chlorotiques et/ou nécrotiques avec ou non un
jaunissement ou une nécrose des nervures (tableau 1). L’isolat 90 Ba,, est transmis
difficilement sur Chenopodium en provoquant des lésions chlorotiques. Les inocula-
tions mécaniques de cet isolat sur d’autres espè:ces choisies arbitrairement n’ont pas
provoqué de symptôme, excepté sur Nicotianar benthamiana où des symptômes de
mosaïques et de “ringspots” très caractéristiques du PCV ont été observés (tableau
2). Seuls les isolats 90 Ba,,, et 90 Bazoa n’ont pas induits de symptômes sur cette
dernière espèce.
-135-
TABLEAU 1
Type de particules virales et de symptômes observés sur Chenopodium
amaranticolor et Nicotiana benthamiana inoculés mécaniquement
par différents isola& Sénégalais de PCV.
Type of virus particles and symptoms observed on Chenopodium
amaranticolor and Nicotiana benthamiana after mechanical
inoculation with various isolates from Senegal.
Isola&
Type de
Symptomes sur
N *
localité
région
pXtiCUlule
chénopode
Tabac
9 0 Bal
Bambey
Diourbel
bâtonnet
-
90 Ba&,
Bambey
bâtonnet
tn, jn
ms
9o Ba6b
Bambey
Diourbel
bâtormet
tn, nn
ms
9 0 Ba7
Bambey
Diourbel
bâtonnet
tc, jn
ms
90 Bag
Bambcy
bâtoxmet
tn, jn
9 0 Bal4
Bmbey
Diourbel
bâtoImet
t-0
ms
9 0 Bal%
Bambey
bâtormet
mjn
ms
XJ Bal8
Bambey
Flexueux + bâtonnet 1.c
ms
9 0 Bal9
Bambey
Diourbel
bâtolmet
tn, nn
ms
90 B%oa
Bambey
Diourbel
bâtoimet
-
90 Faya3
Fayalar
Thiés
bâtonnet
ta, jn
ms
9 0 ha4
Thiago
%-Louis
bâtonnet
tC, M
ms
90 Jicag
Thiago
St-Louis
bâtonnet
mjn
ms
9 0 Jica,
Thiago
St-Louis
bâtonnet
t c
9 0 Jicqw
Thiago
St-Louis
bâtonnet
Qc, jn)
(2
90 JiCag
Thiago
St-Louis
bâtonnet
tc, jn
ms
9oK4
Kiréne
Thiés
b$tomet
t c
ms
9 0 mur2
Mbour
Thi&
bâtonnet
trsjn
ms
9 0 Ndioll
Ndiol
St-Louis
bâtonnet
w.in
ms
9 2 Bal
Bambey
Diombel
bâtoxmet
trsjn
ms
9 2 Khela
Khelkom
Fatick
bâtonnet
t c
ms
9 2 Khelb
Khelkom
Fatick
titonnet
t c
ms
9 2 M o u 3
Mouré
Fatick
bâtonnet
t c
ms
9 2 M o u 4
Mouré
Fatick
bâtonnet
tc, jn
ms
9 2 Thialo
Thiago
St-Louis
bâtonnet
tc, jn
m s
*
Le premier chifie indique l’année de prélèvement 1990/1992. Les isolats Ba, ont été
prélevés à la station expérimentale de Bambey. L~es codes Jica,, /Thia, Faya, K, Mbour II
Ndiol,, Khe,, et Mou,, identifient les isolats provenant respectivement de Thiago, Fayalar,
JCirène, Ivfbour, Ndiol, Khelkom, et Mouré; n désignant le numéro de l’échantillon.
**
Les symptômes décrits sont le résultat de l’inoculation secondaire.
Jn = jaunissement des nervures; ms = mosaïque systémique; nn = nécrose des nervures;
ta = taches annulaires; tc = taches chlorotiques; tn = taches nécrotiques; - = rien observable
-136-
TABLEAU 2
Résultats des inoculations de 90 Ba 18 sur diverses plantes. Six plantes ont
été inoculées par espèce/cultivar.
Reaction observed on various plants qjier mechanichal inoculation by PCV
isolate 90 Ba 18. Observations based on six plants per species;cultivars.
Espèce
Réactions
Datura stramonium
Chenopodium amaranticolor
+, Ll
Glycine max cv IA-C8
Nicotiana benthamiana
f, s
Nicotiana clevelandii
Nicotiana tabacum Xanthi
Phaseolus vulgaris cv. Top Crop
Phaseolus vulgaris cv. Contendfer
Pisum sativum
V@a unguiculata cv. Black eye
V@a unguiculata cv. Cl 52
= pas de réaction; + = sensible; Ll = Esions locales; S =: développement systémique
DÉTECTION SÉROLOGIQUEI DES ISOLATS PAR DES ANTICORPS MONO-
CLONAUX (MCA)
Exceptés 90 Bam,, 90 Ndiol,, 92 Mou,, et 92 Thia,, tous les isolats ont été détectés
par un ou plusieurs MCA (tableau 3). L’antic~orps monoclonal 8.2 a réagi avec le
plus grand nombre d’isolats (19/25), par contre le MCA 44.1 n’a reconnu aucun des
isolats collectés au Sénégal. Le profil de réaction des isolats envers les huit anti-
corps monoclonaux a permis de les ctasser en différents groupes sérologiques
(Tableau 4). Au sérogroupe 1 appartiennent 5/‘7 des isolats prélevés sur arachide en
culture irriguée (Tableau 5). Des isolats app,artenant aux sérogroupes 2 et 4 de
Manohar n’ont pas été rencontrés. Le sérogroupe 6 comprend 6 isolats qui sont
détectés uniquement par l’anticorps monoclonal 8.2. Les sérogroupes 7 et 8 comp-
tent un et deux membres et sont reconnus respectivement par les MCA 70.2 et 8.2,
17.2, 64.1, 70.2 et 75.1. Parmi ces 6 sérogroupes recensés, trois sont nouveaux
d’après la classification de Manohar et al. 1993
-137-
TABLEAU 3
Réaction en DAS- et en InDAS-ELISA avec des anticorps polyclonaux et
monoclonaux de l’isolat K 80 du PCV, d’échantillons d’arachide 69-10 1
et de chénopode inoculés par divers isolats de virus collectés sur arachide
en 1990 et 1992 au Sthégal
Reaction of infected groundnut samples from Senegal with polyclonal and
monoclonal antibodies against PCVK 80 isolate in DAS - and InDAS-ELISA
Isolats*
Anticorps
polyclonal @AS-ELISA)
monoclonau~ (InDAS-ELISA)
anti-Kgo
8.2
17.2
44.1
60.2
64.1
66. I
70.2
75.1
---“---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------~
90 Bal
if
+++ -
90 Ba4b
t-b+
+++
+++ -
+ +
t++
+++
+++
fff
90 B%b
t++
+ +
i-if
-
t
-
tif
iff
90 Ba7
+ + +
++
-
90 Bag
t t t
fi
++t
-
+t
+t+
t
+++ ++
90 %4
+++
if
+++ -
+
iu
+i-
+++
”
!%lBal?b
-
-
_
90 Bals
+
+
_
_
_
tif
-
90 Bal9
+++
+++ ++
-
-
+++ -
t t t
+ + +
90 %oa
+++
+ + +
+++
-
fi
itt
+++
t t t
t t t
!Xl Faya3
t++
t u
+tt
-
++
+++ tu
t++
+ + +
90 Jica4
t-k+
+ + +
+++
-
u
+ + +
+++
+++ +
90 Jicag
tit
++t
tif
-
+t
ut
+t+
ii+
t
90 Jicag
t t t
t t t
4-i-t
-
u
ttt tt
t u
tti
90 Jicq
-Ht
ii+ ut
-
tt
ut
ii+
ttt ut
90 k.EI~
++t
t u
i-fi-
-
u
ttt
+t+
i-i+
f+t
9OK4
i-l-t
t-t+
Uf
-
++
tif
++t
+t+
tti
90Mbour2
+
+t+
-
+
-
t+
+
90 Ndioll -
92 J3a7
+ t t
fi+
ii+
-
++-t
itt
t+
fff
tif
92
Khqa -
++
-
_
_
-
-
-
-
92Khqb
-
++
-
92 Mou3
-
92 Mou4
-
+
-
92Thialo
-
88 Bas.type 0
+++
0
0
+t+
0
++t 0
0
88Mbour2
0
0
++t 0
0
0
+++ 0
0
87 Thy.TG.N. 0
+++ 0
-
0
+++
0
0
0
87 Thy.TGTA3 0
t t
0
0
0
0
tti-
0
0
86 K79
-
Ch. sain -
Ara.sain
-
PBS-T
-
* 88 Ba,, 88 Mbour,, 87 Thy.TG.N. et 87 Thy.TGTA3 sont des témoins positifs des divers
sérogroupes de PCV établis par Manohar (1993). 86 K,, est un représentant du sérogroupe 5.
+++, ++, + = mesures de Aa5 supérieures à 0,40 ou comprises respectivement entre 0,40-0,30
et 0,30-0,25. - = absence de réaction (Aao5 < 0,l et 0 = non testé.
-13%
TABLEAU 4
Classification de 24 isolats de PCV sur la base de leur réaction en InDAS-ELISA
avec 8 anticorps monoclonaux (d’après Manohar 1993).
Uuss~fkution of 24 PCL’isoIutesj~om S’enegal on base qf’their reaction in
InIlAS-EIZA with 8 monoclonal antihodies.
-
Groupe serologique
Isolait
Remarques
Sérogronpe 1
9 0 Ba4t,, 90 Bas, 90 Bz.,
Détectés par les anticorps
9 0 Ba7tra, 90 Faya?, 90 Jica4
monoclonaux 8.2, 17.2, 60.2, 64.1.
9 0 Jica+ 90 Jica6. 90 Jica7
66.1. 70.2, et 75.1
9 0 Jicax. 90 K4 92
et
&-
scrogroupe 3
90 Mboq
Détectés par les anticorps
monoclonaw 17.2, 60.2. 66.1 et
-
70.2
Sérogroupe 5
90 Ba , ,n, 92 Mou?, 92 Thia, 0
Non détectés par aucun anticorps
monoclonal
Sérogroupe 6
90 Bat, 90 Ndiolt, 92 Khet,
Déleclés par l’anticorps
92 K.he et 92
t n
MOU~
monoclonaJ 8.2
Serogroupe 7
90 Ba7
Détecte par l’anticorps monoclonat
70.2
Sérogroupe 8
90 E&+, et 90 Bat 9 -
Détectés par les anticorps
monoclonaux 8.2 17.2, 64.1,70.2
COMPARAISON SÉROLOGIQUE DES ISOLATS EN DAS- ET EN INDAS-
ELISA
En InDAS-ELISA avec le MCA 60.2, les me:sures de la densité optique à 405 nm
ont donné des valeurs faibles, exceptés 92 Ba, et 88 Ba, type 2 , (tableau 3). Les
réactions ont été accompagnées de bruits de fonds importants. Dix huit isolats ont
réagi en DAS-ELISA, alors que l’ensemble des MCA ont détecté 20 isolats. En
DAS-ELISA, les isolats 90 Ndiol,, 92 Khe,,, 92 Khe,,, et 92 Mou, n’ont pas réagi.
Par contre tous ces isolats sauf 90 Ndiol 1, s’ont faiblement détectés par l’anticorps
monoclonal 8.2. L’isolat 90 Ba 18 a été détecté faiblement en DAS-ELISA et en
InDAS-ELISA avec l’anticorps monoclonal 8.2 et fortement avec l’anticorps mono-
clonal 64.1. 90 Bai%, 92 Mou,, et 92 Thia,,) n’ont pas été détectés dans les différents
tests ELISA.
Discussion
L’étude symptomatologique riialisée sur les échantillons prélevés en champ montre
une grande variabilité des symptômes. Cette diversité ne saurait s’expliquer unique-
ment par l’intensité variable des symptômes due à une contamination plus ou moins
tardive de l’arachide par différents isolats du virus. Il ne serait pas exclu que certai-
nes infections soient induites par un mélange de variants du PCV.
Le test de transmission par inoculation mécanique des isolats 90 Bai et 90 Bazoa à
des plantules de Chenopodium amaranticodur a donné de manière constante des
-139-
résultats négatifs. L’observation au microscope électronique a révélé des particules
virales typiques du clump chez ces isolats qui ont, par ailleurs bien réagi en DAS- et
en InDAS-ELISA avec l’anticorps monoclonal 8.2. Un autre prélèvement qui se
transmet difficilement ou pas par inoculation mécanique sur Chenopodium amaran-
ticolor est 90 Jicq. Sur 4 essais de transmission utilisant 6 plantes par essai, (3
plantes en serre et 3 autres plantes en cellule climatique) une seule tache chlorotique
a été obtenue. L’inoculation secondaire de cette tache à des chénopodes reproduit
facilement les symptômes de PCV. Les isolats 90 Ba,, 90 Baloa et 90 Jica,, transfé-
rables sur arachide par greffe semblent perdre ou ne pas posséder la propriété d’être
transmis mécaniquement sur Chenopodium amaranticolor. L’existence de tels
isolats en conditions naturelles compliquerait d’avantage le suivi épidérniologique
du PCV et la sélection de matériel résistant, car elle éliminerait un outil important de
détection du virus qu’est l’indexage biologique (THOUVENEL et al., 1976).
TABLEAU 5
Variabilité symptomatoiogique et sérologique et incidence des isolats de PCV
collectés dans la vallée du Fleuve Sénégal
Variation in symptoms, incidence and serological properties among PCV
isolates collected in Senegal River valley
Isolat
Symptôme sur arachide
sérogrollpe
Incidence
90 Jica4
Pied touffu et rabougri, avec des feuilles
1
Quelques pieds isolés
petites
(Clump typique)
90 Jicas
Marbrure sur jeunes feuilles, Pas d’arabesque
Quelques pieds isolés
90 Jiq
Taches annulaires et arabesques sur jeunes
Plusieurs blocs de 6 lignes avec
feuilles
environ 70 % des plantes
atteintes
90 Jica7
Mosaïque avec taches annulaires
pie& isolés
90 Jicag
Nanisme et arabesques
pieds isolés
92 Thialo
Arabesques et taches ocellées
pieds isolés
* Les échantillons Jica, et Thia,,, identifient les isolats de virns provenant du périmètre irrigué de
Thiago.
La différence de comportement au niveau du pouvoir pathogène, entre d’une part les
isolats 90 Ba,, 90 Ba,,, et 90 Jica, et les isolats type du PCV d’autre part, devrait
être mise en relation avec la structure génique du PCV. Une telle étude aiderait à
mieux cerner la variabilité génétique du PCV et à mettre en évidence les gènes liés à
la virulence et au mode de transmission.
La plupart des isolats collectés au niveau du fleuve Sénégal semblent provenir de
semences infectées, puisque constitués de pieds isolés présentant des symptômes.
L’isolat 90 Jica, et les isolats de Bambey proviennent par contre de parcelles où
I
--
-140-
environ 70 % des plantes présentaient des symptômes de maladie. Une étude est
initiée en collaboration avec l’unité de phytopathologie de l’université Catholique de
Louvain, afin de mettre en évidence l’existence de PoZyniyxn graminis (THOUVE-
NBL & FAIJQUET, 1981; RATNA et al., 199 1) dans ces sols et de déterminer son
rôle dans la transmission des différentes souche:s du PCV.
Les réactions sérologiques des différents isolats ont été étudiées par trois variantes
du test ELISA. Dans l’ensemble le profil des réactions était similaire dans Ies trois
méthodes. Les isolats qui n’ont réagi qu’avec l’anticorps monoclonal8.2 n’ont pas été
détectes en DAC- et en DAS-ELISA avec l’anticorps polyclonal. Ces résultats sont
en adéquation avec les études de AL MOUDALLAL et al., (1984) et de HUGUE-
NOT et a/., (1989). Ces auteurs ont montré que le MCA 8.2 reconnaît un épitope
conformationnel qui est détruit en DAS-ELISA par l’absorption de l’antigène par
l’anticorps.
La variante DAC-ELISA s’est avérée très utile pour le suivi épidémiologique des
maladies virales causées par le Tomato spotted wilt virus (TSWV), le Peanut mottle
virus (PMV) et le lndian peanut clump virus (IPCV) et d’autres virus (HOBBS et
al., 1987 et NDIAYE et al., 1993). Cependant dans les conditions de notre étude,
cette méthode a identifié moins d’isolats de PCV que les autres méthodes. Par
ailleurs des réactions non spécifiques, renda.nt peu fiables les résultats, ont été
enregistrées (résultats non présentés).
Les méthodes sérologiques utilisant l’anticorps polyclonal et les anticorps monoclo-
naux de l’isolat du PCV K,,) ne permettent pas un diagnostic fiable de la maladie du
rabougrissement de I’arachide, puisque au moins un cinquième des isolats n’a pas
été clairement identifié. Ces résultats confirment ceux déjà rapportes par HI.JGI.JE-
NOT et al., (1989) et par MANOHAR et al., (1994). Des anticorps monoclonaux
polyspécifiques devront être testés pour la détection et l’identification sérologiques
de ce vii-ns.
Les tests d’inoculation mécanique sur gamme d’hôte ainsi que les analyses sérologi-
ques n’ont pas mis en évidence une relation entre les zones géographiques et la
distribution des différents groupes sérologiqules du PCV. Cependant, ils indiquent
qu’au Sénégal il existe divers isolats du PCV et qu’ils sont compliques à analyser.
Remerciements
Une vive reconnaissance est due à I’ISRA et au CIRAD pour l’aide consentie à la réalisation de
cette étude et au Pr. H. MARAITE qui a accepté de réviser ce document.
-141-
Summary
PEANUT CLUMP VIRUS (PCV): SEROLOGICAL AND
SYMPTOMATOLOGICAL CHARACTERISATION
OF
NEW ISOLATES FROM SIENEGAL.
Surveys of peanut viral diseases in Senegal during the rainy seasons of I990 and 1992 showed a
wide distribution of peanut clump virus. The virus was even identified on fields in the Senegal
River and Fatick Regions, where peanut was grown for the very first time. The distribution and
symptoms of infected plants differed according to the areas. Twenty six PCV isolates maintained
by graRs on healthy peanut plants were characterised by induced symptoms on diverse hosts, type
of viral particles, and DAS-, DAC-, or InDAS-ELISA with one polyclonal and 8 monoclonal
antibodies anti-PCV. Six serological groups including three new ones were defined. No relation-
ship was found between different serological groups, mechanical transmission properties, induced
symptoms and geographical origin of the isolates. Al1 serological groups are present in the area
around Bambey.
Références bibliographiques
ADAMS, M.J.& SWABY, A.G. 1988. Factors affecting tbe production a.nd motility
of Polymyxa graminis and their transmission of barley yellow mosak virus
(BaYMV). Ann. appl. Biol. 112:69-78.
rv, MOUDALLAL, Z., ALTSCI-IUH, D., BRIAND, J. P. & VAN REGENMORT-
EL, M.H.V.1984. Comparative sensitivity of different ELISA procedures for
detecting monoclonal antibodies. J. Immunological methods 68:35-43.
CLARK, M.F. & ADAMS, A.N. 1977. Characteristics of the microplate method of
enzyme linked immtmosorbent assay for the detection of plant virus. J. Gen.
Virol. 34:475-483.
CONVERSE, R.H. & MARTIN, R.R. 1990. ELISA methods for plant viruses. In:
Seroiogical Methods for Detection and IdentiJication of Viral and Bacterial
Plant Pathogens: A Laboratory Manual. K. Hampton, E. Hall, & S. De Boer,
eds. American phytopathological Society, St. Paul, Mn:179-f96
DOLLET, M., DUBERN, J., WALIYAR, F. & MANOHAR, S.K. 1993. Distribu-
tion of peanut clump virus (PCV), a virus with high symptom variability. Pro-
ceedings of the international working group ofplant viruses with fungai vector,
Jul,v 2.5-27, 1993 Canada ed. C. Hiruki:147-152
HAMPTON, R.O., ALBRECHTSEN, S.E. & MATHUR, J.B. 1990. Seed health
(viruses) of Vigna ungiculata cultivars/selections t?om developing countries. Seed
Sci. Technol. 20123-38.
HOBBS, H.A., REDDY, D.V.R., RAJESHWARI, R. & REDDY, A.S. 1987. Use
of direct antigen coating and protein A coating ELISA procedures for detection of
three peanut viruses. Plant Diseuse 71:747-749.
HUGUENOT, C., GIVORD, L., SOMMERMEYER, G. & VAN REGENMOR-
TEL, M.H.V. 1989. Differentiation of peanut clump virus serotypes by
monoclonal antibodies. Research in Virology 1410: 87- 102.
-142-
KONATE, G. & BARRO, N. 1993. Dissemination and detection of peanut clump
virus in groundnut seed. Ann. Appt. Biol. 123:623-627
MANOHAR, S.K., DOLLET, M., DUBERN, J. & GARG ANI, D. 1994. Studies on
variability of peanut clump virus: symptomatology and serology. .1. Phytopatho-
logy 143:233-238
MARAITE, H., GOFFART, J.P., & BASTIN, V. 198X. Development of quantita-
tive method for assessment of Polymyxa grominis Led. inoculum potential in soil.
In: Integrated Trop Protection in Cereals (Eds R. Carvalloro and K.D. Suther-
land). A.A. Balkema.: Rotterdam:259-266.
NDIAYE, M., BASHIR, M., KELLER, K.E. & HAMPTON, R.O. 1993. Cowpea
viruses in Senegal, West At%ca; Identifica@ion, distribution, seed transmission,
and sources of genetic resistance. Plant Diseuse 77: 999- 1003.
RATNA, A.S., RAO, A.S., NOLT, B.L., REDDY, D.V.R., VIJAYALAKSHMI,
M., & McDONALD, 0. 199 1. Studies on transmission of Indian peanut clump
virus disease by Polymyxa graminis. Ami. Appl. Biol. 118:71-78.
REDDY, D.V.R., NOLT, B.L., HOBBS, HA., REDDY, A.S. RAJESHWARI, R.,
RAO, A.S., REDDY, D.D.R. & McDONALD, D. 1988. Clump virus in India:
isolates, host range, transmission and management. In: Development in Applied
Biology 2: Viruses with Fungal Vectors. Eds J. 1. Cooper & M.J.C. Asher. Asso-
ciation of Applied biologist, Wellesbourne, U. K.:239-246.
THOUVENEL, J.C., DOLLE’T, M. & FAUQUET, C. 1976. Some properties of
peanut clump, a newly discovered virus. Armais ofAppIied biology 8413 1 l-320.
THOUVENEL, J.C. & FAUQUET, C. 1981. Further properties of peanut clump
virus and studies on its natural transmission. Ann. Appl. Biol. 97:99-107.
Juin, 1996
La maladie du rabougrissement de l’arachide:
Caractérisation symptomatologique et
sérologique de nouveaux isolats du
peanut clump virus (PCV) du Sénégal 1
M. NDIAYE 2 & M. DOLLET 3
qy$tlre;s:
Institut Sénégalais de Recherches Agricoles
,g+&sw * &
LPRC CIRAD-ORSTOM
,iBibfiL,~t\\wj.k: !
A+#~
b :.. 4
Résumé
Des inventaires réalisés en 1990 et 1992 au Sénégal ont démontré la large distribution du peanut
clump virus, même dans des régions où l’arachide est cultivée pour la première fois. La distribu-
tion des plantes infectées et les symptômes varient selon les endroits. Vingt six isolats maintenus
par greffage sur arachides saines ont été caractérisés par les symptômes induits après transmission
mécanique sur diverses plantes, le type de particules virales et la réaction en DAS-, DAC- ou
InDAS-ELISA avec un polyclonal et 8 anticorps monoclonaux ami-PCV. Une grande diversité a
été mise en évidence et 6 groupes sérologiques dont 2 nouveaux ont eté définis. Il n’y a pas de
relation stricte entre le type sérologique, la possibilité de transmission mécanique, les symptômes
induits et l’origine géographique des souches. Les divers groupes sérologiques sont présents dans
la région de Bambey.
Introduction
La maladie du rabougrissement de l’arachide due au “peanut clump virus” (PCV)
cause des pertes considérables de rendement de l’arachide en Afrique de l’Ouest et
en Inde. REDDY et al., (1988) indiquent que dans certains Etats de l’Inde des
parcelles entières ont été abandonnées suite à leur infestation par le “Indian peanut
clump virus”. Au Sénégal plus de 30 % des parcelles expérimentales et semencières
sont sévèrement infestées. L’importance de la maladie en milieu paysan en Afrique
n’a pas encore fait l’objet d’une évaluation précise.
Jusque vers les années 80, le “Clump” de l’arachide était mis en évidence dans les
parcelles expérimentales et dans les champs situés autour de certaines stations de
recherche. A partir de 1986, une prospection systématique des maladies virales de
l’arachide a révélé la présence du virus dans la plupart des zones de culture de cette
légumineuse (DOLLET et al., 1993). La présence du virus dans la vallée du fleuve
Sénégal est particulièrement préoccupante, car dans le cadre des aménagements
hydro-agricoles sur le fleuve, les plans de développement prévoient la valorisation
1
R e ç u l e 1 0 août 1995. Accepté l e 3 d é c e m b r e 1995
2 ISRA. Centre National de Recherches Agronomiques, B.P. 53. Bambey, Sénégal
3
L P R C C I R A D - O R S T O M B . P . 5035,34032 Montpellier Cédex 1, France (pour les demandes de tirés à part)
-132-
des surfaces inigables avec la culture de l’arachide de bouche et la production de
semences de prébase et de base. Le développement et l’activité du vecteur PoJymyxa
graminis étant favorisés par l’humidité du sol (ADAMS & SWABY, 1988; MA-
RAITE et al., 1988) d’une part et d’autre part le virus se transmettant par graine
(THOUVENEL & FAUQUET, 1981; KONATÉ & BARRO, 1993), une propaga-
tion rapide de la maladie dans, ces terres est très probable. Le contrôle du PCV
s’avère ainsi un problème crucial à résoudre.
L’utilisation de cultivars résistants constitue le meilleur moyen de lutter contre les
viroses transmises par les champignons. Or, dans le cas spécifique du “Clump”, le
criblage de 6000 génotypes d’arachide pour la résistance au virus n’a donné que des
résultats insignifiants @EDDY et al., 19%). La lutte repose donc actuellement sur
des méthodes de diagnostic fiables, permettant .notamment le contrôle des semences,
des études épidémiologiques pouvant déboucher sur des méthodes phytotechniques
judicieuses limitant la multiplication et le maintien du potentiel infectieux du sol, sur
la création de nouveaux cultivars par génie génétique. Pour toutes ces stratégies il
est indispensable de connaître la diversité de: la population du PCV. Des différences
dans les propriétés antigéniques des souches ont été mises en évidence, avec comme
conséquence que les anticorps polyclonaux et monoclonaux développés ne recon-
naissent qu’un nombre limité d’e souches de vkus (HUGUENOT et al., 1989). La
technique de la sonde à cDNA apparaît comme une technique de diagnostic très
fiable si elle se base sur des Séq[uences de nuclkotides conservés. Pour identifier ces
séquences la caractérisation d’un grand nombre d’isolats est nécessaire.
Le présent travail s’inscrit dans cette perspective et vient en complément de l’étude
sur la variabilité du PCV initiée au Laboratfoire de Phytovirologie des Régions
Chaudes (LPRC) du CIRAD-ORSTOM de Montpellier. Vingt cinq (25) isolats de
virus collectés en 1990 et 1992 sont caractérkés sur la base des symptômes induits
sur gamme d’hôtes et sur des critères sérologiques.
Matériel et méthodes
SOUCHES DE VIRUS
Des plants fiais d’arachide présentant des symptômes de “clump” (pieds raboufis
avec de petites feuilles vert-foncé, mais aussi des pieds présentant des symptômes
foliaires associés ou non à un nanisme) ont tSté prélevés dans diverses zones de
culture de l’arachide du Sénégal en 1990 et 1992 (figure 1). Ils ont ensuite été
acheminés immédiatement au LPRC du CIRAD-ORSTOM de Montpellier où les
virus ont été multipliés et maintenus par greffage sur la variété 69-101 en cellules
climatiques (26 - 29’C). A ces différents isolats; ont été attribués des noms d’identifi-
cation qui indiquent l’année d’khantillonnage, la zone de provenance et le numéro
de l’échantillon.
DR
OCEAN
ATLANTIQUE
ALI
GUINEE BISSA0
GUINEE CcSNAKR’f
Fig. 1: Régions du Sénégal et sites de provenance des échantillons d’arachides atteintes du PCV
of Senegal and sifes of collecfion of grounchut samples with PCV
MICROSCOPIE ELECTRONIQUE
La méthode de “leaf dip” a été utilisée pour le diagnostic microscopique des échan-
tillons d’arachides malades. L’échantillon (environ 3x3 mm) placé sur un film de
parafilm et recouvert d’une goutte de NaC19 s,, est découpé en morceaux à laide
d’une lame de rasoir. Le liquide est récupéré à l’aide d’une pipette Pasteur effilée et
déposé sur la grille. Après 2 minutes de dépôt, il est éliminé et les particules virales
adsorbées à la surface de la grille sont contrastées pendant une minute avec une
solution aqueuse de 2 % d’acétate d’uranyle. L’observation des grilles a été effectuée
au moyen d’un microscope électronique JEOL JEIVI-1OOCX II.
GAMME D’HOTES
Des tissus congelés de plantes infectées ont été broyés dans une solution “tampon
Clump” (KJFIPO, 15 g, KH,PO, 2,5 g, chlorhydrate L-cysteine 3,5 g, bentonite 2,5 g
et H,O distillée 11 ) pH 7,l ou dans une solution “tampon stripe” (K,HPO, 15 g,
Kl&PO, 2,5 g, Na,SO, 1 g, célite 1 g et H,O distillée 1 1) pH 7,5 dans les propor-
tions 1:5 (p/v). Les extraits de plantes ont été inoculés mécaniquement à des plantu-
les de Chenopodium amaranticolor et de Nicotiana benthamiana et/ou de Datura
stramonium, Glycine max cv. IA-C8, N. clevelandii, N. tabacum xanthi, Phaseolus
vulgaris cv. Top Crop et cv. Contender et Vigna unguiculata cv. Black eye et cv.
C-152. Les plantes inoculées ont été incubées en serre à 24-33°C ou en cellules
climatiques à 2629°C.
-13%
SEROLOGIE
Des échantillons de tissus d’arachide et de Chenopodium infectés par les différents
isolats sont analysés en InDAS-ELISA (indirect double antibody sandwich-enzyme
linked immunosorbent assay) avec les anticorps monoclonaux de PCV (isolat 86
K,,) en DAC (direct antigen coating) et en DA.S (double antibody sandwich)-ELISA
avec des anticorps polyclonaux anti-isolat 86K,,.
Afin de pouvoir comparer les; résultats des expériences menées sur ce virus, le
protocole, les tampons et les ré.actifs décrits par MANOHAR et al. (1994) sont ceux
utilisés pour le test InDAS-ELISA. Des ‘témoins positifs sont choisis parmi les
membres des différents sérogroupes établis par ces auteurs.
L’antisérum anti 86 K,, est testé en DAC-ELISA (HAMPTON et ul., 1990; Hobbs
et al., 1987) et en DAS-ELISA (CLARK & ADAMS, 1977; CONVERSE & MAR-
TIN; 1990).
Résultats
DIAGNOSTIC EN MICROSCOPIE ELECTRONIQUE
L’observation au microscope électronique des extraits de tissus infectés a permis
d’identifier les virus qui possèdent deux types de particules en bâtonnet, de longueur
inégale et de diamètre compris entre 24 mn et 27 mn. Ces paramètres sont caracté-
ristiques du PCV. Les extraits de plantes infectées par l’isolat 90 Ba,,; ont montré la
présence de plusieurs particules filamenteuses en plus de quelques particules en
bâtonnets. Tous les échantillons ne montrant p;ss des particules virales de type PCV
ont été éliminés (tableau 1).
GAMME D’HOTES
Les symptômes observés sur arachides en champs sont très variables (tableau 5) et
ceux obtenus par greffes sur arachide 69- 101 montrent une évolution.
Hormis 90 Ba,, 90 Ba 20a et 90 Jica ,tous les isolats ont induit sur Chenopodium
amaranticolor des lésions locales chlorotiques et/ou nécrotiques avec ou non un
jaunissement ou une nécrose des nervures (tableau 1). L’isolat 90 Ba,, est transmis
difficilement sur Chenopodium en provoquant des lésions chlorotiques. Les inocula-
tions mécaniques de cet isolat sur d’autres espè:ces choisies arbitrairement n’ont pas
provoqué de symptôme, excepté sur Nicotianar benthamiana où des symptômes de
mosaïques et de “ringspots” très caractéristiques du PCV ont été observés (tableau
2). Seuls les isolats 90 Ba,,, et 90 Bazoa n’ont pas induits de symptômes sur cette
dernière espèce.
-135-
TABLEAU 1
Type de particules virales et de symptômes observés sur Chenopodium
amaranticolor et Nicotiana benthamiana inoculés mécaniquement
par différents isola& Sénégalais de PCV.
Type of virus particles and symptoms observed on Chenopodium
amaranticolor and Nicotiana benthamiana after mechanical
inoculation with various isolates from Senegal.
Isola&
Type de
Symptomes sur
N *
localité
région
pXtiCUlule
chénopode
Tabac
9 0 Bal
Bambey
Diourbel
bâtonnet
-
90 Ba&,
Bambey
bâtonnet
tn, jn
ms
9o Ba6b
Bambey
Diourbel
bâtormet
tn, nn
ms
9 0 Ba7
Bambey
Diourbel
bâtonnet
tc, jn
ms
90 Bag
Bambcy
bâtoxmet
tn, jn
9 0 Bal4
Bmbey
Diourbel
bâtoImet
t-0
ms
9 0 Bal%
Bambey
bâtormet
mjn
ms
XJ Bal8
Bambey
Flexueux + bâtonnet 1.c
ms
9 0 Bal9
Bambey
Diourbel
bâtolmet
tn, nn
ms
90 B%oa
Bambey
Diourbel
bâtoimet
-
90 Faya3
Fayalar
Thiés
bâtonnet
ta, jn
ms
9 0 ha4
Thiago
%-Louis
bâtonnet
tC, M
ms
90 Jicag
Thiago
St-Louis
bâtonnet
mjn
ms
9 0 Jica,
Thiago
St-Louis
bâtonnet
t c
9 0 Jicqw
Thiago
St-Louis
bâtonnet
Qc, jn)
(2
90 JiCag
Thiago
St-Louis
bâtonnet
tc, jn
ms
9oK4
Kiréne
Thiés
b$tomet
t c
ms
9 0 mur2
Mbour
Thi&
bâtonnet
trsjn
ms
9 0 Ndioll
Ndiol
St-Louis
bâtonnet
w.in
ms
9 2 Bal
Bambey
Diombel
bâtoxmet
trsjn
ms
9 2 Khela
Khelkom
Fatick
bâtonnet
t c
ms
9 2 Khelb
Khelkom
Fatick
titonnet
t c
ms
9 2 M o u 3
Mouré
Fatick
bâtonnet
t c
ms
9 2 M o u 4
Mouré
Fatick
bâtonnet
tc, jn
ms
9 2 Thialo
Thiago
St-Louis
bâtonnet
tc, jn
m s
*
Le premier chifie indique l’année de prélèvement 1990/1992. Les isolats Ba, ont été
prélevés à la station expérimentale de Bambey. L~es codes Jica,, /Thia, Faya, K, Mbour II
Ndiol,, Khe,, et Mou,, identifient les isolats provenant respectivement de Thiago, Fayalar,
JCirène, Ivfbour, Ndiol, Khelkom, et Mouré; n désignant le numéro de l’échantillon.
**
Les symptômes décrits sont le résultat de l’inoculation secondaire.
Jn = jaunissement des nervures; ms = mosaïque systémique; nn = nécrose des nervures;
ta = taches annulaires; tc = taches chlorotiques; tn = taches nécrotiques; - = rien observable
-136-
TABLEAU 2
Résultats des inoculations de 90 Ba 18 sur diverses plantes. Six plantes ont
été inoculées par espèce/cultivar.
Reaction observed on various plants qjier mechanichal inoculation by PCV
isolate 90 Ba 18. Observations based on six plants per species;cultivars.
Espèce
Réactions
Datura stramonium
Chenopodium amaranticolor
+, Ll
Glycine max cv IA-C8
Nicotiana benthamiana
f, s
Nicotiana clevelandii
Nicotiana tabacum Xanthi
Phaseolus vulgaris cv. Top Crop
Phaseolus vulgaris cv. Contendfer
Pisum sativum
V@a unguiculata cv. Black eye
V@a unguiculata cv. Cl 52
= pas de réaction; + = sensible; Ll = Esions locales; S =: développement systémique
DÉTECTION SÉROLOGIQUEI DES ISOLATS PAR DES ANTICORPS MONO-
CLONAUX (MCA)
Exceptés 90 Bam,, 90 Ndiol,, 92 Mou,, et 92 Thia,, tous les isolats ont été détectés
par un ou plusieurs MCA (tableau 3). L’antic~orps monoclonal 8.2 a réagi avec le
plus grand nombre d’isolats (19/25), par contre le MCA 44.1 n’a reconnu aucun des
isolats collectés au Sénégal. Le profil de réaction des isolats envers les huit anti-
corps monoclonaux a permis de les ctasser en différents groupes sérologiques
(Tableau 4). Au sérogroupe 1 appartiennent 5/‘7 des isolats prélevés sur arachide en
culture irriguée (Tableau 5). Des isolats app,artenant aux sérogroupes 2 et 4 de
Manohar n’ont pas été rencontrés. Le sérogroupe 6 comprend 6 isolats qui sont
détectés uniquement par l’anticorps monoclonal 8.2. Les sérogroupes 7 et 8 comp-
tent un et deux membres et sont reconnus respectivement par les MCA 70.2 et 8.2,
17.2, 64.1, 70.2 et 75.1. Parmi ces 6 sérogroupes recensés, trois sont nouveaux
d’après la classification de Manohar et al. 1993
-137-
TABLEAU 3
Réaction en DAS- et en InDAS-ELISA avec des anticorps polyclonaux et
monoclonaux de l’isolat K 80 du PCV, d’échantillons d’arachide 69-10 1
et de chénopode inoculés par divers isolats de virus collectés sur arachide
en 1990 et 1992 au Sthégal
Reaction of infected groundnut samples from Senegal with polyclonal and
monoclonal antibodies against PCVK 80 isolate in DAS - and InDAS-ELISA
Isolats*
Anticorps
polyclonal @AS-ELISA)
monoclonau~ (InDAS-ELISA)
anti-Kgo
8.2
17.2
44.1
60.2
64.1
66. I
70.2
75.1
---“---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------~
90 Bal
if
+++ -
90 Ba4b
t-b+
+++
+++ -
+ +
t++
+++
+++
fff
90 B%b
t++
+ +
i-if
-
t
-
tif
iff
90 Ba7
+ + +
++
-
90 Bag
t t t
fi
++t
-
+t
+t+
t
+++ ++
90 %4
+++
if
+++ -
+
iu
+i-
+++
”
!%lBal?b
-
-
_
90 Bals
+
+
_
_
_
tif
-
90 Bal9
+++
+++ ++
-
-
+++ -
t t t
+ + +
90 %oa
+++
+ + +
+++
-
fi
itt
+++
t t t
t t t
!Xl Faya3
t++
t u
+tt
-
++
+++ tu
t++
+ + +
90 Jica4
t-k+
+ + +
+++
-
u
+ + +
+++
+++ +
90 Jicag
tit
++t
tif
-
+t
ut
+t+
ii+
t
90 Jicag
t t t
t t t
4-i-t
-
u
ttt tt
t u
tti
90 Jicq
-Ht
ii+ ut
-
tt
ut
ii+
ttt ut
90 k.EI~
++t
t u
i-fi-
-
u
ttt
+t+
i-i+
f+t
9OK4
i-l-t
t-t+
Uf
-
++
tif
++t
+t+
tti
90Mbour2
+
+t+
-
+
-
t+
+
90 Ndioll -
92 J3a7
+ t t
fi+
ii+
-
++-t
itt
t+
fff
tif
92
Khqa -
++
-
_
_
-
-
-
-
92Khqb
-
++
-
92 Mou3
-
92 Mou4
-
+
-
92Thialo
-
88 Bas.type 0
+++
0
0
+t+
0
++t 0
0
88Mbour2
0
0
++t 0
0
0
+++ 0
0
87 Thy.TG.N. 0
+++ 0
-
0
+++
0
0
0
87 Thy.TGTA3 0
t t
0
0
0
0
tti-
0
0
86 K79
-
Ch. sain -
Ara.sain
-
PBS-T
-
* 88 Ba,, 88 Mbour,, 87 Thy.TG.N. et 87 Thy.TGTA3 sont des témoins positifs des divers
sérogroupes de PCV établis par Manohar (1993). 86 K,, est un représentant du sérogroupe 5.
+++, ++, + = mesures de Aa5 supérieures à 0,40 ou comprises respectivement entre 0,40-0,30
et 0,30-0,25. - = absence de réaction (Aao5 < 0,l et 0 = non testé.
-13%
TABLEAU 4
Classification de 24 isolats de PCV sur la base de leur réaction en InDAS-ELISA
avec 8 anticorps monoclonaux (d’après Manohar 1993).
Uuss~fkution of 24 PCL’isoIutesj~om S’enegal on base qf’their reaction in
InIlAS-EIZA with 8 monoclonal antihodies.
-
Groupe serologique
Isolait
Remarques
Sérogronpe 1
9 0 Ba4t,, 90 Bas, 90 Bz.,
Détectés par les anticorps
9 0 Ba7tra, 90 Faya?, 90 Jica4
monoclonaux 8.2, 17.2, 60.2, 64.1.
9 0 Jica+ 90 Jica6. 90 Jica7
66.1. 70.2, et 75.1
9 0 Jicax. 90 K4 92
et
&-
scrogroupe 3
90 Mboq
Détectés par les anticorps
monoclonaw 17.2, 60.2. 66.1 et
-
70.2
Sérogroupe 5
90 Ba , ,n, 92 Mou?, 92 Thia, 0
Non détectés par aucun anticorps
monoclonal
Sérogroupe 6
90 Bat, 90 Ndiolt, 92 Khet,
Déleclés par l’anticorps
92 K.he et 92
t n
MOU~
monoclonaJ 8.2
Serogroupe 7
90 Ba7
Détecte par l’anticorps monoclonat
70.2
Sérogroupe 8
90 E&+, et 90 Bat 9 -
Détectés par les anticorps
monoclonaux 8.2 17.2, 64.1,70.2
COMPARAISON SÉROLOGIQUE DES ISOLATS EN DAS- ET EN INDAS-
ELISA
En InDAS-ELISA avec le MCA 60.2, les me:sures de la densité optique à 405 nm
ont donné des valeurs faibles, exceptés 92 Ba, et 88 Ba, type 2 , (tableau 3). Les
réactions ont été accompagnées de bruits de fonds importants. Dix huit isolats ont
réagi en DAS-ELISA, alors que l’ensemble des MCA ont détecté 20 isolats. En
DAS-ELISA, les isolats 90 Ndiol,, 92 Khe,,, 92 Khe,,, et 92 Mou, n’ont pas réagi.
Par contre tous ces isolats sauf 90 Ndiol 1, s’ont faiblement détectés par l’anticorps
monoclonal 8.2. L’isolat 90 Ba 18 a été détecté faiblement en DAS-ELISA et en
InDAS-ELISA avec l’anticorps monoclonal 8.2 et fortement avec l’anticorps mono-
clonal 64.1. 90 Bai%, 92 Mou,, et 92 Thia,,) n’ont pas été détectés dans les différents
tests ELISA.
Discussion
L’étude symptomatologique riialisée sur les échantillons prélevés en champ montre
une grande variabilité des symptômes. Cette diversité ne saurait s’expliquer unique-
ment par l’intensité variable des symptômes due à une contamination plus ou moins
tardive de l’arachide par différents isolats du virus. Il ne serait pas exclu que certai-
nes infections soient induites par un mélange de variants du PCV.
Le test de transmission par inoculation mécanique des isolats 90 Bai et 90 Bazoa à
des plantules de Chenopodium amaranticodur a donné de manière constante des
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résultats négatifs. L’observation au microscope électronique a révélé des particules
virales typiques du clump chez ces isolats qui ont, par ailleurs bien réagi en DAS- et
en InDAS-ELISA avec l’anticorps monoclonal 8.2. Un autre prélèvement qui se
transmet difficilement ou pas par inoculation mécanique sur Chenopodium amaran-
ticolor est 90 Jicq. Sur 4 essais de transmission utilisant 6 plantes par essai, (3
plantes en serre et 3 autres plantes en cellule climatique) une seule tache chlorotique
a été obtenue. L’inoculation secondaire de cette tache à des chénopodes reproduit
facilement les symptômes de PCV. Les isolats 90 Ba,, 90 Baloa et 90 Jica,, transfé-
rables sur arachide par greffe semblent perdre ou ne pas posséder la propriété d’être
transmis mécaniquement sur Chenopodium amaranticolor. L’existence de tels
isolats en conditions naturelles compliquerait d’avantage le suivi épidérniologique
du PCV et la sélection de matériel résistant, car elle éliminerait un outil important de
détection du virus qu’est l’indexage biologique (THOUVENEL et al., 1976).
TABLEAU 5
Variabilité symptomatoiogique et sérologique et incidence des isolats de PCV
collectés dans la vallée du Fleuve Sénégal
Variation in symptoms, incidence and serological properties among PCV
isolates collected in Senegal River valley
Isolat
Symptôme sur arachide
sérogrollpe
Incidence
90 Jica4
Pied touffu et rabougri, avec des feuilles
1
Quelques pieds isolés
petites
(Clump typique)
90 Jicas
Marbrure sur jeunes feuilles, Pas d’arabesque
Quelques pieds isolés
90 Jiq
Taches annulaires et arabesques sur jeunes
Plusieurs blocs de 6 lignes avec
feuilles
environ 70 % des plantes
atteintes
90 Jica7
Mosaïque avec taches annulaires
pie& isolés
90 Jicag
Nanisme et arabesques
pieds isolés
92 Thialo
Arabesques et taches ocellées
pieds isolés
* Les échantillons Jica, et Thia,,, identifient les isolats de virns provenant du périmètre irrigué de
Thiago.
La différence de comportement au niveau du pouvoir pathogène, entre d’une part les
isolats 90 Ba,, 90 Ba,,, et 90 Jica, et les isolats type du PCV d’autre part, devrait
être mise en relation avec la structure génique du PCV. Une telle étude aiderait à
mieux cerner la variabilité génétique du PCV et à mettre en évidence les gènes liés à
la virulence et au mode de transmission.
La plupart des isolats collectés au niveau du fleuve Sénégal semblent provenir de
semences infectées, puisque constitués de pieds isolés présentant des symptômes.
L’isolat 90 Jica, et les isolats de Bambey proviennent par contre de parcelles où
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environ 70 % des plantes présentaient des symptômes de maladie. Une étude est
initiée en collaboration avec l’unité de phytopathologie de l’université Catholique de
Louvain, afin de mettre en évidence l’existence de PoZyniyxn graminis (THOUVE-
NBL & FAIJQUET, 1981; RATNA et al., 199 1) dans ces sols et de déterminer son
rôle dans la transmission des différentes souche:s du PCV.
Les réactions sérologiques des différents isolats ont été étudiées par trois variantes
du test ELISA. Dans l’ensemble le profil des réactions était similaire dans Ies trois
méthodes. Les isolats qui n’ont réagi qu’avec l’anticorps monoclonal8.2 n’ont pas été
détectes en DAC- et en DAS-ELISA avec l’anticorps polyclonal. Ces résultats sont
en adéquation avec les études de AL MOUDALLAL et al., (1984) et de HUGUE-
NOT et a/., (1989). Ces auteurs ont montré que le MCA 8.2 reconnaît un épitope
conformationnel qui est détruit en DAS-ELISA par l’absorption de l’antigène par
l’anticorps.
La variante DAC-ELISA s’est avérée très utile pour le suivi épidémiologique des
maladies virales causées par le Tomato spotted wilt virus (TSWV), le Peanut mottle
virus (PMV) et le lndian peanut clump virus (IPCV) et d’autres virus (HOBBS et
al., 1987 et NDIAYE et al., 1993). Cependant dans les conditions de notre étude,
cette méthode a identifié moins d’isolats de PCV que les autres méthodes. Par
ailleurs des réactions non spécifiques, renda.nt peu fiables les résultats, ont été
enregistrées (résultats non présentés).
Les méthodes sérologiques utilisant l’anticorps polyclonal et les anticorps monoclo-
naux de l’isolat du PCV K,,) ne permettent pas un diagnostic fiable de la maladie du
rabougrissement de I’arachide, puisque au moins un cinquième des isolats n’a pas
été clairement identifié. Ces résultats confirment ceux déjà rapportes par HI.JGI.JE-
NOT et al., (1989) et par MANOHAR et al., (1994). Des anticorps monoclonaux
polyspécifiques devront être testés pour la détection et l’identification sérologiques
de ce vii-ns.
Les tests d’inoculation mécanique sur gamme d’hôte ainsi que les analyses sérologi-
ques n’ont pas mis en évidence une relation entre les zones géographiques et la
distribution des différents groupes sérologiqules du PCV. Cependant, ils indiquent
qu’au Sénégal il existe divers isolats du PCV et qu’ils sont compliques à analyser.
Remerciements
Une vive reconnaissance est due à I’ISRA et au CIRAD pour l’aide consentie à la réalisation de
cette étude et au Pr. H. MARAITE qui a accepté de réviser ce document.
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Summary
PEANUT CLUMP VIRUS (PCV): SEROLOGICAL AND
SYMPTOMATOLOGICAL CHARACTERISATION
OF
NEW ISOLATES FROM SIENEGAL.
Surveys of peanut viral diseases in Senegal during the rainy seasons of I990 and 1992 showed a
wide distribution of peanut clump virus. The virus was even identified on fields in the Senegal
River and Fatick Regions, where peanut was grown for the very first time. The distribution and
symptoms of infected plants differed according to the areas. Twenty six PCV isolates maintained
by graRs on healthy peanut plants were characterised by induced symptoms on diverse hosts, type
of viral particles, and DAS-, DAC-, or InDAS-ELISA with one polyclonal and 8 monoclonal
antibodies anti-PCV. Six serological groups including three new ones were defined. No relation-
ship was found between different serological groups, mechanical transmission properties, induced
symptoms and geographical origin of the isolates. Al1 serological groups are present in the area
around Bambey.
Références bibliographiques
ADAMS, M.J.& SWABY, A.G. 1988. Factors affecting tbe production a.nd motility
of Polymyxa graminis and their transmission of barley yellow mosak virus
(BaYMV). Ann. appl. Biol. 112:69-78.
rv, MOUDALLAL, Z., ALTSCI-IUH, D., BRIAND, J. P. & VAN REGENMORT-
EL, M.H.V.1984. Comparative sensitivity of different ELISA procedures for
detecting monoclonal antibodies. J. Immunological methods 68:35-43.
CLARK, M.F. & ADAMS, A.N. 1977. Characteristics of the microplate method of
enzyme linked immtmosorbent assay for the detection of plant virus. J. Gen.
Virol. 34:475-483.
CONVERSE, R.H. & MARTIN, R.R. 1990. ELISA methods for plant viruses. In:
Seroiogical Methods for Detection and IdentiJication of Viral and Bacterial
Plant Pathogens: A Laboratory Manual. K. Hampton, E. Hall, & S. De Boer,
eds. American phytopathological Society, St. Paul, Mn:179-f96
DOLLET, M., DUBERN, J., WALIYAR, F. & MANOHAR, S.K. 1993. Distribu-
tion of peanut clump virus (PCV), a virus with high symptom variability. Pro-
ceedings of the international working group ofplant viruses with fungai vector,
Jul,v 2.5-27, 1993 Canada ed. C. Hiruki:147-152
HAMPTON, R.O., ALBRECHTSEN, S.E. & MATHUR, J.B. 1990. Seed health
(viruses) of Vigna ungiculata cultivars/selections t?om developing countries. Seed
Sci. Technol. 20123-38.
HOBBS, H.A., REDDY, D.V.R., RAJESHWARI, R. & REDDY, A.S. 1987. Use
of direct antigen coating and protein A coating ELISA procedures for detection of
three peanut viruses. Plant Diseuse 71:747-749.
HUGUENOT, C., GIVORD, L., SOMMERMEYER, G. & VAN REGENMOR-
TEL, M.H.V. 1989. Differentiation of peanut clump virus serotypes by
monoclonal antibodies. Research in Virology 1410: 87- 102.
-142-
KONATE, G. & BARRO, N. 1993. Dissemination and detection of peanut clump
virus in groundnut seed. Ann. Appt. Biol. 123:623-627
MANOHAR, S.K., DOLLET, M., DUBERN, J. & GARG ANI, D. 1994. Studies on
variability of peanut clump virus: symptomatology and serology. .1. Phytopatho-
logy 143:233-238
MARAITE, H., GOFFART, J.P., & BASTIN, V. 198X. Development of quantita-
tive method for assessment of Polymyxa grominis Led. inoculum potential in soil.
In: Integrated Trop Protection in Cereals (Eds R. Carvalloro and K.D. Suther-
land). A.A. Balkema.: Rotterdam:259-266.
NDIAYE, M., BASHIR, M., KELLER, K.E. & HAMPTON, R.O. 1993. Cowpea
viruses in Senegal, West At%ca; Identifica@ion, distribution, seed transmission,
and sources of genetic resistance. Plant Diseuse 77: 999- 1003.
RATNA, A.S., RAO, A.S., NOLT, B.L., REDDY, D.V.R., VIJAYALAKSHMI,
M., & McDONALD, 0. 199 1. Studies on transmission of Indian peanut clump
virus disease by Polymyxa graminis. Ami. Appl. Biol. 118:71-78.
REDDY, D.V.R., NOLT, B.L., HOBBS, HA., REDDY, A.S. RAJESHWARI, R.,
RAO, A.S., REDDY, D.D.R. & McDONALD, D. 1988. Clump virus in India:
isolates, host range, transmission and management. In: Development in Applied
Biology 2: Viruses with Fungal Vectors. Eds J. 1. Cooper & M.J.C. Asher. Asso-
ciation of Applied biologist, Wellesbourne, U. K.:239-246.
THOUVENEL, J.C., DOLLE’T, M. & FAUQUET, C. 1976. Some properties of
peanut clump, a newly discovered virus. Armais ofAppIied biology 8413 1 l-320.
THOUVENEL, J.C. & FAUQUET, C. 1981. Further properties of peanut clump
virus and studies on its natural transmission. Ann. Appl. Biol. 97:99-107.
Juin, 1996